来源：Transcriptional and translational optimization for enhancing β-galactosidase expression in bacillus subtilis（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
低聚半乳糖（GOS）是重要的功能性低聚糖，在食品、农业和制药领域应用广泛。本研究从肠杆菌属HK169中鉴定出一种GH2家族β-半乳糖苷酶（Ensp β-gal），纯化酶比活力达527.30 U/mg，GOS产率46.03%。随后在食品级枯草芽孢杆菌中开展系统性的转录与翻译优化——筛选14个启动子、12个5′非翻译区（5′-UTR）和17个N端编码序列（NCS），组合工程菌株BS-β-galS17摇瓶发酵酶活达584.15 U/mL，较对照提高57.24倍，为目前枯草芽孢杆菌中报道的最高β-半乳糖苷酶发酵酶活。
研究背景
低聚半乳糖由2–8个半乳糖残基通过糖苷键连接而成，还原端含一个末端葡萄糖残基，糖链主要通过β-(1→3)、β-(1→4)或β-(1→6)糖苷键连接。作为高效食品级益生元，GOS能选择性促进双歧杆菌和乳杆菌等有益肠道菌群的增殖与定殖，提升短链脂肪酸产量、降低结肠pH、抑制肠道病原菌生长，并具有抗结直肠癌、促进钙吸收和降低胆固醇等生物活性。GOS常与益生菌复配为合生元，广泛用于婴儿营养品。其理化特性优良——低热量（1.73 kcal/g）、中等甜度（蔗糖甜度的30%–60%）、优异的水溶性和高热稳定性，支撑其在食品、畜牧和水产养殖业的广泛应用。β-半乳糖苷酶（β-gal）是可持续生物合成GOS的关键生物催化剂，提高其在食品级宿主中的表达水平对降低GOS生产成本具有重要意义。
研究方法
2.1 质粒、菌株与试剂
本研究所用宿主菌株包括大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌DH5α和枯草芽孢杆菌WG600，均由实验室保存（菌株详细信息见表S1）。基因合成由北京擎科生物科技有限公司完成。重组质粒鉴定测序由金唯智（苏州）完成。实验所用化学试剂均为分析纯，购自生工生物工程（上海）股份有限公司和国药集团化学试剂有限公司。Bradford蛋白定量试剂盒由碧云天生物技术（上海）有限公司提供。质粒提取和DNA凝胶回收试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
【数据】菌株：E. coli BL21(DE3)、E. coli DH5α、B. subtilis WG600；试剂纯度：分析纯
2.2 Ensp β-gal的克隆、表达与纯化
编码Ensp β-gal的基因（GenBank登录号：WP_069303746.1）经化学合成并扩增后，通过无缝克隆连接至pET-28a(+)载体。目标蛋白C端融合6×His标签以便后续纯化。将构建的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行异源蛋白生产。重组菌株在含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中、37°C、200 rpm振荡培养。当OD600值达到0.6–0.8时，加入1 mM IPTG诱导蛋白表达，随后在28°C继续培养8小时。离心收集菌体并经超声破碎。His标签标记的Ensp β-gal通过Ni-NTA亲和层析柱（1.6 cm × 20 cm）纯化，使用三种缓冲液：结合缓冲液（50 mM HEPES，500 mM NaCl，pH 7.5）、补充额外50 mM咪唑的洗涤缓冲液和含额外500 mM咪唑的洗脱缓冲液。洗脱蛋白级分依次在含或不含10 mM EDTA的50 mM HEPES缓冲液中透析，以去除残留咪唑和金属离子。最后采用Bis-Tris SDS-PAGE和Bradford法分别表征纯化Ensp β-gal的纯度并定量其浓度。
【数据】载体：pET-28a(+)；标签：C端6×His；培养基：LB（50 μg/mL卡那霉素）；培养条件：37°C、200 rpm；诱导：1 mM IPTG，28°C、8 h；纯化：Ni-NTA柱（1.6 cm × 20 cm）；缓冲液：结合液50 mM HEPES/500 mM NaCl pH 7.5，洗涤液含50 mM咪唑，洗脱液含500 mM咪唑；透析：50 mM HEPES ± 10 mM EDTA
2.3 酶学性质测定
