来源：Global transcriptional rewiring and dual-compartment engineering for efficient 3-hydroxypropionic acid production in Saccharomyces cerevisiae（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
3-羟基丙酸（3-HP）是源自丙二酰辅酶A的重要平台化学品，其高效生物合成长期受限于不同亚细胞区室中丙二酰辅酶A的利用效率。本研究利用生物传感器引导的转录因子诱变筛选，鉴定出四个正向调控突变体，通过全局转录重编程增强胞质丙二酰辅酶A供应；同时开发了线粒体丙二酰辅酶A利用及双区室协同策略。最终在二倍体菌株中实现5-L补料分批发酵81.8 g/L 3-HP，为目前酿酒酵母报道最高产量。
研究背景
3-羟基丙酸（3-HP，C3H6O3）是一种三碳非手性有机酸，被美国能源部认定为21世纪最具前景的生物基平台化学品之一。作为丙烯酸、丙二酸和1,3-丙二醇等高价值化学品的关键前体，3-HP在可降解塑料、功能材料、制药和精细化工领域具有广阔应用前景。利用可再生原料进行3-HP微生物生产，为石油化工路线提供了可持续替代方案，并已在多种微生物宿主中得到验证。
酿酒酵母作为公认安全（GRAS）的真核模式生物，拥有成熟的工业规模培养与发酵工艺，遗传操作工具完善，转录调控网络注释全面，亚细胞区室化结构清晰，为精细化代谢工程提供了独特优势。亚细胞区室化工程已成为重新分配代谢通量、缓解前体竞争的有效策略。然而，胞质与线粒体两个区室在支持3-HP合成方面的内在能力差异，以及如何通过全局调控解除代谢瓶颈，仍缺乏系统研究。
研究方法
2.1 质粒与菌株构建
本研究所用菌株和质粒列于补充表1和表2。大肠杆菌DH5α（Sangon Biotech）用于质粒构建。所有质粒通过Gibson assembly方法构建。PCR扩增使用2×Phanta Flash Master Mix（Vazyme，南京）。DNA纯化试剂盒购自Magen Biotechnology（广州）有限公司。DNA连接使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V2（Vazyme，南京），质粒提取使用Plasmid Extraction Kit（Tiangen Biotech（北京）有限公司）。本研究所用引物列于补充表3。
酿酒酵母菌株CEN.PK113-5D（MATa SUC2 MAL2-8c ura3-52 TRP1 LEU2 HIS3）作为宿主菌株。基因整合和启动子替换采用CRISPR/Cas9系统，按照标准方案进行（Zhang et al., 2019）（表S6）。工程酵母菌株使用LiAc/SS carrier DNA/PEG方法转化（Gietz and Schiestl, 2007）。通过PCR扩增靶基因组位点两侧的同源臂，融合构建供体DNA。随后，携带靶向特定区域gRNA的Cas9质粒与含有200 bp同源臂的供体DNA共同转化至感受态细胞。转化细胞接种于SC-URA琼脂平板，30°C培养2-3天。筛选阳性转化子后，细胞在YPD培养基中30°C传代四次以消除编辑质粒。本研究所用MCR来源于C. aurantiacus。所有经密码子优化的基因由BGI Genomics Co., Ltd.定制合成。
【数据】宿主菌株：CEN.PK113-5D；同源臂长度：200 bp；培养温度：30°C；培养时间：2-3天；MCR来源：C. aurantiacus
2.2 培养基与培养条件
含100 mg/L氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基用于大肠杆菌培养。酵母菌株在YPD培养基中培养，YPD含10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖。携带Ura3营养缺陷型质粒的菌株使用SC-URA培养基，含5 g/L (NH4)2SO4、1.7 g/L酵母氮源基础（YNB）（Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.，上海）、20 g/L葡萄糖和1.29 g/L DO Supplement-Ura（Coolaber Technology Co., Ltd.，北京）。LEU2和URA3双营养缺陷型菌株筛选使用SC-LEU-URA Broth培养基（Coolaber Technology Co., Ltd.，北京）。
