来源：Directed biosynthesis of the designer peptidyl nucleoside antibiotics featuring a simplified azetidine-containing moiety（Synthetic and Systems Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
多氧霉素（POL）是一类靶向真菌细胞壁几丁质合成的核苷类抗生素，但天然产物的化学多样性和治疗潜力尚未充分挖掘。本研究基于几丁质合成酶CaChs2与POL-D复合物晶体结构，理性设计了含简化氮杂环丁烷结构的一系列POL类似物，并通过突变合成（mutasynthesis）与组合生物合成策略，以工业POL生产菌株为细胞工厂实现了6种设计化合物的定向生物合成。其中三种含L-A2CA结构的类似物对白色念珠菌和卵菌植物病原体大豆疫霉表现出增强的抑制活性。
研究背景
真菌及类真菌病原体感染对全球"同一健康"（One Health）构成日益严重的威胁，加速开发新型抗真菌药物迫在眉睫。多氧霉素是一组结构相关的核苷抗生素，作为环境友好型杀菌剂靶向真菌细胞壁生物合成。然而，该类抗生素的化学多样性与治疗潜力长期未获充分挖掘。
几丁质合成酶CaChs2与POL-D的复合物结构（PDB: 7STO）此前已获解析，为理解几丁质合成酶与POL的分子相互作用提供了关键信息。产生菌S. aureochromogenes主要产生POL-B（缺乏POIA结构）、POL-A（含POIA及5-羟甲基尿嘧啶核苷骨架）和POL-H（含POIA及5-甲基尿嘧啶核苷骨架）。已有研究表明，尽管POL-B与POL-A结构高度相似，但POL-B对白色念珠菌的抑制活性优于POL-A，提示POIA结构的存在与否对生物活性有重要影响。本研究旨在通过结构分析与理性设计，探索以简化氮杂环丁烷结构替代POIA的可行性，并借助合成生物学手段实现设计类似物的定向生产。
研究方法
4.1 酶、化学品与试剂
本研究所用所有限制性内切酶、DNA连接酶和聚合酶均购自New England Biolabs。化学品和试剂购自Sigma-Aldrich、Thermo Scientific、OMEGA或J&K Scientific。
【数据】酶来源：New England Biolabs；试剂来源：Sigma-Aldrich、Thermo Scientific、OMEGA、J&K Scientific
4.2 菌株与培养条件
大肠杆菌菌株在Luria-Bertani（LB）培养基（酵母提取物5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L）中于37°C培养。链霉菌菌株在甘露醇-大豆（MS）琼脂平板（大豆粉20.0 g/L，甘露醇20.0 g/L，琼脂20.0 g/L，pH 7.0）上于30°C培养。指示菌株Trichosporon cutaneum和Candida albicans在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（马铃薯200.0 g/L，蔗糖20.0 g/L，琼脂10.0 g/L，pH 7.0）中于30°C培养；Alternaria alternata、Phytophthora sojae、Rhizoctonia solani和Magnaporthe grisea在酵母提取物-麦芽提取物（YEME）培养基（酵母提取物3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，麦芽糖浆3.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，蔗糖340.0 g/L）中于30°C培养。本研究所用菌株和质粒见补充表S1，引物见补充表S2。
【数据】LB培养基：酵母提取物5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L；MS培养基：大豆粉20.0 g/L、甘露醇20.0 g/L、琼脂20.0 g/L、pH 7.0；PDA培养基：马铃薯200.0 g/L、蔗糖20.0 g/L、琼脂10.0 g/L、pH 7.0；YEME培养基：酵母提取物3.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、麦芽糖浆3.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、蔗糖340.0 g/L；温度：37°C（E. coli）/30°C（Streptomyces及指示菌）
