来源：Multilevel metabolic and enzyme engineering enables efficient biosynthesis of cyanidin-3-O-glucoside from dihydroquercetin in Escherichia coli（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）是一种高附加值水溶性天然黄酮类化合物，在营养保健与化妆品行业应用广泛。其微生物合成长期受制于中间体不稳定、代谢失衡及酶动力学瓶颈。本研究在大肠杆菌中通过多层次工程策略——GST功能整合、蛋白质笼介导的空间组织、UDP-葡萄糖原位再生模块以及结构指导的DFR酶工程改造——成功实现了从二氢槲皮素到C3G的高效生物合成，最终工程菌株C3G产量达1.34 g/L，较GST辅助基线菌株提升23倍。
研究背景
花青素类化合物，特别是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G），因其鲜艳的色泽和多样的生理活性，在保健品、食品和化妆品行业应用广泛。目前C3G的工业供应主要依赖紫甘薯、紫甘蓝等植物原料提取。然而，植物提取受制于生长周期长、环境依赖性强以及花青素混合物结构异质等问题，给纯化和产品标准化带来困难。全球耕地压力增大与高纯度天然产物需求上升，推动了可规模化、可控的生物制造策略发展。微生物合成通过精准操纵底盘生物的代谢通路，为复杂天然产物的可持续生产提供了有前景的替代方案。在植物中，L-苯丙氨酸通过苯丙烷和类黄酮途径转化为柚皮素等黄烷酮，再经羟化生成二氢槲皮素（DHQ）等二氢黄酮醇。
研究方法
2.1 材料
标准品二氢槲皮素（DHQ）、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）、异槲皮素（Q3G）、槲皮素（QUE）和矢车菊素（CYA）购自Herbest（中国宝鸡）。NaCl、葡萄糖、蔗糖、2× MultiF Seamless Assembly Mix及PCR产物纯化试剂盒购自Sangon（中国上海）。酵母提取物和胰蛋白胨购自Thermo Scientific（中国北京）。高保真酶PrimeSTAR® Max DNA Polymerase购自TAKARA（中国北京）。
【数据】标准品来源：Herbest（宝鸡）；试剂来源：Sangon（上海）、Thermo Scientific（北京）、TAKARA（北京）
2.2 菌株与质粒构建
本研究所用重组质粒、菌株、引物和编码序列列于表S1-S4。大肠杆菌DH5α用于质粒构建，大肠杆菌BL21(DE3)用作C3G生物合成的起始宿主。引物和构建质粒经Sangon Biotechnology Co., Ltd.（中国广州）Sanger测序验证。基因（FaDFR、PhANS、At3GT、MdGSTF6和GmSuSy）经密码子优化后由Sangon Biotech（中国广州）合成。基因组编辑采用CRISPR-Cas9系统，方法如前所述（Li et al., 2021）。简言之，携带靶向cadA的sgRNA的pEcgRNA-ΔcadA及GmSuSy供体模板通过电穿孔导入BL21(DE3)感受态细胞。加入阿拉伯糖诱导λ-Red。复苏后，细胞涂布于含卡那霉素和壮观霉素的LB琼脂平板。37°C过夜培养后，通过菌落PCR筛选候选菌落，所得扩增子经纯化后Sanger测序（Sangon Biotech，中国上海）。pEcCas9和pEcgRNA质粒消除后，通过抗生素敏感性试验验证质粒丢失（Li et al., 2021）。sgRNA的20 nt序列使用CHOPCHOP在线工具（https://chopchop.cbu.uib.no/）设计。cadA的N20序列为5′-catcgccgcagcggtttcag-3′。所用引物列于表S3。