酶活力单位（U）定义为在特定实验条件下每分钟水解1 μmol oNPG所需的酶量。反应体系含900 μL以100 mM HEPES缓冲液（pH 7.5）配制的15 mM oNPG底物，与100 μL纯化的Ensp β-gal混合。发酵酶活测定时，取100 μL稀释发酵液（含菌体和上清）进行测量。酶促反应在55°C孵育5分钟，随后加入1 mL 1 mol/L碳酸钠溶液终止反应。产生的邻硝基苯酚通过Tecan Infinite 200pro酶标仪在420 nm波长处定量测定。
为系统表征Ensp β-gal的生化特性，配制四种缓冲液体系（各100 mM），在50°C下覆盖pH 5.5–9.0范围，包括醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 5.5–6.0）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.0–7.5）、HEPES-NaOH缓冲液（pH 6.5–8.0）和Tris-HCl缓冲液（pH 7.0–9.0）。此外，在pH 7.5条件下测定酶的最适温度，范围为35–60°C。为考察金属离子对Ensp β-gal活性的影响，在最适pH和温度条件下，将各种金属离子试剂（包括Na⁺、K⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺和Fe³⁺）分别以1 mM终浓度加入反应体系。以不添加金属离子测定的酶活力为对照组，其相对酶活力定义为100%。Ensp β-gal的热稳定性在40–50°C下评估，另设一组在50°C下补充1 mM Mg²⁺。纯化酶液在上述温度下孵育，每隔10–60分钟取样测定残余酶活力。以oNPG为底物，设置0.1 mM至50 mM的底物浓度梯度进行酶促反应以测定Ensp β-gal的动力学参数。检测各组反应速率，通过非线性回归分析计算米氏常数（K_m）和抑制常数（K_i）等动力学指标。
【数据】底物：15 mM oNPG（100 mM HEPES pH 7.5）；反应：55°C、5 min；终止：1 mL 1 mol/L Na₂CO₃；检测波长：420 nm；pH范围：5.5–9.0（四种缓冲体系）；温度范围：35–60°C；金属离子浓度：1 mM；热稳定性：40–50°C，10–60 min取样；底物浓度：0.1–50 mM
2.4 乳糖生物转化合成GOS
为最大化GOS产率，在GOS合成体系中添加1 mM Mg²⁺并进行系统优化。采用单因素实验优化温度（45–65°C）、pH（6.0–8.5）、底物浓度（100–300 g/L）和酶用量（0.05–0.25 mg/mL）。乳糖含量通过配备示差折光检测器（RID）的高效液相色谱（HPLC）系统定量，使用Hypersil™ APS-2 Amide色谱柱。半乳糖和葡萄糖通过同一HPLC-RID系统分析，使用Rezex™ ROA-Organic Acid H⁺色谱柱进行分离。GOS浓度按下式计算：初始底物浓度减去残留乳糖、葡萄糖和半乳糖浓度之和。GOS产率定义为GOS浓度与初始底物浓度的比值。
【数据】Mg²⁺添加量：1 mM；温度范围：45–65°C；pH范围：6.0–8.5；乳糖浓度：100–300 g/L；酶用量：0.05–0.25 mg/mL；检测：HPLC-RID（Hypersil™ APS-2 Amide柱；Rezex™ ROA-Organic Acid H⁺柱）
2.5 枯草芽孢杆菌摇瓶培养表达Ensp β-gal
挑取重组枯草芽孢杆菌单菌落，接种至4 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中。液体培养基含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl，菌株在37°C、200 rpm振荡培养12小时。随后将种子培养物转接至50 mL TB培养基中进行发酵培养。TB培养基组成为12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、12.54 g/L K₂HPO₄和2.31 g/L KH₂PO₄。培养在33°C、200 rpm条件下进行60小时，以实现Ensp β-gal的异源表达。
【数据】种子培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，50 μg/mL卡那霉素）；种子培养：37°C、200 rpm、12 h；发酵培养基：TB（12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、12.54 g/L K₂HPO₄、2.31 g/L KH₂PO₄）；发酵条件：33°C、200 rpm、60 h
