来源：Integrated surface display and atp regeneration for efficient butyrolactam biosynthesis in Escherichia coli（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
丁内酰胺是合成聚酰胺4的关键前体，也是多种生理活性物质的重要中间体。本研究将冰核蛋白介导的表面展示技术与多聚磷酸盐激酶2的ATP再生系统整合于大肠杆菌中，通过共展示策略将丁内酰胺产量提升46.4%，并利用补料分批发酵实现39.13 g/L的最终产量和94.7%的转化率。该策略有效规避了底物跨膜运输屏障与辅因子成本两大瓶颈，为工业级丁内酰胺生物合成提供了新路径。
研究背景
聚酰胺4是唯一可生物降解的生物基尼龙，其前体丁内酰胺被美国能源部列为生物质来源的高附加值化学品之一。全球丁内酰胺市场预计到2027年将增长至5.327亿美元。传统化学合成路线依赖石油资源、反应条件苛刻且污染严重。生物合成路线因条件温和、转化率高而备受关注，但全细胞合成中底物跨膜运输屏障和昂贵辅因子ATP的依赖制约了其规模化应用。本研究提出整合冰核蛋白表面展示与ATP再生的全细胞催化策略，试图同时破解上述两大瓶颈。
研究方法
2.1 化学试剂与材料
大肠杆菌BL21(DE3)和E. coli TOP10菌株购自上海生工生物。卡那霉素购自Generay（上海）。γ-氨基丁酸（GABA）和丁内酰胺购自阿拉丁生化科技有限公司。异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）购自上海世泽生物科技有限公司。其他常用试剂均购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。
【数据】菌株：E. coli BL21(DE3)、E. coli TOP10；抗生素：卡那霉素；诱导剂：IPTG；试剂来源：生工、Generay、阿拉丁、世泽、国药
2.2 质粒与菌株构建
本研究所用引物列于表S1，质粒与菌株列于表S2。DNA片段的聚合酶链式反应（PCR）扩增使用PrimeSTAR Mix进行。载体与插入片段通过ACE同源重组酶或T4连接酶连接。本研究构建了pET28a-ACT、pET28a-INP-ACT、pET28a-PPK2和pET28a-INP-PPK2。以pET28a-INP-ACT为例说明构建过程：inp基因以引物INQ171-F和INQ171-R从假单胞菌（Pseudomonas syringae）基因组DNA扩增获得；pET28a以引物28a-F和28a-R线性化扩增；ACT基因以引物act-R和act-F从质粒pET28a-ACT扩增获得。三个片段通过无缝克隆试剂盒进行同源重组装配。转化及克隆PCR后，阳性克隆经测序验证。
【数据】PCR酶：PrimeSTAR Mix；连接酶：ACE同源重组酶或T4连接酶；模板：P. syringae基因组DNA、pET28a-ACT；验证方式：克隆PCR+测序
2.3 融合蛋白的表达
重组质粒通过热激法转化至E. coli BL21(DE3)，获得表达菌株E. coli BL21(DE3) ACT、E. coli BL21(DE3) INQ-ACT、E. coli BL21(DE3) INQ-PPK2和E. coli BL21(DE3) PPK2。表达菌株接种于含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37°C、220 rpm振荡培养。当OD600达到0.6–0.8时，加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.2 mmol/L，于16°C诱导蛋白表达18–20 h。诱导后的细胞在4°C、9730 × g条件下离心10 min收集，细胞沉淀用50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）洗涤两次。超声破碎条件为：功率280 W，工作2 s、间歇2 s。裂解液于4°C、12,000 rpm离心10 min，分别收集上清与沉淀组分。样品与5 × SDS上样缓冲液（含β-巯基乙醇）混合，煮沸10 min，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测重组蛋白表达。