【数据】宿主菌：E. coli DH5α（质粒构建）、E. coli BL21(DE3)（C3G合成）；sgRNA N20序列：5′-catcgccgcagcggtttcag-3′；培养温度：37°C
2.3 C3G生产的摇瓶发酵
Lysogeny Broth（LB）培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）用于菌株活化。改良M9培养基（1 g/L NH4Cl、3 g/L KH2PO4、6 g/L Na2HPO4·7H2O、0.25 g/L NaCl、1 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2、0.1 mM FeSO4）用于发酵，pH维持在5.1。从平板上挑取单菌落接种至10 mL含适当抗生素的LB培养基中。37°C、220 rpm培养12 h后，以1%（v/v）接种量转接至50 mL LB培养基。细胞在37°C培养至对数中期（OD600 ∼ 0.6），约需2 h，随后加入1.0 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG），在30°C诱导3 h。随后离心收集细胞，重悬于改良M9培养基中，在220 rpm、30°C条件下培养12 h。
【数据】LB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl；改良M9培养基：1 g/L NH4Cl、3 g/L KH2PO4、6 g/L Na2HPO4·7H2O、0.25 g/L NaCl、1 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2、0.1 mM FeSO4；pH：5.1；接种量：1%（v/v）；诱导剂：1.0 mM IPTG；温度：37°C（培养）/30°C（诱导及发酵）；转速：220 rpm；时间：12 h（活化）/2 h（至OD600∼0.6）/3 h（诱导）/12 h（发酵）
2.4 DFR突变体的构建、筛选与表征
基于PSSM的进化分析用于鉴定FaDFR中进化上偏好或可容忍的氨基酸替换。蛋白质结构使用AlphaFold2预测，配体结构从PubChem获取，分子对接使用AutoDock4进行，配体和受体预处理使用AutoDockingTools 1.5.7。PyMOL 2.5.4用于结构可视化。PSSM分析的详细参数见补充方法。FaDFR单位点或多位点突变通过FaDFR诱变引物（表S3）PCR构建。为进行FaDFR突变体的比色筛选，构建了一个筛选模块。C3G标准溶液浓度为20–100 mg/L。在520 nm处测定各标准溶液的吸光度。以C3G浓度（mg/L）为x轴、吸光度（A520）为y轴绘制校准曲线。通过分析已知浓度样品验证校准曲线的准确性。体外酶活分析中，His标签蛋白通过Ni-NTA亲和纯化富集。等量总蛋白用于含磷酸盐缓冲液、NADPH和不同DHQ浓度的反应中。酸化丁醇处理后，通过520 nm吸光度定量产物生成。详细纯化和测定条件见补充方法。
【数据】C3G标准溶液：20–100 mg/L；检测波长：520 nm；蛋白纯化：Ni-NTA亲和纯化；辅因子：NADPH
2.5 分子动力学（MD）模拟
分子动力学模拟用于比较FaDFR及选定变体的结构动力学。对接的FaDFR-NADP+-DHQ复合物作为初始结构，使用GROMACS 2023.3进行200 ns全原子MD模拟。轨迹分析包括结构稳定性、柔性、关键相互作用距离、口袋体积变化、动态互相关和MM/GBSA结合自由能，详细参数见补充方法。
【数据】模拟软件：GROMACS 2023.3；模拟时间：200 ns；模拟体系：FaDFR-NADP+-DHQ复合物
2.6 分析方法