2.6 启动子优化
为进一步提高Ensp β-gal的表达水平，选取十四个强组成型启动子（P_amyE、P_hemA、P_Hpall、P_mmgA、P_odhA、P_phrE、P_sdhB、P_secA、P_spoVG、P_srfAA、P_veg、P_yceC、P_yqfD和P_yvyD）替换原始P43启动子进行启动子工程（表S2），构建一系列重组质粒。所有重组质粒均转化至枯草芽孢杆菌WG600中异源表达Ensp β-gal。摇瓶培养60小时后，收集所有重组菌株测定OD600值和总酶活。
【数据】启动子数量：14个；宿主：B. subtilis WG600；培养时间：60 h
2.7 5′-UTR优化
对于5′-UTR修饰，使用此前研究中报道的八个已优化5′-UTR序列（UTR3、UTR4、UTR6、UTR7、UTR8、UTR10、UTR12和UTR13）以及四个自行设计的5′-UTR序列（UTR-H1、UTR-H2、UTR-M1和UTR-M2）替换pP43NMK载体的天然5′-UTR（表S3），构建另一系列重组质粒。所有重组质粒均转化至枯草芽孢杆菌WG600中异源表达Ensp β-gal。摇瓶培养60小时后，收集所有重组菌株测定OD600值和发酵酶活。
【数据】5′-UTR数量：12个（8个已报道+4个自行设计）；宿主：B. subtilis WG600；培养时间：60 h
2.8 NCS优化
在NCS优化方面，将十七种不同的NCS（glnA、glnA-30bp、glnA-Up、Hag、Hag-30bp、Hag-Up、yvyD、yvyD-30bp、yvyD-Up、rsbV、rsbV-30bp、rsbV-Up、机器学习衍生序列MLD40、MLD42、MLD47、MLD62和MLD62-30bp）分别融合至Ensp β-gal基因的5′末端（表S4），构建另一系列重组质粒。所有重组质粒均转化至枯草芽孢杆菌WG600中异源表达Ensp β-gal。摇瓶培养60小时后，收集所有重组菌株测定OD600值和发酵酶活。
【数据】NCS数量：17个；宿主：B. subtilis WG600；培养时间：60 h
研究结果
3.1 Ensp β-gal的挖掘与氨基酸序列分析
选择阴沟肠杆菌来源的β-半乳糖苷酶（GenBank登录号：WFG05994.1）作为参考酶，原因在于其较高的GOS合成能力（51.73%）以及与其他GH2酶相比显著的突变工程潜力。虽然其他β-gal（如环状芽孢杆菌来源的酶）表现出优异的GOS产率，但它们已被高度商业化，发现新结构见解或工程潜力的空间相对有限。选取活性位点的三个关键氨基酸残基（E463、E539和H542）作为特征探针。随后使用在线平台EnzymeMiner对β-gal进行序列挖掘，最终鉴定出一种来自肠杆菌属HK169的新型β-gal。编码Ensp β-gal的基因（GenBank登录号：WP_069303746.1）通过PCR扩增克隆。全长基因由3090 bp组成，编码1029个氨基酸残基，理论分子量为116.8 kDa，等电点（pI）为5.73。
如图1A所示，序列同一性分析表明Ensp β-gal属于GH2家族。该酶与其他GH2成员共享超过65.49%的序列同一性，与阴沟肠杆菌来源的β-gal（GenBank登录号：WFG05994.1）序列同一性最高，达83.77%。Ensp β-gal与已解析结构的E. coli K12 β-gal（PDB ID：8RI6）序列同一性超过65.49%。据此，以8RI6晶体结构为模板，通过同源建模构建了Ensp β-gal的三维结构模型。此外，Ensp β-gal活性位点的关键残基如D203、H393、E418、H420、N462、E463、E539、H542、W570、F603、G799和W1004高度保守（图1B）。多种β-gal的多序列比对见图S1，表明这十二个关键残基在所有比对的酶中严格保守。
【数据】基因长度：3090 bp；氨基酸数：1029；理论分子量：116.8 kDa；pI：5.73；与E. cloacae β-gal序列同一性：83.77%；与E. coli K12 β-gal（PDB 8RI6）序列同一性：>65.49%；保守残基：12个
3.2 Ensp β-gal的生化表征
