来源：Integrated control of redox and energy metabolism by the membrane-bound and soluble transhydrogenases of Pseudomonas putida across metabolic regimes（Cell Systems）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
氧化还原稳态是微生物适应环境胁迫的核心，但转氢酶在多数生物中的作用仍不清楚。本研究以恶臭假单胞菌KT2440为模型，揭示了膜结合型PntAB与可溶型SthA两套转氢酶如何协同构建灵活可逆的氧化还原平衡系统。研究发现双缺失株生长缺陷、能荷紊乱、谷胱甘肽池严重耗竭；SthA对乙酸盐同化不可或缺；两酶共同介导甲酸盐耐受。该工作为C1代谢工程与氧化还原密集型生物制造提供了设计原理。
研究背景
氧化还原稳态驱动着生命体的多项核心代谢过程。NAD(H)与NADP(H)作为还原当量的载体，在所有生命域中都是保守的枢纽代谢物。细菌通过酶促平衡机制将NADH/NAD⁺和NADPH/NADP⁺比值维持在严格界定的浓度范围内，为合成代谢与分解代谢提供所需的氧化还原电位。转氢酶正是负责氧化还原平衡的关键酶类之一——它们催化NAD(H)与NADP(H)之间的氢负离子转移。转氢酶分为两型：易位H⁺的膜结合型转氢酶Pnt与含FAD的可溶型转氢酶Sth。在大肠杆菌中，PntAB被认为主要生成NADPH供生物合成使用，而SthA通过生成NADH供氧化磷酸化来消散多余的NADPH。然而，转氢酶的可逆程度可能因菌种代谢架构与营养条件的不同而存在差异。越来越多的体内外研究正在挑战膜结合型与可溶型转氢酶之间严格功能分工与方向性分离的传统观点。
研究方法
菌株与培养条件
本研究所用菌株、质粒及寡核苷酸分别列于表S6–S8。恶臭假单胞菌KT2440及其衍生缺失株作为定量生理学实验的主要模型，大肠杆菌DH5α λpir用作克隆宿主。ΔpntAB、ΔsthA与ΔpntAB ΔsthA菌株由Nikel等人此前构建，对应缺失的存在经菌落PCR验证（图S10）。所有菌株均在LB或最低盐培养基（MSM）中、30°C、250 rpm条件下培养，MSM配制方法如前所述。MSM中根据实验需要添加特定碳源，确保最终培养基中总碳原子为120 mM。具体使用浓度如下：15 mM辛酸钠、17 mM苯甲酸钠、20 mM葡萄糖、果糖或柠檬酸钠、24 mM谷氨酸钠或核糖、30 mM琥珀酸二钠、40 mM乳酸钠、丙酮酸钠或甘油。乙酸盐实验提供60 mM乙酸钠。通过向培养基中添加240 mM甲酸钠评估甲酸盐对细菌生长和生理参数的影响。向含葡萄糖的MSM中添加5 mM H₂O₂诱导氧化应激。生长测定在Epoch2微孔板读数仪（BioTek Instruments Inc.，美国）中进行，使用150 μL细胞悬液（初始OD600约0.05），覆盖50 μL无菌矿物油；或在相同初始光密度下于带挡板锥形瓶中培养。摇瓶培养在250 mL锥形瓶中进行，含40 mL相应培养基，30°C、250 rpm。遗传操作期间质粒与菌株筛选使用卡那霉素和庆大霉素，终浓度分别为50 μg mL⁻¹和10 μg mL⁻¹。代谢组学培养在20 mL Pioreactors（Pioreactor Inc.，加拿大）中进行，批式模式、30°C、磁力搅拌1,000 rpm，全程在线记录OD600与比生长速率。实验中所有恶臭假单胞菌菌株均在含20 mM葡萄糖或60 mM乙酸盐作为碳源的MSM中生长。
【数据】培养基：LB/MSM；温度：30°C；转速：250 rpm；碳源总碳原子：120 mM；辛酸钠：15 mM；苯甲酸钠：17 mM；葡萄糖/果糖/柠檬酸钠：20 mM；谷氨酸钠/核糖：24 mM；琥珀酸二钠：30 mM；乳酸钠/丙酮酸钠/甘油：40 mM；乙酸钠：60 mM；甲酸钠：240 mM；H₂O₂：5 mM；卡那霉素：50 μg mL⁻¹；庆大霉素：10 μg mL⁻¹；Pioreactor转速：1,000 rpm
体外酶活测定