大肠杆菌培养物用高效液相色谱（HPLC，LC-16；Shimadzu）分析。黄酮类化合物用C18色谱柱（250 × 4.6 mm，5 μm，Titank）在35°C下分离。流动相为（A）0.1%（v/v）三氟乙酸水溶液和（B）乙腈。梯度洗脱程序如下：0–10 min，10%–40% A；10–15 min，40%–60% A；15–17 min，60%–10% A；17–28 min，10% A。流速保持在1.0 mL/min。黄酮类化合物根据290 nm、320 nm和520 nm处的峰面积定量。
【数据】色谱柱：C18（250 × 4.6 mm，5 μm）；柱温：35°C；流动相：0.1%三氟乙酸水溶液/乙腈；流速：1.0 mL/min；检测波长：290 nm、320 nm、520 nm；分析时间：28 min
研究结果
3.1 植物来源GST的功能整合以恢复C3G生物合成
此前在酵母异源系统中的研究已证明，无色花青素中间体的非酶促错误脱水常阻碍花青素形成，进而妨碍C3G生物合成。为克服这一瓶颈，谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）被提出可稳定不稳定的2R,4R-flavan-3,3,4-triol中间体，并引导其向C2–C3位脱水，促进花青素形成而非回流至二氢黄酮醇（图2a）。基于这一机制认识，我们考察了工程化大肠杆菌平台中缺乏GST是否同样导致无色花青素节点的代谢耗散。
我们首先构建了不含GST的基线合成途径（将二氢黄酮醇转化为C3G），包含Fragaria x ananassa DFR（FaDFR）、Petunia x hybrid ANS（PhANS）和Arabidopsis thaliana 3GT（At3GT）。如预期，发酵分析显示该对照菌株未能积累任何可检测的C3G（图2b），证实GST是大肠杆菌中功能性途径重建不可或缺的组分。
为评估不同GST对C3G生物合成的影响，异源表达了Malus domestica MdGSTF6、Populus trichocarpa PtGSTF8和Petunia hybrida PhAN9。GST整合后，所有工程菌株的C3G产量均成功恢复（图2b）。虽然携带PhAN9的菌株达到最高绝对C3G滴度，但各候选菌株的细胞生长存在显著差异；携带PtGSTF8、PhAN9和MdGSTF6的菌株最终OD600值分别为8.05、9.61和7.25。值得注意的是，按生物量归一化后，MdGSTF6表现出最高单位细胞C3G产量，为7.97 mg/L/OD600，略高于PtGSTF8（7.33 mg/L/OD600）和PhAN9（7.11 mg/L/OD600）。因此，基于在测试条件下略优的平均C3G产量，选择MdGSTF6用于后续途径优化。总体滴度仍然较低，可能受限于次优的细胞生长及酶功能表达不足，发酵中观察到的不完全底物转化也印证了这一点（图S1）。
作为植物来源酶，MdGSTF6在大肠杆菌中的异源表达常导致蛋白质错误折叠及不溶性包涵体形成，严重限制功能性酶库。为评估MdGSTF6的表达谱，收集诱导细胞并破碎。全细胞裂解液、上清和沉淀组分的SDS-PAGE分析显示，诱导后12 h和36 h，大量MdGSTF6分配至不溶性组分（图S2）。这些观察证实途径的催化潜力因MdGSTF6溶解性差而严重受损。
与高溶解性多肽标签融合是促进微生物宿主中蛋白质正确折叠和增强可溶表达的稳健且广泛采用的策略。为优化MdGSTF6功能，我们在其N端融合了多种表征良好的增溶标签，包括小泛素样修饰物（SUMO）、泛素（Ub）和麦芽糖结合蛋白（MBP），生成三个重组菌株S2–S4（图2c）。随后在M9培养基中评估这些融合变体的C3G生产能力。在候选菌株中，菌株S2（SUMO-MdGSTF6）表现出最显著的改善，C3G滴度达108.90 mg/L，较携带未标记MdGSTF6的原始S1菌株提高约7倍（图2c）。SDS-PAGE分析进一步证实SUMO融合有效将MdGSTF6从包涵体转变为可溶性胞质组分（图S3）。相比之下，MBP标签的整合导致C3G积累减少。这种降低可能归因于标签分子量较大，可能造成空间位阻或高代谢负担，从而对嵌合蛋白的折叠动力学和功能表达产生负面影响。