Ensp β-gal的最适反应温度为55°C，在45–60°C温度范围内酶保持超过59.01%的相对活性（图2A）。最适pH为7.5，在HEPES-NaOH缓冲液体系中观察到最大活性。在HEPES-NaOH和PBS缓冲液中，pH 6.0–8.0范围内相对酶活保持在69.04%以上。金属离子测定显示，Cu²⁺和Zn²⁺完全抑制酶活性，而Na⁺和K⁺表现出轻微激活效应。其中Mg²⁺的激活效应最强，相对活性达121.32%，与先前报道的Mg²⁺可增强β-gal活性的结果一致。在40–45°C孵育1小时后，Ensp β-gal保留超过75.65%的初始活性。然而在50°C下，酶的半衰期（t₁/₂）小于10分钟。添加Mg²⁺显著改善了其热稳定性，将t₁/₂延长至约50分钟。Lactobacillus sakei Lb790来源的β-gal也有类似的Mg²⁺热稳定性增强报道，补充Mg²⁺有效提高了其热耐受性。在最适反应条件下，Ensp β-gal对oNPG的比活力达527.30 U/mg。以oNPG为底物（浓度0.1–50 mM）研究Ensp β-gal的动力学特性，酶促动力学符合底物抑制模型，K_m和K_i分别为32.93 mM和4.98 mM（图S2）。
对于GOS合成（图3），在60°C、pH 7.5（HEPES缓冲液）、酶用量0.1 mg/mL、乳糖浓度300 g/L的最优条件下，最大GOS产率达46.03%。与其他GH2家族β-gal相比（表S5和表2），K. oryzendophytica来源的β-gal比活力为288.6 U/mg，GOS产率41.6%；Pseudomonas tritici SWRI145来源的β-gal比活力达331.9 U/mg，GOS产率44.8%；阴沟肠杆菌来源的β-gal则实现了51.73%的良好GOS产率，但其水解比活力相对较低，为248.36 U/mg。此外，阴沟肠杆菌β-gal催化的GOS合成反应在孵育24小时后达到平衡。
【数据】最适温度：55°C；45–60°C相对活性>59.01%；最适pH：7.5（HEPES-NaOH）；pH 6.0–8.0相对活性>69.04%；Cu²⁺/Zn²⁺：完全抑制；Mg²⁺相对活性：121.32%；40–45°C孵育1 h残余活性>75.65%；50°C半衰期<10 min；50°C + Mg²⁺半衰期≈50 min；比活力：527.30 U/mg；K_m：32.93 mM；K_i：4.98 mM；GOS最优条件：60°C、pH 7.5、0.1 mg/mL酶、300 g/L乳糖；GOS产率：46.03%
3.3 Ensp β-gal在枯草芽孢杆菌中的表达
作为食品级表达底盘，枯草芽孢杆菌是生产参与功能性糖生物合成酶类的理想宿主。本研究将编码Ensp β-gal的基因插入携带组成型P43启动子的pP43NMK载体中，所得质粒转化至枯草芽孢杆菌WG600。重组菌株命名为BS-β-gal，作为后续实验的对照。发酵酶活在pH 7.5和55°C条件下测定。培养60小时后最大发酵酶活达10.03 U/mL，对应OD600值为12.45。
【数据】对照菌株：BS-β-gal；最大发酵酶活：10.03 U/mL；OD600：12.45；培养时间：60 h；测定条件：pH 7.5、55°C
3.4 启动子筛选的转录调控
启动子工程是在转录水平精确调控基因表达的经典策略，常用于提高目标蛋白产量。本研究从枯草芽孢杆菌中选取十四个内源启动子，即P_amyE、P_hemA、P_Hpall、P_mmgA、P_odhA、P_phrE、P_sdhB、P_secA、P_spoVG、P_srfAA、P_veg、P_yceC、P_yqfD和P_yvyD，替换pP43NMK载体的天然P43启动子以驱动Ensp β-gal基因的异源表达。构建的重组质粒转化至枯草芽孢杆菌WG600感受态细胞，生成十四个不同启动子替换的重组菌株，命名为BS-β-galP1至BS-β-galP14。
如图4所示，大多数筛选的启动子对Ensp β-gal在枯草芽孢杆菌中的表达表现出抑制作用。携带P_mmgA和P_veg的菌株几乎检测不到发酵酶活。值得注意的是，仅有四个候选启动子即P_phrE、P_srfAA、P_yceC和P_yvyD显著提高了Ensp β-gal的发酵酶活，分别提高4.26倍、3.01倍、3.02倍和2.38倍。在这些变体中，由P_phrE启动子驱动的重组菌株BS-β-galP06实现了最大发酵酶活52.80 U/mL。
【数据】P_phrE提高倍数：4.26倍；P_srfAA：3.01倍；P_yceC：3.02倍；P_yvyD：2.38倍；BS-β-galP06最大发酵酶活：52.80 U/mL
3.5 5′-UTR筛选的转录调控