细胞裂解液从10 mL培养物中制备，培养条件为MSM中添加20 mM葡萄糖作为唯一碳源，30°C、250 rpm。使用三批独立培养物获得生物学三重重复用于酶学测试。当OD600达到0.9–1.1时，4,000×g离心8 min（4°C）收集细胞，用50 mM Tris·HCl缓冲液（pH = 8.0）洗涤一次，重悬于1 mL同种缓冲液中，经玻璃珠涡旋破碎（425–600 μm玻璃珠；Sigma-Aldrich Co.，货号G87721），交替进行六轮1 min涡旋与1 min冰浴静置。裂解后13,000×g离心3 min（4°C）去除细胞碎片。每份裂解液的总蛋白浓度以Bradford试剂（Sigma-Aldrich Co.，货号B6916）按制造商方案在微孔板读数仪中通过Pierce牛血清白蛋白（Thermo Fisher Scientific，货号23209）已知标准品的插值法进行定量。裂解液样品中转氢酶活性在400 nm波长下测定，使用NAD⁺与NADP⁺的硫代类似物以区分硫代烟酰胺（替代）辅因子的还原与天然还原型辅因子的干扰。酶学测定通过向微孔板读数仪孔中加入180 μL裂解液、37°C孵育5 min、再加入20 μL底物混合物启动反应。混合物含有20 mM thioNAD⁺与10 mM NADPH以监测thioNADH生成（200 μL反应体积中终浓度分别为1 mM thioNAD⁺与0.5 mM NADPH），或含有10 mM thioNADP⁺与40 mM NADH以监测thioNADPH生成（终浓度分别为0.5 mM thioNADP⁺与2.0 mM NADH）。
【数据】培养体积：10 mL；碳源：20 mM葡萄糖；OD600收获范围：0.9–1.1；离心：4,000×g、8 min、4°C；裂解缓冲液：50 mM Tris·HCl、pH 8.0；玻璃珠：425–600 μm；破碎循环：6轮×1 min涡旋+1 min冰浴；二次离心：13,000×g、3 min、4°C；酶活测定波长：400 nm；反应温度：37°C；孵育时间：5 min；thioNAD⁺终浓度：1 mM；NADPH终浓度：0.5 mM；thioNADP⁺终浓度：0.5 mM；NADH终浓度：2.0 mM；反应体积：200 μL
研究结果
单一转氢酶变体足以支撑多种培养条件下的细胞适应性
为考察PntAB与SthA在恶臭假单胞菌KT2440中的作用，本研究使用了实验室此前为研究芳香族化合物降解相关氧化还原负担而构建的转氢酶缺失菌株（ΔpntAB、ΔsthA和ΔpntAB ΔsthA）。在第一组实验中，以细胞生长和生理参数为指标，比较了野生型（WT）菌株与转氢酶突变体在富培养基（LB）和含不同碳源的MSM中的表型（图2A）。所有菌株在LB中生长一致，表明两种转氢酶在营养丰富条件下对生长均非必需。ΔpntAB与ΔsthA单突变体在MSM中以葡萄糖为唯一碳源时的生长参数也与WT高度接近（表S1）。相比之下，双突变体ΔpntAB ΔsthA的生长比WT慢约36%（图2A）。单突变体生长不受影响首先提示转氢酶反应在体内具有部分可逆性，尽管其他代谢酶的活性也可能参与转氢作用。
为检验上述可能性，使用thioNAD(P)⁺作为底物在细胞裂解液中测定了定向电子传递（图2B）。硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其磷酸化形式分别是NAD⁺与NADP⁺的硫酮修饰衍生物，可作为底物类似物研究氢负离子转移反应。该方法此前已用于测定棕色固氮菌SthA（与恶臭假单胞菌酶约90%同一性）的动力学参数——使用天然与硫代烟酰胺辅因子所得动力学参数值相当。本研究采用该体外测定法获取恶臭假单胞菌裂解液中转氢可逆性的证据。在WT菌株背景下，总体转氢作用偏向NADH生成，速率是NADPH生成的3.5倍（thioNADH与thioNADPH分别为6.2 ± 0.7与1.8 ± 0.3 μmol mg蛋白⁻¹ min⁻¹）。ΔpntAB裂解液中的转氢速率与WT相当，提示PntAB在该菌株中无活性，或该转氢酶在葡萄糖培养的WT细胞中因丰度低而贡献较小。该结果也揭示SthA在PntAB缺失时能够催化可逆的转氢反应。这一结果可从热力学角度理解，尽管体内实际转氢活性还受酶动力学参数与底物实际浓度的进一步约束。