来源：The Bacillus subtilis K6-Based strategy for zearalenone removal in corn germ meal: Pathway elucidation, toxicity evaluation, and practical application（Food Control）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
玉米胚芽粕是玉米湿法加工的主要副产物，却极易遭受玉米赤霉烯酮（ZEN）污染。本研究系统评估了枯草芽孢杆菌K6在不同操作参数下的ZEN降解效能，在优化条件下（12 h预培养、5%接种量、37°C、pH 6.5、含2.5 ppm ZEN培养基中培养48 h）实现98.56 ± 0.32%的降解率。通过HPLC-MS鉴定出两种主要转化产物W1和W2，整合降解条件与酶活性位点数据提出代谢途径。体外毒性与计算机预测证实降解产物毒性显著低于原毒素。在天然污染的玉米胚芽粕固态发酵试验中，ZEN降解率最高达97.85%。
研究背景
玉米胚芽粕作为玉米深加工副产物年产量巨大，作为饲料具有可观营养价值，但极易遭受ZEN污染。研究报道68%的玉米青贮样品和28%的配合饲料样品中检出ZEN。ZEN是由禾谷镰刀菌为主产生的非甾体类雌激素样真菌毒素，具有内酯环结构。由于其在畜禽饲料中高度稳定，动物急性摄入重度污染青贮或慢性暴露于低水平污染饲料后，牛奶中均可检出ZEN。ZEN暴露可诱导人类和牲畜的生殖毒性、基因毒性和免疫毒性，急性中毒表现为神经兴奋、肌肉震颤和突然倒地。2017年10月27日，IARC将ZEN列为3类致癌物。现有物理方法（热处理、辐照）和化学方法（臭氧、电化学处理）虽可实现ZEN降解，但均产生顺式ZEN异构体和氧化开环羧酸代谢物，ZEN降解已成为全球食品安全的关键优先事项。
研究方法
2.1 材料与试剂
枯草芽孢杆菌K6由本实验室从土壤中分离获得，并通过在ZEN富集培养基中培养进一步筛选和验证其降解能力。ZEN购自上海源叶生物科技有限公司（HPLC级标准品）。ZEN储备液（1 mg/mL）以100%乙腈溶解配制，于−20°C保存。所有实验溶剂（乙腈、甲醇）均为色谱纯级。
【数据】ZEN储备液浓度：1 mg/mL；溶剂：100%乙腈；保存温度：−20°C
2.2 种子液制备
从冷冻管中无菌蘸取100 μL枯草芽孢杆菌K6，划线接种于LB琼脂培养基，37°C培养16 h。随后挑取单菌落接种至LB液体培养基，37°C、180 rpm振荡培养12 h，制备后续实验用种子液。
【数据】划线体积：100 μL；LB琼脂培养温度：37°C；时间：16 h；液体培养温度：37°C；转速：180 rpm；时间：12 h
2.3 影响ZEN降解的因素
参照已报道方案并作如下修改开展实验。
【数据】方法参照：Xiang et al., 2024; Xu et al., 2016
#### 2.3.1 发酵培养时间对ZEN去除率的影响
种子液以5%接种量接入pH 7.0发酵培养基，37°C、180 rpm振荡培养12 h、24 h、36 h、48 h。随后取950 μL发酵液与50 μL 40 mg/L ZEN标准溶液于10 mL无菌离心管中混合，37°C/180 rpm培养60 h后测定ZEN含量。
【数据】接种量：5%；培养基pH：7.0；培养时间梯度：12/24/36/48 h；发酵液：ZEN标准液 = 950 μL:50 μL；ZEN浓度：40 mg/L；反应温度：37°C；转速：180 rpm；反应时间：60 h
#### 2.3.2 发酵接种量对ZEN去除率的影响
将梯度接种量（1%、3%、5%、7%、9%）的种子液接入pH 7.0发酵培养基，37°C/180 rpm培养12 h。混合物（950 μL发酵液 + 50 μL 40 mg/L ZEN）在相同条件下孵育60 h后分析。
【数据】接种量梯度：1%/3%/5%/7%/9%；培养基pH：7.0；培养时间：12 h；ZEN浓度：40 mg/L；反应温度：37°C；转速：180 rpm；反应时间：60 h
#### 2.3.3 ZEN浓度对去除效率的影响
种子液经12 h预培养（5%接种量，pH 7.0）后，取950 μL发酵液与50 μL梯度浓度ZEN溶液（10、20、30、40、50 mg/L）在离心管中混合。混合物于37°C/180 rpm孵育60 h后进行ZEN定量。