4.3 S. aureochromogenes相关突变株的构建
构建S. aureochromogenes相关突变株采用与前述相似的策略。以CXR3为例，使用polF-LF/R和polF-RF/R为引物，pOJ446为起始载体。构建菌株时，敲除载体pJTU4723基于Chen等人前述方法构建，通过接合转移导入S. aureochromogenes。随后替换tsr基因以构建框内缺失菌株CXR3，并通过测序分析进一步确认。
【数据】引物：polF-LF/R、polF-RF/R；载体：pOJ446（起始）、pJTU4723（敲除）；验证方法：测序分析
4.4 CXR3::pIB139/azeJ及相关菌株的构建
将密码子优化的azeJ基因克隆至pIB139的NdeI-EcoRI位点（由启动子ermE驱动），质粒pIB139/azeJ经测序分析确认。构建pIB139/azeJ&vioG时，将vioG基因（含启动子ermE）克隆至pIB139/azeJ的EcoRI位点，质粒pIB139/azeJ&vioG经测序分析确认。随后将质粒pIB139、pIB139/azeJ和pIB139/azeJ&vioG分别转化至E. coli ET12567/pUZ8002，用于后续接合转移至CXR3及相关菌株。
【数据】克隆位点：NdeI-EcoRI（azeJ）、EcoRI（vioG）；启动子：ermE*；宿主菌：E. coli ET12567/pUZ8002
4.5 相关菌株的代谢产物分析
代谢产物分析时，将S. aureochromogenes、CXR3、CXR6、CPO1、CPO2及相关菌株接种于5 mL Tryptic-Soy-Broth（TSB）培养基（胰蛋白胨大豆肉汤30.0 g/L，pH 7.0），于30°C培养24小时。随后将种子培养物（2%，V/V）转接至70 mL发酵培养基（大豆粉20.0 g/L，玉米粉15.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，酵母提取物4.0 g/L，CaCO3 3.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，NaCl 1.0 g/L），于30°C发酵3天。发酵液加入草酸调节至pH 3.0，经Dowex 50W×8(H+)纯化，浓缩后用0.22 μm微孔滤膜过滤，供HPLC或LC-HRMS分析。
HPLC分析使用Shimadzu LC-20AT系统，配备C18色谱柱（Inertsil ODS-3, 5 μm, 4.6 × 250 mm），洗脱梯度为10%–45%溶剂B（水-乙腈=6:4，含10 mM 1-己烷磺酸钠和0.2%乙酸）：溶剂A（含10 mM 1-庚烷磺酸钠和0.2%乙酸），梯度运行30分钟，保持至50分钟。随后在51分钟时将溶剂B降至10%，再保持30分钟。检测波长260 nm，流速0.5 mL/min，使用DAD检测器。
LC-HRMS分析在Thermo Fisher Scientific ESI-LTQ Orbitrap仪器上进行，由Xcalibur软件控制，正离子模式采集。HRMS分析参数：毛细管温度275°C，毛细管电压35 V，误差10 ppm。洗脱梯度为5%溶剂B（甲醇）保持5分钟，流速0.3 mL/min；随后5%–50%溶剂B：溶剂A（0.1%甲酸水溶液）梯度运行10分钟，保持至25分钟；35分钟时将溶剂B降至5%，再保持5分钟。
【数据】TSB培养基：胰蛋白胨大豆肉汤30.0 g/L、pH 7.0；种子培养：5 mL、30°C、24h；发酵培养基：大豆粉20.0 g/L、玉米粉15.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、酵母提取物4.0 g/L、CaCO3 3.0 g/L、KH2PO4 1.0 g/L、NaCl 1.0 g/L；发酵条件：70 mL、30°C、3d；酸化pH：3.0（草酸）；过滤膜：0.22 μm；HPLC柱：C18 Inertsil ODS-3（5 μm，4.6×250 mm）；HPLC梯度：10%–45%溶剂B/30min，保持至50min，51min降至10%，保持30min；检测波长：260nm；流速：0.5 mL/min；LC-HRMS：正离子模式、毛细管温度275°C、毛细管电压35V、误差10ppm；LC梯度：5%溶剂B保持5min（0.3 mL/min），5%–50%梯度10min，保持至25min，35min降至5%，保持5min
