来源：Stepwise metabolic engineering enables high-level production of deoxyviolacein as a natural pigment in Escherichia coli（Dyes and Pigments）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
脱氧紫色杆菌素是一种吲哚衍生物色素，具有抗菌活性、化学稳定性和光稳定性，在食品、纺织和化妆品行业具有应用前景。然而，天然菌株中脱氧紫色杆菌素产量低且与紫色杆菌素难以分离，限制了其实际应用。本研究通过逐步代谢工程策略改造大肠杆菌，包括前体供给强化、培养条件优化、异源途径表达调控、辅因子再生工程及无膜区室化策略，最终获得摇瓶产量2.65 g/L、5 L生物反应器产量11.7 g/L的工程菌株BDVIO-30。
研究背景
天然吲哚衍生色素因其多样的生物活性和良好的理化性质，正作为合成色素的可持续替代品受到广泛关注。脱氧紫色杆菌素是紫色杆菌素的结构类似物，与紫色杆菌素相比具有更强的化学稳定性和环境耐受性。但天然产生菌（如紫色色杆菌、詹森杆菌等）通常合成以紫色杆菌素为主的色素混合物，脱氧紫色杆菌素仅占总色素的约10%，下游分离纯化困难。传统化学合成法则依赖多步反应和危险试剂，产率低且难以工业化。因此，构建高效的微生物细胞工厂实现脱氧紫色杆菌素的规模化生物合成具有重要的研究价值。
研究方法
2.1 菌株与质粒
以大肠杆菌MG1655作为脱氧紫色杆菌素生产的初始宿主菌株，大肠杆菌JM109用于质粒构建和基因克隆。所有构建的质粒和工程菌株汇总于表1，本研究所用引物列于表S1。pCOLADuet质粒用于表达脱氧紫色杆菌素生物合成基因簇vioABEC，pTrc99a质粒用于表达辅因子相关基因，pCD质粒用于表达与区室化相关的基因。所有构建的质粒均通过Sanger测序验证（Azenta，中国苏州）。
【数据】宿主菌株：E. coli MG1655；克隆宿主：E. coli JM109；测序验证：Sanger测序
2.2 培养基与摇瓶培养条件
以Luria-Bertani（LB）培养基作为初始种子培养液。脱氧紫色杆菌素发酵生产采用M9-YE培养基，其组成为：5 g/L酵母提取物、10 g/L葡萄糖、3 g/L KH₂PO₄、6.8 g/L Na₂HPO₄、0.5 g/L NaCl、0.246 g/L MgSO₄·7H₂O、1 g/L NH₄Cl、0.02 g/L CaCl₂和2.86 g/L色氨酸（14 mM）。发酵培养基为R/2培养基，组成为：3 g/L酵母提取物、3 g/L (NH₄)₂SO₄、2 g/L (NH₄)₂HPO₄、6.75 g/L KH₂PO₄、20 g/L C₃H₈O₃、0.85 g/L C₆H₈O₇、0.7 g/L MgSO₄·7H₂O、5 mL/L微量元素溶液（TMS），用氢氧化钠调节pH至6.8。微量元素溶液（TMS）由10 g/L FeSO₄、2.25 g/L ZnSO₄·7H₂O、1.0 g/L CuSO₄、0.11 g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄、0.23 g/L Na₂B₄O₇·10H₂O、0.35 g/L MnSO₄·H₂O和2.0 g/L CaCl₂·2H₂O组成，全部溶解于0.1 M HCl中。MR培养基组成为：6.67 g/L KH₂PO₄、4 g/L (NH₄)₂HPO₄、0.8 g/L MgSO₄·7H₂O、0.8 g/L C₆H₈O₇、10 mL/L微量元素溶液（TMS）。添加卡那霉素（50 μg/mL）和氨苄青霉素钠（100 μg/mL）以维持相应质粒。