【数据】预培养时间：12 h；接种量：5%；pH：7.0；ZEN浓度梯度：10/20/30/40/50 mg/L；反应温度：37°C；转速：180 rpm；反应时间：60 h
#### 2.3.4 发酵pH对ZEN去除率的影响
以5%接种量接入pH梯度（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）培养基，37°C/180 rpm振荡培养12 h。随后取950 μL发酵液与50 μL 40 mg/L ZEN溶液混合，在标准条件下孵育60 h。
【数据】接种量：5%；pH梯度：4.0/5.0/6.0/7.0/8.0/9.0；培养温度：37°C；转速：180 rpm；培养时间：12 h；ZEN浓度：40 mg/L；反应时间：60 h
#### 2.3.5 发酵温度对ZEN去除率的影响
种子液经12 h预培养（5%接种量，pH 7.0）后，添加ZEN的混合物在温度梯度（28、31、34、37、40°C）下以180 rpm振荡孵育60 h后测定。
【数据】预培养时间：12 h；接种量：5%；pH：7.0；温度梯度：28/31/34/37/40°C；转速：180 rpm；反应时间：60 h
#### 2.3.6 发酵时长对ZEN去除率的影响
标准12 h预培养后，含ZEN样品于37°C/180 rpm进行时间梯度孵育（12、24、36、48、60、72 h），评估去除效率。
【数据】预培养时间：12 h；温度：37°C；转速：180 rpm；时间梯度：12/24/36/48/60/72 h
2.4 ZEN含量测定
ZEN检测方法参照Pan等的方法并作修改。样品以三倍体积二氯甲烷提取，弃去水相后氮气吹干有机相。残留物以1 mL水:乙腈:甲醇（46:46:8，v/v）复溶，经0.22 μm有机滤膜过滤。ZEN分析采用Waters E2695 HPLC系统，配备C18色谱柱（25 × 4.6 mm，5 μm；Agilent），柱温30°C。流动相为水:乙腈:甲醇（46:46:8，v/v），流速0.8 mL/min，进样量20 μL。荧光检测参数：λex 274 nm/λem 440 nm。ZEN百分含量计算公式：P =（测试样品中ZEN峰面积/对照中ZEN峰面积）× 100%。
【数据】提取溶剂：二氯甲烷（三倍体积）；复溶液：水:乙腈:甲醇 = 46:46:8（v/v）；复溶体积：1 mL；滤膜：0.22 μm；色谱柱：C18（25 × 4.6 mm，5 μm）；柱温：30°C；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL；检测：λex 274 nm/λem 440 nm
2.5 枯草芽孢杆菌K6中ZEN去除活性组分的定位
参照已报道方法并作修改。种子液（5%接种量）在pH 7.0发酵培养基中于37°C/180 rpm培养12 h。培养物离心（8000 rpm，10 min，4°C），分离上清液（经0.22 μm膜过滤灭菌）和菌体沉淀。沉淀以无菌生理盐水洗涤2-3次，PBS重悬制备菌悬液。一部分经超声破碎（200 W，20 min）后离心获得胞内液（0.22 μm过滤）。另一部分灭菌制备灭活菌悬液。实验组含950 μL测试材料（上清液、菌悬液、胞内液、灭活菌悬液、热灭活胞内液、SDS + 胞内液），与50 μL 40 mg/L ZEN溶液混合。对照组为950 μL无菌LB培养基加50 μL ZEN。所有样品于37°C/180 rpm孵育60 h，每组三个平行样，三次独立实验重复。
【数据】离心：8000 rpm，10 min，4°C；超声破碎：200 W，20 min；ZEN浓度：40 mg/L；反应温度：37°C；转速：180 rpm；时间：60 h；平行样：3个/组；重复：3次
2.6 ZEN降解产物分析
含50 μL 40 mg/L ZEN标准溶液和950 μL发酵液的混合物于10 mL无菌离心管中，37°C、180 rpm振荡孵育60 h。发酵后样品经二氯甲烷提取、氮气吹干溶剂、1 mL甲醇复溶、0.22 μm膜过滤后于4°C保存。以不含ZEN的发酵液制备对照样品，处理方式相同。产物鉴定方法参照Wu等的方法并作修改。降解产物采用UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS系统（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）分析，参数如下：UPLC C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.6 μm）；柱温40°C；进样量2 μL；流动相A（甲醇）和B（含0.1%（v/v）甲酸和1 mmol/L乙酸铵的水溶液），流速0.3 mL/min。质谱采用正离子模式，离子源温度300°C，毛细管电压3.2 kV。