【数据】培养基：LB+50 μg/mL卡那霉素；培养温度：37°C；转速：220 rpm；诱导OD600：0.6–0.8；IPTG终浓度：0.2 mmol/L；诱导温度：16°C；诱导时间：18–20 h；离心：4°C、9730 × g、10 min；超声功率：280 W；工作/间歇：2 s/2 s；SDS-PAGE浓度：10%
2.4 细胞膜组分的分离
含展示质粒的细胞培养24 h后，9730 × g离心2 min收集菌体，用50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）洗涤三次，重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）。细胞悬液在冰上进行超声处理。为去除未破碎细胞及碎片，全细胞裂解液于5000 × g离心5 min。为获得总膜组分，上清于20,000 × g、4°C离心1 h沉淀。上清视为可溶性胞质组分，沉淀视为细胞膜组分。
【数据】培养时间：24 h；离心：9730 × g、2 min；洗涤：50 mM Tris-HCl（pH 7.0）×3；去碎片离心：5000 × g、5 min；膜分离离心：20,000 × g、4°C、1 h
2.5 全细胞催化合成丁内酰胺
反应混合物含不同浓度的GABA（5–25 mM）、2 mM ATP、polyP（0–4 mM）、Mg²⁺（2–8 mM）及20 g/L大肠杆菌细胞悬液。混合物调节至不同pH值（5.0–9.0），在不同温度（15、20、25、30和35°C）下、220 rpm振荡反应6 h。反应结束后，混合物加热10 min终止反应，离心收集上清用于HPLC样品制备。
【数据】GABA浓度：5–25 mM；ATP：2 mM；polyP：0–4 mM；Mg²⁺：2–8 mM；菌体浓度：20 g/L；pH：5.0–9.0；温度：15/20/25/30/35°C；转速：220 rpm；时间：6 h；终止：加热10 min
2.6 HPLC检测与分析
丁内酰胺滴度通过高效液相色谱（HPLC）测定。分析使用反相柱（Agilent Zorbax SB-C18，4.6 × 250 mm，5 µm），柱温40°C。检测波长为210 nm紫外吸收。流动相为甲醇-乙腈混合物（1:1，A相）与水（B相）按1:9比例混合，流速0.6 mL/min，进样量10 μL。
【数据】色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6 × 250 mm，5 µm）；柱温：40°C；检测波长：210 nm；流动相：甲醇:乙腈=1:1与水=1:9；流速：0.6 mL/min；进样量：10 μL
研究结果
3.1 重组菌株的性能评估
冰核蛋白（INP）是来源于丁香假单胞菌的外膜锚定蛋白，是大肠杆菌中最广泛使用的表面展示工具之一。INP为外膜蛋白，其基本结构包含三个结构域：N端结构域、中央重复结构域（CRD）和C端结构域。N端结构域约占整个结构的15%，具有疏水性，将INP锚定于外膜。因此，本研究为在不影响INP膜锚定及ACT和PPK2酶活性的前提下将二者展示于大肠杆菌细胞表面，将INP蛋白融合至ACT和PPK2的N端（图1）。
重组质粒pET28a-ACT、pET28a-INP-ACT、pET28a-PPK2和pET28a-INP-PPK2构建完成后，为评估蛋白表达情况，对不同重组质粒转化的大肠杆菌裂解液进行SDS-PAGE分析。泳道2–3显示pET28a-ACT/E. coli BL21(DE3)菌株表达了约43 kDa的蛋白。泳道5–6显示pET28a-INP-ACT/E. coli BL21(DE3)菌株表达了约62 kDa的蛋白。pET28a-PPK2/E. coli BL21(DE3)菌株表达了约35 kDa的蛋白，而pET28a-INP-PPK2/E. coli BL21(DE3)菌株表达了约56 kDa的蛋白。这些结果表明两种表面展示重组菌株均成功构建并表达（图S1）。