总体而言，这些发现表明MdGSTF6作为关键的代谢漏斗，阻止中间体的自发非生产性脱水，有效引导代谢流朝向花青素形成。这强调了在复杂黄酮途径中，管理中间体分配和化学稳定性与最大化绝对酶表达水平同等重要。
【数据】对照菌株C3G产量：未检出；最终OD600：PtGSTF8菌株8.05、PhAN9菌株9.61、MdGSTF6菌株7.25；单位细胞C3G产量：MdGSTF6 7.97 mg/L/OD600、PtGSTF8 7.33 mg/L/OD600、PhAN9 7.11 mg/L/OD600；S2菌株（SUMO-MdGSTF6）C3G滴度：108.90 mg/L，较S1提高约7倍
3.2 工程化多酶空间组织以提升C3G途径通量
尽管SUMO标记的MdGSTF6恢复了C3G产量，但碳分布分析显示仅23.4%的消耗DHQ转化为C3G，6.4%以花青素形式积累，未检测到主要黄酮醇副产物的显著积累（表S5）。约70.2%的消耗DHQ未以可测量产物回收，提示中间体耗散和/或连续酶促步骤之间的低效传递。这一结果表明，不稳定中间体的快速转化对提高C3G积累至关重要。
为缓解扩散介导的损失，我们利用人工蛋白质笼scMi3作为纳米支架介导多酶组装。为将支架表达的代谢效应与生产性酶招募解耦，我们系统比较了无支架对照、招募缺陷对照（S5）及各种SpyTag/SpyCatcher融合组装构型（S6–S10）（图3a、b）。SDS-PAGE分析确认目标酶成功偶联至scMi3支架（图S4）。同时，所有工程菌株表现出相当的OD600值，表明支架组装对细胞生长施加的代谢负担可忽略不计（图3c）。
值得注意的是，无支架对照和S5菌株产生相似的C3G滴度，表明单独表达scMi3支架不足以改善C3G产量。相比之下，将途径酶有效招募至scMi3笼上显著重塑了途径输出。在测试的组装构型中，S6达到最高C3G滴度480.14 mg/L（较对照提高1.41倍），同时将竞争性异槲皮素（Q3G）副产物从43.80 mg/L降至19.84–9.42 mg/L（图3c、d）。这些结果表明，邻近诱导的酶共定位成功将代谢流从竞争性Q3G分支转移，从而增强朝向C3G的表观途径通量。此外，scMi3介导组织的性能高度依赖于招募的空间构型，S6–S10菌株间C3G滴度和Q3G水平的差异证明了这一点。
为验证这些观察是否反映内在途径限制而非支架特异性效应，我们还构建了使用直接蛋白融合和RIAD–RIDD肽对的无支架组装。生成了包括S11（ANS–3GT）、S12（DFR–ANS）、S13（ANS–RIAD/3GT–RIDD）和S14（DFR–RIAD/ANS–RIDD）的菌株。在两种替代系统中，DFR–ANS偶联始终优于ANS–3GT（图S5）。值得注意的是，在DFR–ANS融合中，DHQ消耗几乎完全被检测到的产物所解释，证实DFR节点的高效催化加工决定了下游通量路由。然而，两种替代策略均未提高总体C3G滴度。这一限制可能源于刚性结构约束或构象动力学受损。
【数据】碳分布：23.4%消耗DHQ转化为C3G、6.4%积累为花青素、约70.2%未回收为可测量产物；S6菌株C3G滴度：480.14 mg/L（较对照提高1.41倍）；Q3G副产物：43.80 mg/L降至19.84–9.42 mg/L
3.3 蔗糖合酶介导的UDP-葡萄糖原位再生模块
UDP-葡萄糖作为3GT催化的最终糖基化步骤的糖供体，其持续供应对C3G高效合成至关重要。在S6菌株中，C3G滴度达到480.14 mg/L，但Q3G副产物积累提示胞内UDP-葡萄糖供应可能不足以完全驱动底物向C3G转化。为解决这一限制，我们引入了源自Glycine max的蔗糖合酶（GmSuSy），该酶可利用廉价蔗糖和UDP再生UDP-葡萄糖（图4a）。