【数据】ZEN浓度：40 mg/L；孵育温度：37°C；转速：180 rpm；时间：60 h；色谱柱：C18（100 mm × 2.1 mm，1.6 μm）；柱温：40°C；进样量：2 μL；流速：0.3 mL/min；离子源温度：300°C；毛细管电压：3.2 kV
2.7 ZEN降解产物毒性验证
参照Cetin等描述的方法并作修改，采用MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）法评估ZEN降解产物的细胞毒性和雌激素毒性。50 mg/L ZEN标准溶液与发酵液按1:19比例混合，37°C、180 rpm振荡孵育60 h。培养后样品经二氯甲烷提取、氮气吹干、紫外灭菌，以2 mL完全培养基加2 μL DMSO复溶。涡旋后样品用完全培养基稀释至工作浓度（5、10、15、20、25 μg/mL）。
【数据】ZEN浓度：50 mg/L；混合比例：1:19；孵育温度：37°C；转速：180 rpm；时间：60 h；工作浓度：5/10/15/20/25 μg/mL
#### 2.7.1 HepG2细胞毒性评估
HepG2细胞在MEM完全培养基（5% CO2，37°C）中培养至对数期，以1 × 10⁴细胞/孔接种于96孔板。对照孔加入100 μL培养基，实验孔加入100 μL样品工作液。24 h孵育（5% CO2，37°C）后，PBS洗涤细胞，加入100 μL MTT培养基（0.5 mg/mL）孵育4 h。DMSO溶解（100 μL/孔）后，使用SPARK10M酶标仪（TECAN）测定570 nm吸光度。
【数据】细胞接种密度：1 × 10⁴细胞/孔；孵育条件：5% CO2，37°C，24 h；MTT浓度：0.5 mg/mL；MTT孵育时间：4 h；DMSO用量：100 μL/孔；检测波长：570 nm
#### 2.7.2 MCF-7增殖毒性评估
MCF-7细胞在无酚红DMEM完全培养基中维持3-5天，于对数生长期收集。细胞以6 × 10³/孔接种于96孔板，后续操作与HepG2细胞方案相同。
【数据】细胞接种密度：6 × 10³/孔；无酚红DMEM维持时间：3-5天
#### 2.7.3 软件分析产物毒性验证
软件模型建立参照Peter等报道的方法并作适当修改。将ZEN及其降解产物输入T.E.S.T.和ECOSAR软件进行毒性预测。
【数据】软件：T.E.S.T.、ECOSAR；方法参照：Reuschenbach et al., 2008
研究结果
3.1 不同条件对枯草芽孢杆菌K6去除ZEN的影响
为系统评估枯草芽孢杆菌K6的ZEN降解能力，首先考察了培养时长对降解效率的影响（图1a）。降解率在12 h时达到最大值98.74%，随后逐步下降至48 h的46.78%。枯草芽孢杆菌K6的ZEN降解能力与其生长相动态密切相关，这归因于微生物生长的内在周期性。推测随着孵育时间延长，细菌代谢活性减弱，细胞进入衰亡期并发生自溶，负责ZEN降解的酶或生物活性代谢物逐渐丧失功能——共同导致解毒效率的下降。
接种量反映初始细胞密度对ZEN降解率的影响，结果如图1b所示。在1%至5%的接种量范围内，枯草芽孢杆菌K6表现出持续高水平的ZEN降解效率。5%（v/v）接种量时达到最大降解率97.30%，确定该值为有效解毒的最佳接种水平。
菌株K6在液体培养中的ZEN降解效能呈浓度依赖性（图1c）。在初始ZEN浓度0.5–1.0 mg/L范围内，降解效率显著提高，在1.0 mg/L时达到峰值97.61%。随初始ZEN浓度进一步升高，降解效率呈温和但非显著上升趋势，在2.5 mg/L时达到98.11%。值得注意的是，所有测试系统处理后残留ZEN浓度均持续低于50 μg/kg的监管限值，符合欧盟对大多数加工和未加工谷物（婴幼儿谷物产品除外）中ZEN允许限量50–400 μg/kg的监管框架。按ZEN绝对去除量评估时，降解能力与初始ZEN浓度呈正相关。相比之下，部分研究报告降解效率与底物浓度呈反比关系。例如，解淀粉芽孢杆菌ZDS-1在浓度超过50 mg/L时ZEN降解效率逐渐下降。综上，菌株K6对ZEN具有优异的耐受性，即使在不同真菌毒素负载条件下仍能维持高降解效率。