摇瓶发酵时，用于3-HP生产的菌株先在YPD培养基中预培养，然后以初始OD600为0.1接种至250 mL摇瓶中的20 mL最小培养基中，30°C、200 rpm转速下培养。发酵培养基含7.5 g/L (NH4)2SO4、14.4 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O和20 g/L葡萄糖。该培养基补充了先前研究中描述的维生素和微量金属溶液（Verduyn et al., 1992），pH用100 g/L NaOH调至6.0。必要时添加60 mg/L尿嘧啶。144 h发酵期间，每24 h向每瓶补充500 μL 500 g/L葡萄糖溶液，相当于每次补料约12.5 g/L葡萄糖。
【数据】YPD培养基：10 g/L酵母提取物+20 g/L蛋白胨+20 g/L葡萄糖；SC-URA培养基：(NH4)2SO4 5 g/L+YNB 1.7 g/L+葡萄糖20 g/L+DO Supplement-Ura 1.29 g/L；发酵培养基：7.5 g/L (NH4)2SO4+14.4 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4·7H2O+20 g/L葡萄糖；pH：6.0；接种OD600：0.1；温度：30°C；转速：200 rpm；发酵时间：144 h；补料：每24 h补500 μL 500 g/L葡萄糖
2.3 生物量与代谢物分析
生物量通过V-1500可见分光光度计（Meixi Instrument Co., Ltd.，上海）在600 nm波长下测定光密度（OD600）。3-HP、葡萄糖、乙醇、乙酸和甘油采用高效液相色谱（HPLC；Agilent 1260 Infinity，Agilent Technologies，Santa Clara，USA）定量分析，配备Aminex HPX-87H离子交换柱（Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA）。流动相为0.5 mM硫酸，流速0.4 mL/min；柱温维持在65°C；进样量20 μL，总运行时间40 min。葡萄糖、乙醇和甘油使用折射率检测器（RID）在45°C下检测；3-HP和乙酸使用紫外（UV）检测器在210 nm波长下分析。HPLC分析前，培养样品以12,000 × g离心10 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤。
【数据】HPLC流动相：0.5 mM硫酸；流速：0.4 mL/min；柱温：65°C；进样量：20 μL；运行时间：40 min；RID温度：45°C；UV波长：210 nm；离心：12,000 × g，10 min
2.4 细胞干重测定与生物量校准
生物量通过OD600测定及对应的细胞干重（DCW）确定，采用恒温干燥恒重法。具体操作：洁净离心管在105°C预干燥2-4 h，置于干燥器中冷却至恒重，用分析天平准确记录空管重量（W0）。取5 mL充分混匀的发酵液，12,000 × g离心10 min，细胞沉淀用无菌去离子水洗涤两次以去除残留培养基、糖类和胞外代谢物，最大限度减少测量误差。纯化后的细胞沉淀在105°C干燥4-6 h，冷却至恒重，获得管与细胞总重量（W1）。DCW按下式计算：DCW（g/L）= [(W1 − W0)/5] × 1000。为快速定量生物量，使用五至六个梯度稀释样品（每组三个生物学重复）校准OD600与DCW之间的线性关系。线性拟合结果显示，常规培养条件下截距可忽略不计，换算公式简化为DCW（g/L）= 0.3 × OD600。
【数据】干燥温度：105°C；预干燥时间：2-4 h；干燥时间：4-6 h；样品体积：5 mL；离心：12,000 × g，10 min；换算公式：DCW（g/L）= 0.3 × OD600
2.5 基于丙二酰辅酶A生物传感器的高通量全局转录因子文库筛选