4.6 化合物纯化与产量测定
目标产物纯化时，取1 L发酵液按上述方法处理，使用Shimadzu LC-20AT系统配备Zorba SB-C18色谱柱（Agilent, 5 μm, 9.4 × 250 mm），15% B相（A相：0.2% TFA水溶液；B相：甲醇）线性梯度洗脱30分钟，流速3 mL/min，ADA检测器260 nm监测。随后经C18色谱柱（Inertsil ODS-3, 5 μm, 4.6 × 250 mm）进一步纯化，5% B相（A相：0.2%三氟乙酸水溶液；B相：甲醇）梯度洗脱25分钟，流速0.5 mL/min。
目标化合物（POL-B、POL-J、POL-L、POL-A、POL-H、POL-K、POL-AX、POL-HX、POL-KX、POL-IX、thymine POL-IX和uracil POL-IX）的产量测定采用标准曲线法，标准品浓度范围为50至2000 μg/mL。每个重组菌株在相同条件下进行三次重复发酵。产量通过将发酵样品中相应化合物的峰面积对照各自标准曲线插值计算。所有测量均通过HPLC在260 nm检测波长下完成。
【数据】制备柱：Zorba SB-C18（5 μm，9.4×250 mm）；制备梯度：15% B相/30min、流速3 mL/min；分析柱：Inertsil ODS-3（5 μm，4.6×250 mm）；纯化梯度：5% B相/25min、流速0.5 mL/min；标准曲线范围：50–2000 μg/mL；重复次数：3次；检测波长：260 nm
4.7 目标抗生素的生物活性测定与MIC分析
生物活性测定时，指示菌T. cutaneum在TSB培养基中于30°C培养15小时，然后混入熔化的PDA培养基中。将发酵液（15 μL）加入置于琼脂表面的牛津杯中，于4°C放置2小时使代谢物扩散。随后将生物测定平板于30°C培养20小时以观察抗真菌圈。
最低抑菌浓度（MIC）测定采用二倍稀释法，浓度范围为1至256 μg/mL。对于酵母菌株，将20 μL各抗生素溶液加入96孔板中的180 μL YEME培养基中，加入5 × 10⁻²酵母CFU。30°C孵育20小时后记录生长情况。对于丝状真菌，将20 μL抗生素溶液加入96孔板中的200 μL PDA琼脂中，4°C放置2小时使抗生素扩散，然后将真菌接种于琼脂表面，于30°C孵育20–48小时。
【数据】指示菌预培养：TSB、30°C、15h；发酵液上样量：15 μL；扩散条件：4°C、2h；培养条件：30°C、20h（酵母）/20–48h（丝状真菌）；MIC测定：二倍稀释法、1–256 μg/mL；酵母测试体系：20 μL抗生素+180 μL YEME+5×10⁻² CFU、30°C、20h；丝状真菌测试体系：20 μL抗生素+200 μL PDA琼脂、4°C、2h扩散、30°C、20–48h
4.8 分子对接
分子对接计算使用BIOVIA Discovery Studio 4.1（Accelrys）软件包中的CDOCKER（Dock Ligands）模块。CDOCKER是一种基于网格的分子对接算法，采用CHARMm力场，通过高温分子动力学结合模拟退火来采样柔性配体的构象空间。
靶蛋白晶体结构从RCSB PDB数据库获取。PDB ID: 7WJO为来自大豆疫霉的PsChs1与尼克霉素Z的复合物结构，用于分析设计类似物与卵菌靶标的结合模式；PDB ID: 7STO为来自白色念珠菌的CaChs2与POL-D的复合物结构，用于分析设计类似物与真菌靶标的结合模式。
对接前，使用Discovery Studio中的"Prepare Protein"工具对晶体结构进行预处理。预处理步骤包括去除水分子、添加氢原子、分配CHARMm力场以及优化氨基酸侧链的质子化状态。配体（包括天然多氧霉素组分和设计的POL类似物）的三维结构使用Chem3D构建，随后进行能量最小化。
【数据】对接软件：BIOVIA Discovery Studio 4.1（CDOCKER模块）；力场：CHARMm；蛋白结构：PDB 7WJO（PsChs1-尼克霉素Z）、PDB 7STO（CaChs2-POL-D）；配体构建：Chem3D
研究结果
2.1 CaChs2–POL复合物分析指导含简化氮杂环丁烷结构POL类似物的理性设计