摇瓶培养时，种子培养在含4 mL LB培养基的试管中进行，37°C、200 rpm振荡培养10–12小时。随后转接至含25 mL培养基的250 mL摇瓶中。当细胞光密度（OD₆₀₀）达到0.6–0.8时（此为培养条件优化前使用的参数），加入终浓度为0.2 mM的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导相应基因表达。随后在20°C下继续发酵48小时进行脱氧紫色杆菌素生产。
【数据】M9-YE培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L葡萄糖、2.86 g/L色氨酸；R/2培养基：3 g/L酵母提取物、20 g/L甘油、pH 6.8；抗生素：卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL；种子培养：37°C、200 rpm、10–12 h；诱导：IPTG 0.2 mM、OD₆₀₀ 0.6–0.8；发酵：20°C、48 h
2.3 脱氧紫色杆菌素的补料分批发酵
从LB琼脂平板上挑取单菌落接种至10 mL LB培养基中，37°C、210 rpm振荡培养12小时。选择R/2培养基进行发酵罐培养，因为M9-YE培养基营养相对贫乏，不适合高密度培养。随后将1 mL种子培养液转接至含50 mL R/2培养基的250 mL摇瓶中，30°C、210 rpm培养至OD₆₀₀约为4。将200 mL此种子培养液接种至生物反应器中。当OD₆₀₀达到约28时，加入终浓度为0.2 mM的IPTG进行诱导。发酵过程中pH维持在7.0，溶解氧控制在40%。当葡萄糖浓度降至4 g/L以下且残余色氨酸浓度降至1 g/L以下时开始补料。补料液含600 g/L葡萄糖、200 g/L色氨酸、85 g/L (NH₄)₂SO₄、6 mL/L TMS（微量元素溶液）和8 g/L MgSO₄·7H₂O。
【数据】种子培养：37°C、210 rpm、12 h；二级种子：30°C、210 rpm、OD₆₀₀≈4；接种量：200 mL；诱导条件：OD₆₀₀≈28、IPTG 0.2 mM；发酵控制：pH 7.0、溶解氧40%；补料触发：葡萄糖<4 g/L、色氨酸<1 g/L；补料液：600 g/L葡萄糖、200 g/L色氨酸
2.4 遗传操作
本研究以大肠杆菌MG1655作为基因组修饰的宿主菌株。利用CRISPR-Cpf1基因组编辑系统进行靶向基因组修饰，包括基因敲除和基因整合。以基因敲除为例，以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，将trpR基因上下游片段连接生成供体DNA片段。用引物trpR-N23-F/R将pcrEG质粒中的N23序列替换为靶向trpR特定23-bp区域的互补N23'序列，获得trpR靶向质粒pcrEG-trpR。将pEcCpf1质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中，获得菌株MG1655-pEcCpf1。随后将pcrEG-trpR质粒和供体DNA片段共转化至MG1655-pEcCpf1电转感受态细胞中。相同方案用于敲除其他基因，包括trpL、pheA和yddG。
对于基因整合，使用相应引物对通过重叠PCR组装含有上游同源臂、下游同源臂和vioE表达盒的供体DNA。将所得供体DNA片段和相应靶向质粒通过电穿孔共转化至含pEcCpf1的电转感受态细胞中。通过菌落PCR鉴定阳性重组子，随后通过DNA测序验证。
【数据】编辑系统：CRISPR-Cpf1；基因敲除：trpR、trpL、pheA、yddG；基因整合：vioE表达盒；验证方法：菌落PCR + DNA测序
2.5 分析方法