通过CRISPR-Cas9系统将GmSuSy整合至大肠杆菌BL21(DE3)基因组中cadA位点，构建了菌株S15。摇瓶发酵结果显示，与S6相比，S15的C3G滴度提高至612.37 mg/L，同时Q3G积累从43.80 mg/L降至15.61 mg/L。这些结果表明，原位UDP-葡萄糖再生模块有效增强了终末糖基化步骤的热力学驱动力，将更多通量导向C3G形成而非竞争性副产物途径。
【数据】S15菌株C3G滴度：612.37 mg/L；Q3G积累：43.80 mg/L降至15.61 mg/L
3.4 结构指导的FaDFR工程改造以提升高底物耐受性
经过途径水平优化后，在增加DHQ投料量条件下，关键酶FaDFR因底物抑制成为新的限速瓶颈。为克服这一限制，我们进行了结构指导和进化信息引导的FaDFR工程改造（图5）。基于AlphaFold2预测的结构模型和AutoDock4分子对接分析，鉴定了催化口袋内的候选残基（图5a）。利用位置特异性评分矩阵（PSSM）分析进行热点鉴定（图5b），识别出进化上偏好或可容忍的氨基酸替换。
通过组合突变，获得含G130C替换的FaDFR变体。体外酶活分析显示，该变体在高DHQ浓度下保持较高催化活性，而野生型FaDFR在高底物浓度下活性显著下降。分子动力学模拟进一步揭示了G130C变体的稳定化构象——突变引入的半胱氨酸与底物之间形成更稳定的相互作用网络，维持了催化构象的完整性（图6）。
【数据】FaDFR变体：含G130C替换；模拟方法：200 ns MD；关键参数原文未详述
3.5 组合工程实现高效C3G生物合成
将上述所有优化策略组合到单一菌株中——包括SUMO-MdGSTF6融合表达、scMi3蛋白质笼介导的多酶空间组织、基因组整合的GmSuSy UDP-葡萄糖再生模块以及G130C FaDFR变体——构建了最终工程菌株。在优化条件下摇瓶发酵，该菌株实现了C3G滴度1.34 g/L，较GST辅助基线菌株提高23倍。
【数据】最终C3G滴度：1.34 g/L；较GST辅助基线菌株提升：23倍
讨论与解读
本研究通过多层次代谢工程策略在大肠杆菌中实现了从DHQ到C3G的高效生物合成。功能整合MdGSTF6对调节中间体分配至关重要，通过抑制无色花青素的非酶促脱水并将代谢流导向生产性花青素形成。scMi3蛋白质笼作为空间支架有效超越了胞内扩散限制，通过增强酶共定位将不稳定中间体的耗散降至最低。蔗糖介导的UDP-葡萄糖再生模块为终末糖基化步骤提供了持续的热力学驱动力。结构指导的DFR改造提升了高底物耐受性。最终组合菌株C3G滴度达1.34 g/L，较基线菌株提升23倍。
【编译者解读】该研究展示了合成生物学中"途径工程+酶工程"协同设计的力量——先通过GST和蛋白质笼解决中间体不稳定问题，再以UDP-葡萄糖再生模块保障糖供体供给，最后用计算指导的DFR突变解除底物抑制瓶颈。这种逐层诊断、逐级优化的策略值得借鉴。值得注意的是，约70%的DHQ在早期未能转化为可测量产物，说明中间体耗散仍是花青素微生物合成的深层障碍。未来若能将DFR节点效率进一步提升，或与上游苯丙氨酸从头合成途径整合，C3G产量仍有较大提升空间。
参考来源
Wang, Z. (2027). Multilevel metabolic and enzyme engineering enables efficient biosynthesis of cyanidin-3-O-glucoside from dihydroquercetin in Escherichia coli. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135646
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135646