如图1d所示，pH显著影响菌株K6对ZEN的降解。在pH 4–7范围内降解效率显著提高，在pH 7时达到峰值98.5%。值得注意的是，即使在pH 9时，降解率仍保持在95%以上。这些发现表明K6在宽pH范围内维持着强大的ZEN降解活性。pH影响微生物生长、代谢活性及关键降解酶的功能，是微生物ZEN解毒中的关键参数。耳炎假单胞菌TH-N1在pH 4.5–8.5范围内ZEN降解效率逐渐下降，在pH 4.5时最大达到65%，但在pH 8.5时降至49%。枯草芽孢杆菌ZENL09仅在pH 8时表现出最佳降解性能（96%）。综合这些报道，大多数微生物菌株仅在狭窄pH窗口内表现出有效的ZEN降解，而K6在5–9的宽pH范围内维持>85%的降解效率。这凸显了K6对不同pH条件的卓越适应性，尤其是其在碱性环境中的稳健表现。
如图1e所示，温度显著影响菌株K6对ZEN的降解。在28–37°C范围内，降解效率随温度升高逐步提高，在37°C时达到峰值97.49%。值得注意的是，即使在40°C下，K6仍保持95.29%的高降解效率。温度对微生物生长、代谢活性和解毒能力具有关键调控作用。解淀粉芽孢杆菌ZDS-1在其最适温度下可实现ZEN（1–100 mg/L）的近乎完全降解，但40°C时效率骤降至10%以下。同样，枯草芽孢杆菌ZJ-2019-1在22°C时表现出完全的ZEN降解，但在27–42°C更宽范围内效率显著下降至30%–70%。这些菌株仅在狭窄温度窗口内表现出高ZEN降解活性。与此形成鲜明对比的是，枯草芽孢杆菌K6在31–40°C的宽温度范围内维持>92%的降解效率，凸显了其稳健且耐热的解毒性能，适用于多种环境条件。
如图1f所示，发酵时长显著影响ZEN降解：降解率从12 h的88.76%上升至48 h的98.03%，此后继续孵育则进入稳定、接近最大值的降解平台期。这一发现与此前报道一致——枯草芽孢杆菌Y816在共培养12–24 h内实现>80%的ZEN降解。这些结果表明菌株K6具备与文献报道的其他枯草芽孢杆菌分离株相当的降解效能。
【数据】最佳培养时长：12 h（降解率98.74%）；48 h降至46.78%；最佳接种量：5%（降解率97.30%）；最佳初始ZEN浓度：1.0 mg/L（97.61%），2.5 mg/L时为98.11%；最佳pH：7.0（98.5%），pH 9时>95%；最佳温度：37°C（97.49%），40°C时为95.29%；最佳发酵时长：48 h（98.03%）
3.2 枯草芽孢杆菌K6中ZEN去除活性组分的定位
细菌对ZEN的解毒主要经由两种机制：全细胞的物理吸附和由生物活性组分介导的酶促/生化降解，后者可分为胞外型和胞内型。图2展示了枯草芽孢杆菌K6不同细胞组分的ZEN降解能力。
数据表明，完整活细胞实现了最高降解效率（97.17%），几乎与全细胞培养物（98.56%）相当；胞内组分次之（50.42%）；而无细胞上清液活性最低，仅实现23.65%的降解。这与来自其他菌株的研究结果形成对比——例如，赖氨酸芽孢杆菌ZJ-2016-1的上清液实现了95.8%的ZEN降解，而胞内组分仅为30.2%，活细胞为15.5%。为进一步验证该机制，对细胞进行热灭活处理；降解能力显著降低（ZEN去除率仅为0.68%），有效排除了物理吸附作为主要途径的可能性。尽管文献报道某些菌株的细胞壁组分在灭活后仍可保留结合能力，但本研究筛选的菌株未表现出此类特征。此外，当胞内组分经热变性或SDS处理后，其ZEN降解效率分别骤降至20.63%和13.21%（相对于未处理天然组分）。综合这些结果证明，枯草芽孢杆菌K6对ZEN的降解由生物活性组分驱动——主要是表面相关蛋白和胞内酶——而非被动吸附。
【数据】活细胞降解率：97.17%；全细胞培养物：98.56%；胞内组分：50.42%；无细胞上清液：23.65%；热灭活细胞：0.68%；热变性胞内液：20.63%；SDS处理胞内液：13.21%
3.3 枯草芽孢杆菌K6对ZEN降解产物的分析
为阐明枯草芽孢杆菌K6的ZEN降解机制，首先使用高效液相色谱（HPLC）验证转化产物的生成。ZEN的特征保留时间为11.5 min（图3a）。菌株K6共孵育48 h后，色谱图中在3.6 min和3.9 min处出现两个新峰（图3c），相对于相同条件下培养的不含ZEN对照，强烈表明这些峰源自ZEN的生物转化。