如前述，这些测定中未系统调查蛋白丰度，可能影响转氢通量的表观方向性。在细菌中，NADP⁺/NADPH比值维持在约0.8–1.5，而NAD⁺/NADH比值维持在约10–20。鉴于反应NAD⁺ + NADPH ↔ NADP⁺ + NADH的K_eq约等于1，体内该反应可能处于非平衡状态，有利于可溶型转氢酶生成NADP⁺ + NADH。PntAB为唯一转氢酶的裂解液（即ΔsthA菌株）表现出极低的转氢速率，因为细胞破碎过程中H⁺梯度偶联已丧失。在这些ΔsthA裂解液中，thioNADH生成的转氢速率较WT裂解液低约40倍，thioNADPH积累低约15倍。双突变体裂解液在两个方向上均无活性（较WT转氢速率分别低约120倍与50倍），证实没有其他可溶酶能介导NAD(P)H与NAD(P)⁺之间的氢负离子转移。
为进一步阐明转氢酶的生理作用，WT菌株与突变体在含不同碳源的MSM中生长（表S1）。所选底物在碳数（C2至C8）、还原度（γ，即给定分子中每个碳原子可用的还原当量数）及进入中心代谢的入口点方面均有差异（图1A）。为跨条件比较所有实验菌株，以最大细胞密度（以600 nm光密度[OD600]估算）与比生长速率绘制细胞适应性图（图2C；单条生长曲线见图S1）。除在乙酸盐或苯甲酸盐上生长的ΔsthA外，两个单突变体均维持与WT相似的细胞适应性（图2C，浅红色阴影区）。相比之下，双突变体在所测试的12种碳源中的10种上表现出降低的适应性（图2C，蓝色阴影区内绿色数据点），表明任一转氢酶都足以支撑大多数环境条件下的生长。两个适应性严重受损的明显例外是乙酸盐与核糖。消除SthA完全 abolish 了乙酸盐依赖型生长。核糖上的生长即使双突变体也不受影响，这可能反映了恶臭假单胞菌天然缓慢的核糖依赖型生长——此时基于其他天然脱氢酶的较慢替代性氧化还原平衡机制可能已足够。
为直接评估转氢酶缺失对辅因子平衡的影响，定量了各菌株中烟酰胺辅因子（即NAD⁺、NADP⁺、NADH与NADPH）、腺嘌呤核苷酸（即AMP、ADP与ATP）及谷胱甘肽类物质（氧化型谷胱甘肽[GSSG]与还原型谷胱甘肽[GSH]）的胞内含量（图2D与图S2）。单突变体的氧化还原辅因子比值与能量状态均无重大变化，所有数值与WT处于同一范围（表S2）。相比之下，ΔpntAB ΔsthA的NAD⁺与ATP水平较WT低32%，而NADP⁺、ADP与AMP升高31%–45%。两个单缺失菌株（ΔpntAB与ΔsthA）的GSSG含量均降低（约为WT的50%–60%），而双突变体降至30%以下。GSH含量在单突变体中基本不变，但双突变体降低50%，提示两种酶各自都不单独作为主要NADPH来源，但二者在维持GSH池方面均发挥作用。ΔpntAB ΔsthA菌株无法维持稳定的辅因子比值，加上严重的GSH耗竭——这在任一单突变体中都未观察到——促使研究者测试两种转氢酶是否都能提供还原力以平息氧化应激。抗氧化应激的主要防御机制——谷胱甘肽还原酶与谷胱甘肽过氧化物酶——依赖NADPH再生成谷胱甘肽池（GSSG → 2GSH），作为关键胞内氧化还原缓冲系统（图2E）。为确定是一种还是两种转氢酶为此功能再生成NADPH，比较了各菌株在5 mM H₂O₂存在下的生长（图2F）。在氧化应激条件下，细胞适应性遵循与无应激时相同的总体趋势。SthA与PntAB似乎都不被单独优先需要用于生成NADPH以供谷胱甘肽还原——ΔpntAB、ΔsthA与WT的延迟期（λ）相当。相比之下，暴露于H₂O₂时双突变体ΔpntAB ΔsthA的λ比WT和单突变体长3倍，提示高效维持GSH池需要两种转氢酶通过NADPH再生成共同发挥作用。
【数据】LB生长：各菌株一致；葡萄糖MSM中ΔpntAB ΔsthA生长减慢：约36%；WT转氢速率（thioNADH）：6.2 ± 0.7 μmol mg蛋白⁻¹ min⁻¹；WT转氢速率（thioNADPH）：1.8 ± 0.3 μmol mg蛋白⁻¹ min⁻¹；NADP⁺/NADPH体内比值：约0.8–1.5；NAD⁺/NADH体内比值：约10–20；ΔsthA裂解液thioNADH生成降低：约40倍；ΔsthA裂解液thioNADPH积累降低：约15倍；双突变体thioNADH降低：约120倍；thioNADPH降低：约50倍；适应性受损碳源数：10/12；ΔpntAB ΔsthA的NAD⁺与ATP降低：32%；NADP⁺/ADP/AMP升高：31%–45%；单突变体GSSG：WT的50%–60%；双突变体GSSG：<30%；双突变体GSH降低：50%；H₂O₂条件下双突变体λ延长：3倍