本研究所用脱氧紫色杆菌素标准品购自AG Scientific, Inc.（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。脱氧紫色杆菌素的LC-MS、¹H NMR和¹³C NMR表征数据见补充信息图S1和图S2。将整个发酵液均质化后取100 μL等分样品。样品以12,000 rpm离心10分钟收集沉淀。沉淀用100%甲醇洗涤两次，随后以12,000 rpm离心5分钟。甲醇完全蒸发后，沉淀通过超声溶解于2 mL二甲基亚砜（DMSO）中（提取后无残留着色）。混合物再次以12,000 rpm离心5分钟，收集上清液。使用分光光度计测量568 nm处吸光度，并根据脱氧紫色杆菌素参考标准品生成的标准曲线进行定量。前脱氧紫色杆菌素（PDV）检测方法改编自Pham所述方法[19]。使用配备ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 × 250 mm，5 μm粒径）和紫外检测器的Agilent 1200系列HPLC系统定量样品中残余色氨酸和PDV浓度。色谱分离在30°C恒温条件下进行。
【数据】离心：12,000 rpm、10 min/5 min；检测波长：568 nm；HPLC：Agilent 1200、C18柱（4.6×250 mm、5 μm）、30°C
2.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
取30 μL发酵上清液与10 μL 5× SDS-PAGE上样缓冲液混合，100°C变性10分钟，12,000 rpm离心5分钟。取20 μL上清液进行SDS-PAGE电泳，随后进行染色和脱色。
【数据】上样量：20 μL；变性：100°C、10 min；离心：12,000 rpm、5 min
研究结果
3.1 脱氧紫色杆菌素生物合成的微生物工厂工程
脱氧紫色杆菌素是由两分子L-色氨酸通过VioABEC介导的生物合成途径合成的吲哚衍生色素。脱氧紫色杆菌素的化学结构如图1A所示。在大肠杆菌中，L-色氨酸由磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）缩合开始合成，随后进入莽草酸途径和色氨酸分支途径（图1A）。已有研究表明，改造色氨酸代谢网络可显著提高紫色杆菌素的生物合成量。Fang等人通过敲除和过表达途径相关基因改善了色氨酸代谢途径，实现了1.75 g/L粗紫色杆菌素的产量。
本研究选择携带脱氧紫色杆菌素生物合成质粒pDVIO的大肠杆菌MG1655作为生产宿主。依次敲除trpR、trpL、tnaA和yddG后获得菌株BDVIO-1至BDVIO-4（表1）。对照菌株BDVIO产生0.34 g/L脱氧紫色杆菌素，而BDVIO-4达到0.64 g/L（图1B），这可能归因于前体可用性的增强。trpR编码trp操纵子的色氨酸阻遏蛋白，其缺失解除色氨酸生物合成基因的转录抑制。trpL前导肽调控trp操纵子的衰减，去除trpL可阻止转录提前终止[20]。此外，tnaA编码色氨酸酶，可将色氨酸降解为吲哚、丙酮酸和氨，因此敲除tnaA可阻断色氨酸分解代谢[21]。yddG基因编码色氨酸外排蛋白，其缺失可增加胞内色氨酸水平，从而有利于脱氧紫色杆菌素的生物合成[22]。
为进一步增强L-色氨酸生物合成的代谢流，在组成型启动子J23119控制下表达了多个反馈抗性突变体aroG（aroG S180F、aroG S211F、aroG D146N、aroG Q151F、aroG L179S）[21,23]和trpE（trpE S40F、trpE Q71K）[24]，获得菌株BDVIO-5至BDVIO-11。其中，携带trpE Q71K的BDVIO-11和携带aroG Q151F的BDVIO-8分别产生0.67 g/L和0.55 g/L脱氧紫色杆菌素。然而，携带trpE Q71K和aroG Q151F双突变的菌株（BDVIO-12）产量略低于相应单突变菌株，达到0.58 g/L（图1C）。aroG受苯丙氨酸反馈抑制，trpE受色氨酸反馈抑制[25]。trpE Q71K替换通过改变酶构象并增加催化活性部分缓解了反馈抑制[17]。类似地，aroG Q151F减少了莽草酸途径中的反馈抑制。然而，这些突变的效果高度依赖于遗传背景。同时解除aroG和trpE的调控可能改变芳香族氨基酸途径内的碳通量分布，从而扰乱胞内代谢平衡，并在竞争性的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸分支之间重新分配中间代谢物。此外，两个单独有益的突变组合可能因限速步骤的转移或代谢网络内的相互作用而产生冲突[26]。这一结果表明，简单堆叠有益突变不一定能提高产量，精细调控代谢通量对于最大化生物合成效率至关重要。据此，选择BDVIO-11（trpE Q71K）作为后续工程改造的起始菌株。