5′-UTR是原核生物中关键的转录后调控元件，调节核糖体与Shine-Dalgarno（SD）序列及起始密码子的结合效率。Xiao等人证明，通过优化热力学稳定性和SD序列可及性对地衣芽孢杆菌中通用5′-UTR进行系统工程改造，可显著增强蛋白表达。工程化5′-UTR含有不同折叠自由能的发夹结构，将SD序列定位于单链环区，促进核糖体结合同时保护mRNA免受RNase介导的降解。本研究选取八个经功能验证的优化5′-UTR（UTR3、UTR4、UTR6、UTR7、UTR8、UTR10、UTR12和UTR13），另设计四个新型5′-UTR（结构见图S3）。这十二个优化5′-UTR分别替换pP43NMK载体的原始5′-UTR以评估其对Ensp β-gal表达的影响，成功构建重组菌株BS-β-galU01至BS-β-galU12。
在构建的菌株中，除UTR3、UTR-H1和UTR-H2外，几乎所有测试的5′-UTR元件均显著提高了发酵酶活（图5）。携带UTR4、UTR7、UTR10和UTR13的菌株表现出最显著的增强效果，酶活提高倍数分别为…
【数据】5′-UTR数量：12个；显著提高酶活的5′-UTR：UTR4、UTR7、UTR10、UTR13；无显著效果：UTR3、UTR-H1、UTR-H2
3.6 NCS优化的翻译调控
（原文此部分节选缺失，以下按已提供内容忠实呈现可获取信息——NCS优化实验方法已在2.8详述，图6展示各NCS优化重组菌株的构建与分析结果。）
【数据】NCS数量：17个；来源：glnA、Hag、yvyD、rsbV衍生序列及机器学习序列MLD40/42/47/62等
3.7 多元件协同组合优化
在最优启动子P_phrE控制下，对NCS和5′-UTR进行协同多元件组合工程改造，构建并分析了系列重组菌株（图7）。其中携带UTR13 5′-UTR和glnA-30bp NCS的最优重组菌株BS-β-galS17在摇瓶培养中实现了最大发酵酶活584.15 U/mL，较对照菌株提高57.24倍。这是迄今为止枯草芽孢杆菌中报道的最高β-半乳糖苷酶发酵酶活。
【数据】最优菌株：BS-β-galS17（P_phrE + UTR13 + glnA-30bp NCS）；最大发酵酶活：584.15 U/mL；提高倍数：57.24倍
3.8 发酵液直接催化GOS合成
利用菌株BS-β-galS17的发酵液直接催化D-乳糖合成GOS，进行时间进程分析（图8）。发酵液直接催化GOS合成，GOS产率达44.04%。
【数据】GOS产率：44.04%；催化方式：发酵液直接催化
讨论与解读
本研究鉴定了一种GH2家族β-半乳糖苷酶Ensp β-gal，该酶表现出527.30 U/mg的良好比活力和46.03%的GOS产率。在食品级枯草芽孢杆菌中异源表达后，初始发酵酶活仅10.03 U/mL。通过启动子、5′-UTR和NCS的系统组合工程，β-gal发酵酶活被有效提升至584.15 U/mL，较起始菌株提高57.24倍。工程菌株BS-β-galS17在摇瓶培养中表现出高β-gal表达效率和突出的GOS合成能力（发酵液直接催化获得44.04%的GOS产率）。虽然目前缺乏高细胞密度发酵数据限制了即时工业应用，但这些摇瓶结果证实了组合遗传元件工程的有效性。未来研究将聚焦于实验室规模生物反应器中的过程优化（如pH、溶解氧和补料策略），以恰当评估其可放大性并将这一潜力转化为绿色大规模工业生产。此外，后续工作还将关注该酶的信号肽和分泌途径工程，以实现高效的胞外酶生产并进一步简化GOS的下游加工。
编译者解读
本研究展示了一条清晰的合成生物学提升路径：先通过酶挖掘获得性能优良的GH2 β-gal，再以食品级枯草芽孢杆菌为底盘进行"启动子→5′-UTR→NCS"的逐层精细调优，最终实现57倍以上的表达提升。三种遗传元件的系统筛选策略具有良好可移植性，可为其他功能糖合成酶的异源表达提供方法参考。值得注意的是，发酵液直接催化GOS合成（44.04%产率）简化了酶纯化步骤，贴近工业应用场景。局限在于目前数据均来自摇瓶培养，高密度发酵的放大表现尚待验证；此外，多轮筛选的工作量较大，未来若结合高通量自动化筛选或机器学习预测，有望进一步提升优化效率。
参考来源
Cheng Z. Transcriptional and translational optimization for enhancing β-galactosidase expression in bacillus subtilis. Food Bioscience, 2026. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109750
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109750