为验证INP-ACT和INP-PPK2蛋白成功锚定于细胞膜，提取了重组菌株的膜蛋白组分。SDS-PAGE分析显示，膜蛋白组分中存在与INP-ACT和INP-PPK2预期大小一致的条带，证明INP蛋白成功将ACT和PPK2锚定于细胞膜上，实现了ACT和PPK2在细胞膜上的共展示（图S2）。
为评估表面展示技术引入对丁内酰胺合成的影响，比较了展示ACT的重组菌株与胞内表达ACT菌株的丁内酰胺产量。对照组（E. coli和pET28a/E. coli）中检测到痕量丁内酰胺，这可能归因于E. coli BL21(DE3)内源CaiC酶能够催化丁内酰胺形成。INP-ACT菌株的丁内酰胺产率达70.71%，而胞内表达ACT的菌株为47.62%。ACT展示系统相比胞内ACT系统实现了23.09%的丁内酰胺产率提升（图2）。
对于胞内表达ACT的菌株，GABA必须先跨过细胞膜才能与ACT相互作用并转化为丁内酰胺，随后产物再输出至胞外。相比之下，在细胞表面展示ACT的菌株中，GABA可直接接触外膜上的ACT，使向丁内酰胺的转化在胞外培养基中进行（图3）。因此，表面展示的ACT在将GABA转化为丁内酰胺方面表现出更高的效率，从而提高了产物的产率。
【数据】INP-ACT菌株丁内酰胺产率：70.71%；胞内ACT菌株产率：47.62%；产率提升：23.09%；蛋白分子量：ACT约43 kDa、INP-ACT约62 kDa、PPK2约35 kDa、INP-PPK2约56 kDa
3.2 ACT展示菌株丁内酰胺生物合成条件的优化
在生物转化中，反应条件对目标产物的合成至关重要。本研究考察了丁内酰胺合成的最适条件。丁内酰胺的合成受底物浓度影响（图4A）。当底物浓度低于15 mM时，反应速率与底物浓度成正比，目标产物产率保持在约90%。进一步提高底物浓度导致产率下降，这可能归因于底物或产物抑制。因此，后续转化反应中底物浓度设定为15 mM。
pH和温度在丁内酰胺合成中起关键作用。INP-ACT生产丁内酰胺的最适pH为7.0（图4B）。酸性或碱性条件下丁内酰胺产量的下降可能归因于参与底物结合和催化的氨基酸残基电离状态改变，从而影响ACT的催化活性。此外，中性pH可能有利于维持全细胞催化体系中酶活性和细胞完整性。
丁内酰胺产量随温度升高逐渐增加，至25°C时产量最高（图4C）。温度升高通常会加速酶促反应；然而过高温度可能对ACT的结构稳定性、锚定蛋白复合物或静息细胞产生不利影响，导致催化性能下降。进一步提高反应温度导致丁内酰胺产量逐渐下降，可能是由于静息细胞的温度稳定性不足。
如图4D所示，随Mg²⁺浓度增加，静息细胞合成丁内酰胺的催化活性先升高后降低，在Mg²⁺浓度为4 mM时达到最大丁内酰胺滴度1.18 g/L。综合以上结果，最适条件为：底物（GABA）浓度15 mM、pH 7.0、Mg²⁺浓度4 mM、温度25°C。
【数据】最适底物浓度：15 mM；最适pH：7.0；最适温度：25°C；最适Mg²⁺浓度：4 mM；最大丁内酰胺滴度：1.18 g/L；底物浓度<15 mM时产率约90%
3.3 ATP再生对丁内酰胺合成的影响
丁内酰胺的合成需要添加ATP，而ATP补充的高成本不可避免地增加了总体生产成本。利用PPK2以低成本的AMP或ADP和polyP为底物进行ATP再生，是解决该问题的有效策略，已应用于多种产品的制备。Sheng等人引入来源于表皮葡萄球菌的PPK2，在肌酸及其甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的生物合成中实现ATP循环。Li等人解决了3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸酯（PAPS）合成中高ATP需求的问题，将PAPS转化效率从48.2%提高至85.9%。本研究引入了一条ATP再生途径（图5），并探讨了ATP再生对丁内酰胺合成的影响。
图6显示了表达ACT和PPK2的细胞在添加和不添加polyP条件下的丁内酰胺合成情况。有趣的是，ATP再生系统表现出比对照组更高的产率，且这一优势随反应进程持续扩大。这一现象可能归因于PPK2利用polyP从ADP再生ATP的能力，从而持续维持反应系统中的ATP供应，促进GABA活化和丁内酰胺形成。5 h后，ATP再生系统的丁内酰胺产率达到83%，较未添加polyP的对照组提高了25%。