【数据】对照菌株BDVIO产量：0.34 g/L；BDVIO-4产量：0.64 g/L；BDVIO-11（trpE Q71K）产量：0.67 g/L；BDVIO-8（aroG Q151F）产量：0.55 g/L；BDVIO-12（双突变）产量：0.58 g/L；敲除基因：trpR、trpL、tnaA、yddG
3.2 培养条件优化以提高脱氧紫色杆菌素产量
发酵过程优化对于充分发挥工程菌株的遗传潜力至关重要[27]。首先通过在不同细胞密度（OD₆₀₀为0.6、0.8、1.0、1.2和1.5）下诱导来评估诱导时机对脱氧紫色杆菌素产量的影响。OD₆₀₀为1.2时诱导获得最高脱氧紫色杆菌素滴度1.57 g/L，同时也支持更好的细胞生长（图2A和2B）。因此，选择OD₆₀₀为1.2作为最佳诱导点。
随后通过测试终浓度0.02、0.05、0.10、0.15、0.20和0.25 mM的IPTG来确定最佳IPTG浓度。脱氧紫色杆菌素产量随IPTG浓度增加而提高，在0.15 mM时达到最高滴度1.74 g/L。进一步将IPTG浓度提高至0.20 mM使滴度降至1.6 g/L（图2C），表明过度诱导可能扰乱胞内资源分配。据此，选择0.15 mM IPTG作为最佳诱导浓度。
进一步在四种不同培养基（R/2、LB、M9-YE和MR）中评估菌株BDVIO-11的脱氧紫色杆菌素产量。其中，M9-YE支持最高产量，而在MR培养基中仅获得0.12 g/L脱氧紫色杆菌素（图2D）。SDS-PAGE分析进一步证实，由质粒pDVIO编码的脱氧紫色杆菌素生物合成蛋白在M9-YE培养基中表达水平更高（图2E）。因此，选择M9-YE进行后续培养。
随后在摇瓶培养中考察色氨酸补充的影响。测试了7、10、14、18、21和24 mM的色氨酸浓度。随着补充水平增加，脱氧紫色杆菌素滴度分别达到1.32、1.60、1.70、1.79、1.73和1.49 g/L。基于这些结果，确定18 mM色氨酸为最佳补充水平（图2F）。
诱导时机的选择直接影响初级代谢生长与产物生物合成之间胞内代谢通量的分配。OD₆₀₀为1.2时诱导可能提供了平衡的生理状态，确保足够的前体供应和细胞活性以支持高效的异源表达[28]。M9-YE培养基提供了明确限定的营养环境，可最佳地同时支持细胞生长和异源脱氧紫色杆菌素途径的活性。IPTG浓度超过最佳水平导致产量下降，这可能与蛋白质过度表达有关，导致资源竞争和途径通量失衡，从而损害细胞生长[29]。有趣的是，补充24 mM色氨酸并未获得最高滴度。残余色氨酸分析显示，浓度超过18 mM导致利用效率下降并在培养基中积累。这表明产物形成可能不仅受前体可用性限制，还受前体摄取效率限制。由于脱氧紫色杆菌素具有疏水性，可能积累在细胞表面并潜在影响色氨酸转运[30]。这些结果表明，优化途径通量和改善前体利用对于高水平脱氧紫色杆菌素生产至关重要。
【数据】最佳诱导OD₆₀₀：1.2（产量1.57 g/L）；最佳IPTG浓度：0.15 mM（产量1.74 g/L）；IPTG 0.20 mM时产量：1.6 g/L；MR培养基产量：0.12 g/L；色氨酸浓度梯度产量：7 mM→1.32、10 mM→1.60、14 mM→1.70、18 mM→1.79、21 mM→1.73、24 mM→1.49 g/L；最佳色氨酸补充：18 mM
3.3 vioE的染色体整合与启动子优化实现稳定的脱氧紫色杆菌素生产