为实现基于生物传感器的胞内丙二酰辅酶A水平筛选，将丙二酰辅酶A响应型报告质粒pJfapO-fapR（Chen et al., 2018）转化至酿酒酵母CEN.PK113-5D感受态细胞。随后，将我们前期研究中构建的全局转录因子文库——包含超过83,000个突变，对与酵母超过一半基因相互作用的47个转录调控因子的活性位点进行饱和诱变（Liang et al., 2021）——采用上述转化方法导入报告菌株。转化子在SC-LEU-URA琼脂平板上筛选。
亲本菌株CEN.PK113-5D为尿嘧啶营养缺陷型（ura3-52）和亮氨酸原养型。因此，仅在本研究中LEU2基因缺失的菌株中观察到亮氨酸营养缺陷。SC-LEU-URA培养基用于筛选同时携带URA3标记文库质粒和LEU2标记报告质粒的转化子。单个菌落使用QPix420微生物菌落挑选仪自动挑选，接种至含SC-LEU-URA液体培养基的96孔板中。平板在30°C、220 rpm振荡培养24 h。使用SpectraMax iD3多功能酶标仪测量荧光强度和OD600。GFP荧光以激发波长485 ± 20 nm、发射波长535 ± 20 nm记录。相对荧光强度（a.u.）归一化至细胞密度以校正菌株间生长差异。携带报告质粒和表达Cas9及非靶向gRNA的对照质粒的菌株作为基线。归一化荧光强度至少比对照菌株高70%（相当于对照的1.7倍）的克隆被选作进一步分析。选中的克隆进行Sanger测序以鉴定引入的突变。经验证的突变体随后被单独重建并保留用于后续分析。
【数据】文库规模：>83,000个突变；靶向转录因子数：47个；培养温度：30°C；转速：220 rpm；培养时间：24 h；激发波长：485 ± 20 nm；发射波长：535 ± 20 nm；筛选阈值：荧光强度≥对照的1.7倍
2.6 丙二酰辅酶A含量测定
酵母在补充氨基酸的YNB培养基中30°C、220 rpm预培养16 h，然后以初始OD600为0.2转接至30 mL YPD培养基。培养12-14 h至对数中期后，收集细胞并用冰预冷PBS洗涤两次。原生质体制备及后续分析步骤原文未详述。
【数据】预培养：YNB培养基，30°C，220 rpm，16 h；转接OD600：0.2；培养时间：12-14 h（至对数中期）；洗涤：冰预冷PBS两次
2.7 摇瓶发酵与5-L补料分批发酵
摇瓶发酵条件见2.2节。5-L补料分批发酵在5-L生物反应器中进行。发酵参数、补料策略及过程控制细节原文未详述。
【数据】发酵规模：5-L；发酵方式：补料分批；具体参数：原文未详述
2.8 转录组测序与分析
对四个突变菌株（NRG1_R224H、STB3_L52Y、PDR1_T820C和PGD1_V243D）及野生型对照进行RNA测序（RNA-seq）。总RNA提取、cDNA文库构建、测序平台及数据分析流程原文未详述。
【数据】测序菌株：4个突变菌株+野生型对照；具体流程：原文未详述
研究结果
3.1 酿酒酵母胞质与线粒体3-HP生物合成能力验证
由于胞质和线粒体表现出不同的代谢状态，且均已被用作3-HP途径重构的靶标，比较它们支持3-HP生物合成的内在能力具有重要意义（图1A）。为确定两个区室的相对生物合成潜力，我们构建了携带配对表达盒的菌株，编码MCR的N端结构域（MCR-N；全长蛋白：MCR）与野生型MCR C端结构域（MCR-C）或高活性工程突变C端片段（MCR-mC）组合（图1B）。使用区室特异性靶向序列确保每个构建体的准确定位（Zhang et al., 2023）。
MCR-mC突变体通过定点诱变在天然MCR-C的C端区域引入三个氨基酸替换：N940V、K1106W和S1114R。前期生化表征验证该三重突变体相对于未修饰的野生型MCR-C具有显著提高的催化转换效率（Liu et al., 2016）。表达工程化MCR-N & MCR-mC组合的菌株始终优于表达MCR-N & MCR-C的菌株，表明天然C端结构域相对较低的催化活性可能构成3-HP生物合成的重要体内瓶颈（图1C）。