【数据】ATP再生系统5 h丁内酰胺产率：83%；较对照组提升：25%；转化效率对比：PAPS从48.2%提高至85.9%（引自文献）
3.4 ATP再生耦合丁内酰胺合成效率的优化
多酶级联催化系统具有反应速率快、选择性高、微生物污染少和产物产量高等优势。然而，不同酶通常表现出不同的最适反应条件。确定合适的多酶反应参数，包括pH和离子浓度，至关重要。如图7所示，INP-ACT与PPK2耦合催化合成丁内酰胺的最适条件为pH 7.0、Mg²⁺浓度4 mM、polyP浓度2 mM。最适pH和Mg²⁺浓度与INP-ACT单独催化的条件相同。在ATP再生过程中，polyP被持续消耗。polyP补充不足可能无法满足ATP再生的需求……
【数据】耦合催化最适pH：7.0；最适Mg²⁺浓度：4 mM；最适polyP浓度：2 mM
3.5 ACT与PPK2共展示菌株的丁内酰胺合成
进一步研究中，构建了ACT与PPK2共展示菌株并考察其丁内酰胺合成能力。与仅展示ACT的菌株相比，共展示ACT和PPK2使丁内酰胺生产率进一步提高了46.4%。采用补料分批发酵策略，共展示ACT和PPK2的菌株最终实现了39.13 g/L的丁内酰胺滴度和94.7%的产率（图8）。
【数据】共展示较仅展示ACT产率提升：46.4%；最终丁内酰胺滴度：39.13 g/L；产率：94.7%
讨论与解读
丁内酰胺的高效可持续生物合成一直是合成生物学与代谢工程领域的研究热点。自Chae等人和Zhang等人分别利用ACT和ORF26开创丁内酰胺生物合成方法以来，后续研究致力于新酶发掘、现有酶功能改造及代谢途径优化。例如，利用Msed在3-L生物反应器中经84 h发酵获得45.2 g/L丁内酰胺，碳产率为0.34 g/g葡萄糖；利用温度控制的CRISPRa/CRISPRi基因回路动态调控α-酮戊二酸代谢，在补料分批培养中获得59.87 g/L丁内酰胺，进一步刷新产量纪录。尽管这些研究显著提高了丁内酰胺产量，但两个核心瓶颈依然存在：其一，丁内酰胺合成高度依赖ATP，而胞内ATP再生系统效率有限，常需添加外源昂贵ATP；其二，在传统发酵或胞内全细胞催化系统中，底物分子必须穿越细胞膜到达胞质内的催化酶，这种跨膜运输常受膜通透性限制。
本研究从两个维度同时回应上述瓶颈——将INP表面展示技术引入丁内酰胺合成，使底物无需跨膜即可被催化，产率较胞内表达系统提升23.09%；引入PPK2介导的ATP再生系统，以polyP为磷酸供体实现ATP循环利用，产率在此基础上再提升25%。两种策略的叠加效应显著——共展示菌株较仅展示ACT的菌株生产率提升46.4%，最终补料分批发酵实现39.13 g/L丁内酰胺和94.7%产率。值得注意的是，表面展示策略的核心价值不仅在于消除跨膜屏障，还在于简化产物分离——产物在胞外生成，减少了胞内积累的潜在毒性。
编译者解读：该研究将两种成熟的合成生物学工具——INP表面展示与PPK2 ATP再生——进行了巧妙整合，体现了"模块化组装"的系统思维。选择INP而非其他锚定蛋白，在于其N端结构域能稳定锚定外膜且不干扰融合伴侣的折叠。从应用角度看，94.7%的转化率已接近理论极限，说明该策略的催化效率相当可观。但需注意，39.13 g/L的滴度仍低于CRISPRa/CRISPRi动态调控系统的59.87 g/L纪录——表面展示系统在消除传质障碍的同时，也牺牲了胞内高密度催化所具备的空间优势。未来若能将表面展示与动态调控结合，或可同时获得高转化率与高滴度。该策略对依赖辅因子且存在底物运输瓶颈的其他产品合成具有借鉴价值。
参考来源
Cui X. Integrated surface display and atp regeneration for efficient butyrolactam biosynthesis in Escherichia coli. Biochemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.bej.2026.110302
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110302