脱氧紫色杆菌素生物合成途径涉及四种酶：VioA、VioB、VioE和VioC。为初步评估各途径酶对脱氧紫色杆菌素生产的影响，将质粒pDVIOA、pDVIOB、pDVIOE和pDVIOC分别导入菌株BDVIO-11，获得BDVIO13–16（表1）。在这些菌株中，携带pDVIOE的BDVIO-15表现出最高脱氧紫色杆菌素滴度2.21 g/L。而单独过表达VioA、VioB或VioC导致滴度大幅降低，分别仅为0.44、1.5和0.45 g/L（图3A和3B）。已有研究表明VioB可能是紫色杆菌素生物合成途径中的限速酶[31]。然而在本系统中，额外表达VioB并未显著改善脱氧紫色杆菌素产量。这一差异可能归因于途径表达背景或宿主代谢背景的不同，凸显了在特定生产系统中重新评估酶限速步骤的重要性。
【数据】BDVIO-15（pDVIOE）产量：2.21 g/L；VioA过表达产量：0.44 g/L；VioB过表达产量：1.5 g/L；VioC过表达产量：0.45 g/L
3.4 辅因子工程与无膜区室化策略
脱氧紫色杆菌素合成途径中的辅因子机制如图4A所示。在大肠杆菌中，NADPH的生成、再生和利用的代谢途径如图4B所示，从α-酮戊二酸起始的血红素合成途径如图4C所示。
【数据】原文未详述
3.5 五种支架蛋白对合成区室形成和脱氧紫色杆菌素生产的影响
图5显示了五种支架蛋白对合成区室形成和脱氧紫色杆菌素生产的影响。
【数据】原文未详述
3.6 菌株BDVIO-30的补料分批发酵
对菌株BDVIO-30进行补料分批发酵以生产脱氧紫色杆菌素，结果如图6所示。
【数据】原文未详述
3.7 综合工程菌株的最终产量
经多层级代谢工程改造后，菌株BDVIO-30在摇瓶培养中脱氧紫色杆菌素产量达到2.65 g/L，在5 L生物反应器中产量达到11.7 g/L。图7展示了相关结果。
【数据】摇瓶产量：2.65 g/L；5 L生物反应器产量：11.7 g/L
讨论与解读
本研究针对脱氧紫色杆菌素生物合成开发了系统性的多层级代谢工程策略。通过依次敲除trpR、trpL、tnaA和yddG，结合trpE和aroG的定点突变，并引入异源脱氧紫色杆菌素生物合成途径，获得了最优宿主菌株。这些修饰强化了内源色氨酸生物合成途径，增强了脱氧紫色杆菌素生产的前体供应。系统优化了关键培养参数以确定合适的发酵条件。在酶水平和染色体整合层面进行调控，将关键基因以不同强度的组成型启动子整合至染色体中。同时应用辅因子再生策略改善胞内氧化还原平衡并支持途径通量。最后考察了无膜区室化对途径性能的影响。最终菌株BDVIO-30在摇瓶培养中实现2.65 g/L的脱氧紫色杆菌素滴度，在5 L生物反应器中实现11.7 g/L。本研究展示了一种有效的大肠杆菌脱氧紫色杆菌素生产多层级代谢工程策略，并强调了整合多个调控层对提高途径效率和细胞代谢平衡的协同效应。
编译者解读：该研究展现了典型的"多层级逐步优化"合成生物学思路——从前体供给、培养条件、酶表达水平到辅因子平衡和空间组织，层层递进地消除生产瓶颈。值得注意的是，研究者发现简单叠加有益突变（trpE Q71K + aroG Q151F）反而降低产量，这一反直觉结果提醒我们代谢网络的复杂性。无膜区室化策略的引入体现了从"酶工程"向"空间组织工程"的思维延伸。从应用角度看，11.7 g/L的发酵罐产量已具备一定的工业化潜力，但后续仍需关注色素提取工艺的简化和规模化生产成本控制。
参考来源
Wang C. Stepwise metabolic engineering enables high-level production of deoxyviolacein as a natural pigment in Escherichia coli. Dyes and Pigments, 2026. DOI: 10.1016/j.dyepig.2026.113930
DOI: 10.1016/j.dyepig.2026.113930