在相同摇瓶发酵条件（144 h）下，表达MCR-N和MCR-mC的胞质菌株cNmC_p达到11.8 g/L细胞干重（DCW），产生10.8 g/L 3-HP，得率0.15 g/g；而表达相同酶组合的线粒体菌株mNmC_p达到9.0 g/L DCW，产生8.2 g/L 3-HP，得率0.12 g/g（图1C）。值得注意的是，当以生物量归一化时，两种菌株（cNmC_p和mNmC_p）表现出几乎相同的比3-HP得率，约为0.9 g/g DCW，表明胞质和线粒体均具有相当的丙二酰辅酶A来源3-HP生物合成的内在能力。这些结果证明两个区室均可独立维持有效的3-HP合成，并为后续工程提供了定量且可比较的基线。
【数据】胞质菌株cNmC_p：DCW 11.8 g/L，3-HP产量10.8 g/L，得率0.15 g/g；线粒体菌株mNmC_p：DCW 9.0 g/L，3-HP产量8.2 g/L，得率0.12 g/g；比产量（两者）：约0.9 g/g DCW；发酵时间：144 h；MCR-mC突变位点：N940V、K1106W、S1114R
3.2 生物传感器引导的转录重塑增强胞质丙二酰辅酶A供应以促进3-HP生产
为增强胞质丙二酰辅酶A可用性并提高3-HP生物合成，我们建立了将丙二酰辅酶A生物传感器与全局转录因子诱变文库相结合筛选框架（图2A）。将基于FapR/fapO的生物传感器（Chen et al., 2018）导入CEN.PK 113-5D，使GFP荧光能够实时报告胞内丙二酰辅酶A水平（图S1）。
为重编程全局代谢调控，将前期开发的全局调控网络多重导航（MINR）文库（Liang et al., 2021）——含有超过83,000个设计变体——转化至携带生物传感器的菌株中。该文库靶向47个具有广泛调控影响的转录因子，突变残基基于保守结构域、功能基序和已记录的调控热点进行选择。蛋白质注释信息从Saccharomyces Genome Database获取，并使用SUPERFAMILY、PROSITE和PDB资源进一步验证。MINR突变体文库的详细遗传设计信息见补充表S8。
转化后，菌落涂布于SC-LEU-URA琼脂平板，通过蓝光激发下GFP荧光成像预筛选以富集高信号变体（图2B）。随后使用自动化QPix420菌落挑选仪分离选定的文库克隆，并在96孔微板中进行定量荧光分析以确定GFP信号强度。共有384个MINR文库克隆在96孔板中进行了定量荧光分析。使用归一化荧光强度至少比对照菌株高70%的阈值，鉴定出34个阳性克隆，阳性率约为8.9%。
对这34个克隆的Sanger测序显示，大多数突变集中在四个转录因子中：NRG1、STB3、PDR1和PGD1（图S2）。具体而言，NRG1_R224H出现在6个克隆中，STB3_L52Y出现在12个克隆中，PDR1_T820C出现在8个克隆中，PGD1_V243D出现在5个克隆中（图2C）。其余三个克隆被确认为非特异性突变或测序错误，排除在进一步分析之外。独立重复筛选获得相似结果，这四个变体始终占阳性克隆的绝大多数（超过90%），且单独重建后表现出稳定的荧光升高。
NRG1编码C2H2型锌指转录抑制因子，招募Cyc8p–Tup1p共抑制复合物，整合葡萄糖信号与环境胁迫响应，从而调控参与碳代谢、细胞形态发生和胁迫适应的基因（Park et al., 1999）。STB3编码RRPE结合转录因子，参与生长调控和DNA复制胁迫的转录响应（Liko et al., 2010; Tkach et al., 2012）。PDR1编码Zn2Cys6型锌簇转录因子，作为多效耐药网络的核心调控因子，激活参与ABC转运蛋白表达、膜脂代谢、解毒和胁迫耐受的基因（Kean et al., 1997）。PGD1编码Mediator复合物的一个亚基，属于尾部模块，在RNA聚合酶II依赖性转录中发挥关键作用，选择性激活响应环境和代谢信号的基因（Myers et al., 1999）。
总体而言，这四个调控因子均已知参与酿酒酵母中与葡萄糖感知、胁迫响应和生长相关调控相关的转录程序。因此，NRG1、STB3、PDR1和PGD1中的突变可能扰动多层代谢和调控控制，而非作用于单一途径。
为验证上述观察结果，选择了在测序分析中高度富集且在生物传感器筛选中表现出强GFP响应的四个代表性突变进行单独重建。所有突变体均表现出比亲本菌株更高的单位生物量荧光强度。我们进一步定量了胞内丙二酰辅酶A含量，其与荧光信号呈正相关（图2D）。随后的摇瓶发酵表明，携带NRG1_R224H、STB3_L52Y、PDR1_T820C和PGD1_V243D的菌株分别产生12.9、12.4、13.1和11.3 g/L 3-HP（图2E）。相对于亲本胞质菌株（10.8 g/L），这些值对应产量增加20%、15%、21%和5%。值得注意的是，观察到的3-HP产量提高与生物传感器荧光强度呈正相关（图S3），支持丙二酰辅酶A可用性是途径性能的关键决定因素。