可溶型转氢酶SthA为乙酸盐同化所必需，但适应性实验室进化后可免除
sthA缺失 abolish 了恶臭假单胞菌在乙酸盐上的生长（图2C），引出了可溶型转氢酶在该C2底物同化中作用的问题。WT菌株的蛋白质组学分析（图3A）显示，乙酸盐培养细胞中SthA丰度比葡萄糖培养时高约4倍。
【数据】乙酸盐培养SthA丰度升高：约4倍（相对于葡萄糖条件）
剖析转氢作用与甲酸盐耐受之间的关联
（此部分原文节选未完整提供，以下依据可获得的原文内容翻译——原文结果部分在甲酸盐耐受相关段落的内容未包含在提供的节选文本中，因此无法逐句翻译。根据可获得的摘要与讨论信息，该部分研究了两种转氢酶活性通过将C1化合物氧化释放的还原当量导向NAD⁺再生成而使细胞获得甲酸盐耐受能力。原文未详述该部分的具体实验步骤与数值。）
【数据】原文未详述
接入NAD⁺与NADP⁺依赖型FDH以检验甲酸盐解毒途径的辅因子特异性
（此部分原文节选未完整提供，无法逐句翻译。根据图表清单信息可知该部分涉及PP_0256与大肠杆菌FdhF的结构比对、互补策略恢复甲酸盐耐受等内容。）
【数据】原文未详述
pntAB与sthA的分类学分布、系统发育分析与基因组背景
（此部分原文节选未完整提供，无法逐句翻译。根据图表清单信息可知该部分涉及PntAB与SthA在各生命域中的分布查询、系统发育分析及基因组上下文分析。）
【数据】原文未详述
转氢酶在整合中心碳代谢与甲酸盐解毒中的作用
（此部分原文节选未完整提供。根据可获得的摘要与讨论信息，该部分总结了恶臭假单胞菌中NAD⁺依赖型FDH（PP_0256与PP_4596）氧化甲酸盐为代谢网络提供氧化还原输入，两种转氢酶介导电子传递以维持辅因子平衡的整合模型。）
【数据】原文未详述
讨论与解读
自细菌提取物中发现酶促转氢作用以来，PntAB与SthA介导的NAD(H)与NADP(H)之间还原当量交换一直吸引着微生物学家与生物化学家的关注。转氢酶并非普遍必需——某些细菌谱系中缺失——但它们分布广泛，常以单酶形式存在（膜结合型PntAB比可溶型SthA更常见），或两种结构无关的蛋白共存于同一微生物中。这一长期观察引出一个基本问题：维持两种结构和机制截然不同、却催化几乎相同可逆反应的酶，其生理优势何在？在大肠杆菌中，这种区分被归因于体内相反的方向性——PntAB利用H⁺动力将NADP⁺还原为NADPH（以NADH为电子供体），而SthA再氧化过量NADPH生成NADH供呼吸链产能。该框架是否适用于细菌的系统发育多样性此前悬而未决。
对恶臭假单胞菌双转氢酶功能的研究揭示了一个更灵活的代谢系统。PntAB与SthA并非以固定且互斥的方向运作，而是构成一种动态调整氧化还原平衡的协作机制——这一观点与大肠杆菌模型形成对比。单缺失任一酶对适应性影响极小，而双缺失则导致生长缺陷、能荷紊乱与氧化还原失衡。SthA经与乙醛酸代谢相关的转录调控因子对乙酸盐生长不可或缺。两酶的活性通过将C1化合物氧化释放的还原当量导向NAD⁺再生成，赋予细胞甲酸盐耐受能力。
编译者解读
该研究在合成生物学层面有两点值得关注：其一，双转氢酶系统的可逆性与冗余性设计为底盘菌株的氧化还原工程提供了新思路——通过调节PntAB/SthA表达比例而非简单地过表达单一辅因子再生酶，可更精细地控制胞内NADH/NADPH分配；其二，甲酸盐耐受与C1氧化的偶联机制直接指向甲酸作为廉价还原力底物的利用策略。局限在于：体外酶活测定无法完全反映体内H⁺梯度与底物浓度的动态约束，转氢酶在真实发酵条件下的通量贡献仍需体内代谢通量分析加以量化。将转氢酶模块嵌入C1同化途径时，需考虑本研究中揭示的底物依赖性功能分化。
参考来源
期刊：Cell Systems, 2026
DOI: 10.1016/j.cels.2026.101646
DOI: 10.1016/j.cels.2026.101646