来自白色念珠菌的几丁质合成酶CaChs2与POL-D（由CPOAA和含5-羧基尿嘧啶碱基的核苷骨架组成）的复合物结构（PDB: 7STO）最近获解析，为理解几丁质合成酶与POL的分子相互作用提供了关键见解。本研究对该CaChs2–POL-D复合物进行了进一步结构研究。结果表明，POL-D的CPOAA部分和核苷骨架在与几丁质合成酶活性位点结合中发挥关键作用。
S. aureochromogenes主要产生POL-B（缺乏POIA结构）、POL-A（含POIA及5-羟甲基尿嘧啶核苷骨架）和POL-H（含POIA及5-甲基尿嘧啶核苷骨架）（图2）。值得注意的是，已有研究表明，尽管POL-B与POL-A结构高度相似，但POL-B对白色念珠菌表现出优于POL-A的抑制活性，表明POIA结构的存在与否对生物活性有重要影响。
为进一步研究造成这些差异的结构基础，我们进行了分子对接以比较CaChs2与POL-A和POL-B的结合模式。比较对接分析揭示，与POL-B和POL-D相比，POL-A在CaChs2活性口袋内呈现更为扭曲的构象（图2A）。这种构象畸变主要归因于POIA结构的刚性稠环骨架，该结构似乎施加了空间和几何限制，偏离了POL-B和POL-D所呈现的最优结合几何构型。有趣的是，虽然这种刚性化并未消除结合，但可能降低了POL-A与活性位点空腔之间的互补性，从而为其相对于POL-B对白色念珠菌抗真菌活性降低提供了结构解释。这些观察表明，以其他简化氮杂环丁烷结构替代POIA的设计POL类似物更有可能降低构象应变并增强抗真菌活性。
【数据】复合物结构：CaChs2–POL-D（PDB: 7STO）；产生菌主要产物：POL-B、POL-A、POL-H；活性比较：POL-B > POL-A（对白色念珠菌）；POL-A在活性口袋中呈扭曲构象
2.2 破坏S. aureochromogenes中POIA生物合成实现POL-B的工程化生产
为实现设计POL类似物的工程化合成，需破坏POIA的生物合成。polE和polF基因最近被报道为POIA生物合成所必需，其中PolF是新兴的血红素氧化酶样双铁氧化酶/加氧酶（HDO）超家族的新成员，具有双重功能，以L-异亮氨酸为初始底物协调顺序脱饱和和环化反应以构建POIA。
据此，我们在染色体上删除该基因以破坏POIA生物合成，所得CXR3菌株随后进行发酵和代谢产物分析。生物活性测定显示，CXR3菌株的代谢产物对指示真菌Trichosporon cutaneum几乎没有抑制作用（图S2C）；高效液相色谱（HPLC）分析表明CXR3样品可产生与POL-B和POL-J相对应的目标峰（图S2D）。进一步液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）分析显示，CXR3的目标峰能够产生特征的[M+H]+离子，分别为m/z 508.1512（主要碎片离子：m/z 490.1417、447.1355和366.1145）和m/z 492.1566（主要碎片离子：m/z 474.1299、431.1401和366.1139），与POL-B和POL-J的预期碎裂模式完全一致（图S2E–H）。
这些数据表明，在S. aureochromogenes菌株中删除polF基因是实现POL-B和POL-J工程化生产并消除POL-A和POL-H生物合成的可行途径。
【数据】CXR3代谢产物：对T. cutaneum几乎无抑制；POL-B：[M+H]+ m/z 508.1512，碎片m/z 490.1417、447.1355、366.1145；POL-J：[M+H]+ m/z 492.1566，碎片m/z 474.1299、431.1401、366.1139；polF基因功能：POIA生物合成所需，HDO超家族，以L-异亮氨酸为底物
2.3 通过突变合成策略实现含简化氮杂环丁烷结构POL类似物的定向生物合成
为研究相关简化氮杂环丁烷结构能否被整合入POL生物合成途径，将四种含氮杂环丁烷化合物——氮杂环丁烷（AZE）、L-氮杂环丁烷-2-羧酸（L-A2CA）、D-氮杂环丁烷-2-羧酸（D-A2CA）和3-氮杂环丁烷羧酸（3ACA）——分别添加到CXR3培养物中进行代谢产物分析。