综上，这些结果表明靶向扰动全局转录调控因子可有效提升胞质丙二酰辅酶A池，为增强酿酒酵母3-HP生物合成提供了稳健策略。
【数据】筛选克隆数：384个；阳性克隆数：34个（阳性率约8.9%）；突变分布：NRG1_R224H 6个克隆、STB3_L52Y 12个克隆、PDR1_T820C 8个克隆、PGD1_V243D 5个克隆；3-HP产量：NRG1_R224H 12.9 g/L（+20%）、STB3_L52Y 12.4 g/L（+15%）、PDR1_T820C 13.1 g/L（+21%）、PGD1_V243D 11.3 g/L（+5%）；对照（亲本胞质菌株）：10.8 g/L
3.3 转录组分析揭示增强丙二酰辅酶A可用性的协同调控重塑机制
为系统阐明PDR1_T820C、PGD1_V243D、NRG1_R224H和STB3_L52Y突变增强胞内丙二酰辅酶A可用性的分子机制，我们进行了RNA测序（RNA-seq）以表征这四种突变菌株的全局转录变化。差异表达分析与KEGG通路富集相结合，进一步整合靶向遗传扰动和功能验证，从而鉴定出关键的调控节点。
（后续转录组详细结果原文节选未完整呈现，包括差异表达基因数量、KEGG富集通路及关键代谢途径的具体变化数据。）
【数据】测序菌株：4个突变菌株+野生型对照；KEGG富集通路及DEG数量：原文节选未详述
3.4 多位点线粒体途径扩增与辅因子工程实现高水平3-HP生物合成
（该部分结果原文节选未完整呈现，包括逐步基因组整合策略示意图、HFA1动态调控、POS5优化表达及线粒体途径多拷贝扩增的具体数据。）
【数据】该部分具体数值：原文节选未详述
3.5 二倍体菌株的构建与双区室协同3-HP生产性能表征
（该部分结果原文节选未完整呈现，包括接合型转换、单倍体胞质与线粒体工程菌株的构建、二倍体菌株的发酵性能及5-L补料分批发酵的详细数据。）
【数据】5-L补料分批发酵3-HP产量：81.8 g/L（据摘要）；其余具体数值：原文节选未详述
讨论与解读
真核细胞中胞内丙二酰辅酶A的高效利用受限于区室化代谢和多层调控控制。本研究建立了双区室协同框架，实现了酿酒酵母跨亚细胞区室前体池的综合利用。通过整合酶工程、生物传感器引导的转录重塑、亚细胞区室特异性途径强化及二倍体菌株构建，系统缓解了包括前体可用性、氧化还原平衡和胞内通量分配在内的多层代谢限制。这种协同工程策略实现了性能的逐步提升，最终在补料分批发酵条件下获得了酿酒酵母中报道的最高3-HP产量和葡萄糖得率。
我们实验证明，酿酒酵母的胞质和线粒体均能在单细胞水平上支持丙二酰辅酶A来源的3-HP生物合成。尽管体积产量在胞质途径中略高，但生物量归一化产率在两个区室间几乎相同。这表明线粒体生产观察到的较低最终产量主要反映生长限制和生物量减少，而非线粒体途径本身的催化能力不足。这些发现揭示了酿酒酵母中不同的亚细胞区室具有独特的代谢优势，可通过区室协同策略加以利用。
编译者解读：本研究展示了合成生物学中"全局调控扰动+区室化工程"的巧妙结合。生物传感器引导的转录因子突变筛选策略值得关注——它跳过了对代谢通路的理性设计，转而利用随机突变和筛选来发现意想不到的调控节点，这种"非理性+高通量"的思路在复杂代谢网络优化中具有独特优势。双区室协同策略则体现了对真核细胞空间结构的深度利用，将两个区室的丙二酰辅酶A池同时纳入生产体系。81.8 g/L的产量达到目前酿酒酵母中的最高水平，证明了这一框架的实用性。不过，转录因子突变带来的多效性效应可能对菌株鲁棒性产生未知影响，工业放大中的遗传稳定性仍需进一步考察。
参考来源
Liu J. Global transcriptional rewiring and dual-compartment engineering for efficient 3-hydroxypropionic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102527
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102527