利用UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS对转化产物进行鉴定。提取离子色谱图（EIC）显示两种主要转化产物W1和W2（图4）。
MS/MS碎裂模式分析（图5）结合精确质量数测定，将W1鉴定为C23H32N2O6，W2鉴定为C28H46N4O10。
整合最佳降解条件数据与推定的酶活性位点信息，提出了枯草芽孢杆菌K6转化ZEN的代谢途径（图6），涉及鸟氨酸特异性缀合、内酯环水解和谷氨酰胺加合等步骤。
【数据】ZEN保留时间：11.5 min；产物峰保留时间：3.6 min和3.9 min；W1分子式：C23H32N2O6；W2分子式：C28H46N4O10
3.4 降解产物毒性评估
利用OECD QSAR Toolbox进行计算机模拟毒性预测（图7）。ECOSAR和T.E.S.T.毒性模拟分析结果一致表明，ZEN降解产物W1和W2的预测毒性较母体化合物ZEN显著降低。
体外细胞毒性实验进一步验证了上述预测。在HepG2细胞活力实验和MCF-7细胞增殖实验中，ZEN降解产物在等摩尔浓度下表现出相较于天然ZEN显著降低的肝毒性和雌激素活性（图8a、8b）。形态学观察显示，经25 μg/mL ZEN处理后的HepG2细胞出现明显形态学改变，而经25 μg/mL ZEN降解产物处理的细胞形态保持正常（图8c、8d）。
【数据】ZEN处理浓度：25 μg/mL；细胞系：HepG2、MCF-7
3.5 玉米胚芽粕中ZEN的脱毒应用
在固态发酵条件下评估枯草芽孢杆菌K6对天然污染玉米胚芽粕中ZEN的脱毒效果（图9）。孵育温度显著影响ZEN降解效率（图9a）；固液比（w/v）影响ZEN去除率（图9b）；接种密度和初始ZEN浓度的影响如图9c所示。在自然污染的玉米胚芽粕中，K6在27–47°C范围内使ZEN水平降低81.85–97.85%。
【数据】ZEN降解范围：81.85–97.85%；温度范围：27–47°C
讨论与解读
讨论要点
ZEN污染对谷物基食品和饲料安全构成严重威胁，亟需高效、安全且可工业化放大的脱毒技术。本研究证实枯草芽孢杆菌K6在宽操作窗口内（0.5–2.5 mg/L ZEN、31–40°C、pH 5.0–9.0）实现>92%的ZEN去除，展现出卓越的环境适应性。机制研究表明，ZEN降解主要由胞内酶促组分介导——活细胞降解效率达97.17%，显著超过无细胞上清液（23.65%）和热灭活细胞（无活性），细胞裂解液保留约50.42%活性，但变性处理后活性基本丧失。通过HPLC和UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS鉴定出两种主要代谢物W1（C23H32N2O6）和W2（C28H46N4O10），阐明了一条涉及鸟氨酸特异性缀合、内酯环水解和谷氨酰胺加合的转化途径。体外细胞毒性实验（HepG2肝毒性和MCF-7雌激素活性）与计算毒理学一致证实降解产物毒性可忽略。在天然污染玉米胚芽粕中，K6保持高脱毒效率，在27–47°C范围内使ZEN水平降低81.85–97.85%；在模拟工业发酵条件下（2%（v/v）接种量，12 h），ZEN去除率超过80%。
编译者解读
该研究为真菌毒素脱毒提供了一个值得关注的范式：将菌株筛选、机制解析、毒性验证到实际基质应用串联成完整链条。K6的突出优势在于其宽泛的pH和温度适应性——大多数已报道菌株仅在狭窄窗口内高效降解ZEN，而K6在碱性条件和40°C下仍保持高活性，这对其在工业发酵场景中的应用至关重要。产物鉴定与毒性评估的紧密结合值得借鉴——仅报告"降解率"而不追踪产物毒性，在实际应用中可能掩盖更大的安全隐患。代谢途径中鸟氨酸缀合与谷氨酰胺加合的发现提示，K6可能通过氨基酸代谢网络实现对ZEN的解毒转化，这一机制性认识为后续酶工程改造提供了靶点。不足之处在于，胞内酶的纯化鉴定尚未完成，降解动力学模型也待建立，从实验室到吨级发酵罐的放大验证仍是未来应用的关键一步。
参考来源
Li K. The Bacillus subtilis K6-Based strategy for zearalenone removal in corn germ meal: Pathway elucidation, toxicity evaluation, and practical application. Food Control, 2026. DOI: 10.1016/j.foodcont.2026.112098
DOI: 10.1016/j.foodcont.2026.112098