引人注目的是，生物活性测定显示仅补充L-A2CA的培养物恢复了对T. cutaneum的抗真菌活性（图2D），暗示可能生成了目标新化合物。进一步HPLC分析表明，添加L-A2CA的CXR3样品能够产生两种新代谢物，命名为POL-AX和POL-HX（分别对应于POL-A和POL-H，图2E）。LC-HRMS分析显示，POL-AX产生特征[M+H]+离子m/z 591.1880，MS/MS碎片离子为m/z 573.1304、529.3221、490.1221、472.1354、449.1375和400.9432，与含L-A2CA的预测POL-A类似物的碎裂模式完全一致。类似地，POL-HX显示特征[M+H]+离子m/z 575.1931，MS/MS碎片离子m/z 557.1573、513.9924、474.0939、456.0414、449.0907和385.1327，与含L-A2CA的POL-H类似物的碎裂模式高度匹配。
此外，LC-HRMS分析表明，添加D-A2CA的CXR3代谢产物也能产生新的特征[M+H]+离子峰，但丰度低得多，分别为m/z 591.1879和m/z 575.1937，与预测的类似物POL-AY和POL-HY一致。同样，添加3ACA的CXR3也能产生痕量水平的两种代谢物，[M+H]+离子分别为m/z 591.1881和m/z 575.1929，对应预测的类似物POL-AZ和POL-HZ。
综合这些结果表明，L-A2CA能够被高效识别并整合入设计的POL类似物中，而D-A2CA和3ACA仅能被微量整合和检测到。
为进一步扩展含简化氮杂环丁烷结构POL类似物的化学多样性，我们随后在CXR3中失活了polB基因（编码核苷骨架C-5甲基化酶），得到菌株CXR6。HPLC分析表明该菌株的发酵样品产生一个新的代谢物峰（图S5C）；进一步LC-HRMS分析揭示其产生特征[M+H]+离子m/z 478.1414，主要碎片离子m/z 460.1667、417.0833、366.1667和288.0833，与POL-L的预期碎裂模式高度吻合。
随后向CXR6培养物补充四种含氮杂环丁烷化合物（AZE、L-A2CA、D-A2CA和3ACA）。类似地，生物活性测定表明仅补充L-A2CA的培养物恢复了对指示真菌T. cutaneum的生物活性（图S6A）。HPLC分析显示产生一个新的代谢物峰（命名为POL-KX）（图S6B）；进一步LC-HRMS分析表明该代谢物可产生特征[M+H]+离子m/z 561.1777，MS/MS碎片离子m/z 543.2169、500.2399、460.1425、449.2496、442.0845和371.1164，与含L-A2CA的预测POL-K类似物的理论模式完全匹配。此外，LC-HRMS分析还显示，在分别补充D-A2CA和3ACA的CXR6培养物中可检测到痕量水平的额外类似物POL-KY和POL-KZ。
综上所述，这些结果进一步证实POL生物合成机制对POIA相关底物具有一定灵活性，但对L-A2CA的识别效率最高。
【数据】饲喂化合物：AZE、L-A2CA、D-A2CA、3ACA；POL-AX：[M+H]+ m/z 591.1880，碎片m/z 573.1304、529.3221、490.1221、472.1354、449.1375、400.9432；POL-HX：[M+H]+ m/z 575.1931，碎片m/z 557.1573、513.9924、474.0939、456.0414、449.0907、385.1327；POL-AY：[M+H]+ m/z 591.1879；POL-HY：[M+H]+ m/z 575.1937；POL-AZ：[M+H]+ m/z 591.1881；POL-HZ：[M+H]+ m/z 575.1929；POL-L：[M+H]+ m/z 478.1414，碎片m/z 460.1667、417.0833、366.1667、288.0833；POL-KX：[M+H]+ m/z 561.1777，碎片m/z 543.2169、500.2399、460.1425、449.2496、442.0845、371.1164；底物识别效率：L-A2CA > D-A2CA ≈ 3ACA
2.4 通过引入L-A2CA途径实现目标含氮杂环丁烷POL类似物的生产
为消除外源补充L-A2CA的需求，我们尝试通过引入L-A2CA生物合成途径来工程化改造POL细胞工厂以生产目标POL类似物。近期，来自铜绿假单胞菌PAO1的azeJ基因（编码AdoMet依赖性酶）被功能鉴定为参与L-A2CA生物合成（图1D、E和图S9），我们将密码子优化的azeJ（基于链霉菌密码子使用偏好，表S10）克隆至整合型质粒pIB139（由启动子ermE*驱动）。
质粒pIB139/azeJ随后接合转移至CXR3和CXR6菌株（图3A），同时将空载体pIB139导入相同菌株作为阴性对照。所得重组菌株随后进行发酵以进一步分析代谢产物。生物活性测定表明，重组菌株CXR3:pIB139/azeJ和CXR6:pIB139/azeJ的代谢产物均恢复了对指示真菌T. cutaneum的抗真菌活性（图3B）；进一步HPLC分析显示，重组菌株CXR3:pIB139/azeJ和CXR6:pIB139/azeJ相应产生三种新代谢物，而S. aureochromogenes、CXR3、CXR3:pIB139、CXR6和CXR6:pIB139等菌株缺乏产生目标化合物的能力（图3C）。进一步LC-HRMS分析表明，CXR3:pIB139/azeJ样品产生特征性[M+H]+离子，确认了目标类似物的生成。
【数据】azeJ基因来源：铜绿假单胞菌PAO1；编码蛋白：AdoMet依赖性酶；启动子：ermE*；载体：pIB139（整合型）；宿主菌：CXR3、CXR6；阳性结果：CXR3:pIB139/azeJ和CXR6:pIB139/azeJ恢复抗真菌活性并产生新代谢物；阴性对照：S. aureochromogenes、CXR3、CXR3:pIB139、CXR6、CXR6:pIB139
2.5 天然POL及相关POL类似物的MIC分析
为评估设计POL类似物的抗真菌活性，选取Trichosporon cutaneum、Candida albicans、Alternaria alternata、Phytophthora sojae、Rhizoctonia solani和Magnaporthe grisea作为指示菌株进行MIC测定。不同深浅的绿色代表天然POL和POL类似物对各指示菌株的MIC值。
【数据】MIC测定菌株：T. cutaneum、C. albicans、A. alternata、P. sojae、R. solani、M. grisea；MIC测定方法：二倍稀释法（1–256 μg/mL）
2.6 CaChs2和PsChs1与POL-A及POL-AX的分子对接模型
为阐明设计类似物增强生物活性的分子机制，对CaChs2和PsChs1与POL-A及POL-AX进行了详细的分子对接分析。与POL-A相比，POL-AX在CaChs2和PsChs1活性位点中均呈现更优的结合构象，表明含L-A2CA的简化结构降低了构象应变，增强了与活性位点空腔的互补性，从而直接贡献于设计POL类似物抑制活性的提升。
【数据】对接靶标：CaChs2（PDB: 7STO）、PsChs1（PDB: 7WJO）；比较对象：POL-A vs POL-AX
讨论与解读
尽管多氧霉素已知通过模拟UDP-GlcNAc作为几丁质合成酶的竞争性抑制剂，但POIA结构的确切作用此前尚不清楚。本研究证明，刚性的POIA结构施加构象应变，削弱了与某些几丁质合成酶的结合互补性——这是一个此前未被识别的结构缺陷。通过合成生物学策略成功将L-A2CA整合入POL骨架，证实了生物合成机制可以容纳简化的含氮杂环丁烷结构。值得注意的是，POL-AX、POL-HX和POL-KX对人类病原体白色念珠菌和卵菌大豆疫霉均表现出增强的活性。鉴于目前基于多氧霉素的农用化学品对疫霉病害的活性有限，这些含氮杂环丁烷的类似物可能填补作物保护领域的这一空白。
编译者解读：本研究展示了一个从结构生物学发现到合成生物学实现的完整闭环——先通过复合物晶体结构和分子对接识别出天然产物中"刚性基团"是活性短板，再有针对性地设计简化替代结构，最后利用突变合成和途径重构实现定向生产。这种"结构解析-理性设计-菌株工程"三位一体的策略，为天然产物结构优化提供了可借鉴的范式。将L-A2CA生物合成途径直接导入生产菌株以消除外源饲喂需求的做法，体现了工业菌株设计的实用性考量。不过，目前对新类似物的体内药效和毒理数据仍属缺乏，从体外活性到实际应用仍有相当距离。
参考来源
Gong R. Directed biosynthesis of the designer peptidyl nucleoside antibiotics featuring a simplified azetidine-containing moiety. Synthetic and Systems Biotechnology, 2027. DOI: 10.1016/j.synbio.2026.08.010
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.08.010