来源：Construction and systematic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient de novo biosynthesis of pentostatin（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
喷司他丁是一种强效腺苷脱氨酶抑制剂，临床需求大但传统生产困难。本研究以酿酒酵母为底盘，通过异源表达冬虫夏草来源的cns3基因，结合启动子工程、多拷贝rDNA整合、AAH1基因敲除及转运蛋白工程，实现了喷司他丁的高效从头生物合成。最终菌株在摇瓶发酵中产量达16.28 mg/L，较初始菌株提升19.38倍。分子对接与转录组分析揭示了外排泵Cns4缓解产物毒性的深层机制，为毒性核苷类天然产物的微生物合成提供了可推广的范式。
研究背景
喷司他丁作为腺苷脱氨酶（ADA）的高效抑制剂，凭借高选择性和强抗肿瘤活性，已成为毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病及部分T细胞淋巴瘤的一线临床药物。此外，它在器官移植免疫抑制和抗病毒治疗中展现出应用前景。然而，当前生产路线存在根本性局限：化学合成涉及多步保护-脱保护操作、手性拆分困难、总收率极低，既不环保也不经济；传统生产依赖冬虫夏草或链霉菌的天然发酵，但存在生长缓慢、发酵条件苛刻、副产物复杂、产量低且生产周期长（通常超过7天）等问题。尽管天然产酶菌株的代谢工程改造取得了一定进展，但生长速率慢、发酵条件严苛、产物组成复杂和产量不稳定等固有限制仍未解决。构建高效、绿色、经济的喷司他丁制造新路线，已成为合成生物学领域的重要课题。
研究方法
2.1 质粒构建与转化
大肠杆菌DH5α用于质粒复制，酿酒酵母菌株W303-1A用于喷司他丁表达。pYES2作为表达载体，pUC19作为克隆载体。大肠杆菌转化采用化学转化法，酿酒酵母转化采用醋酸锂转化法。本研究所用全部菌株、质粒和引物分别列于表S1、表S2和表S3中。
【数据】菌株：E. coli DH5α、S. cerevisiae W303-1A；载体：pYES2、pUC19；方法：化学转化法、醋酸锂转化法
2.2 摇瓶发酵
将验证正确的酿酒酵母单菌落接种于5 mL SC-Ura培养基（缺乏尿嘧啶的合成完全培养基）中，于30°C、220 rpm振荡培养20-24小时进行菌株活化。随后，以5%（v/v）的初始接种比将种子培养物接种到10 mL新鲜的SC-Ura液体培养基中，于30°C、220 rpm继续培养20-24小时。摇瓶发酵时，以5%（v/v）接种量将种子培养物转移到250 mL摇瓶中的100 mL Ura缺陷发酵培养基中。所有发酵培养物于30°C、220 rpm振荡培养7天，喷司他丁产量通过HPLC测定。
【数据】培养基：SC-Ura、Ura缺陷发酵培养基；温度：30°C；转速：220 rpm；时间：20-24h（活化）、7天（发酵）；接种量：5%（v/v）；体积：5 mL→10 mL→100 mL（250 mL摇瓶）
2.3 喷司他丁定量分析
发酵结束后，取1 mL发酵液于1.5 mL微量离心管中，以12,000 rpm离心10分钟。小心收集上清液，用流动相稀释至适当倍数，经0.22 μm有机相针式过滤器过滤至洁净HPLC进样瓶中待分析。喷司他丁浓度采用岛津高效液相色谱（HPLC）系统定量。分离在InertSustain AQ-C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）上进行，柱温25°C。流动相为2.5 g/L醋酸铵溶液、甲醇和乙腈的混合物（96:2:2，v/v/v），流速1.0 mL/min。检测波长为282 nm。胞内喷司他丁定量时，将1 mL发酵液中的细胞沉淀重悬于1 mL 80%（v/v）冷甲醇中，通过机械研磨破碎细胞。12,000 rpm离心10分钟后，上清液经滤膜过滤并在相同条件下进行HPLC分析。胞内浓度按初始培养体积归一化，以mg/L表示。
【数据】离心：12,000 rpm、10 min；色谱柱：InertSustain AQ-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；柱温：25°C；流动相：2.5 g/L醋酸铵/甲醇/乙腈=96:2:2（v/v/v）；流速：1.0 mL/min；检测波长：282 nm；提取溶剂：80%冷甲醇
2.4 基于绝对定量PCR的基因组拷贝数测定
为评估工程菌株的整合效率和基因剂量，采用基于双标准曲线的绝对定量PCR（qPCR）方法测定每个基因组中cns3表达盒的实际拷贝数。从摇瓶培养24小时后的工程酿酒酵母菌株中，使用标准酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。以单拷贝内源基因ALG9作为基因组内参。含有目标基因（cns3）和内参基因（ALG9）片段的重组质粒经定量后，进行十倍梯度稀释以建立标准曲线。标准曲线通过将各自的阈值循环（Ct）值对log10转换的质粒拷贝数作图生成。基因组样品中cns3和ALG9的绝对拷贝数根据相应的线性回归方程计算。最终，通过将cns3的绝对拷贝数归一化至ALG9来确定每个基因组的cns3拷贝数。所有生物学样品均进行三次重复检测，统计学显著性采用单因素方差分析（ANOVA）评估。
【数据】内参基因：ALG9；稀释方法：十倍梯度稀释；重复次数：3次生物学重复；统计方法：单因素方差分析（ANOVA）
2.5 基因组规模代谢模型与通量平衡分析
酵母基因组规模代谢模型iMM904从BiGG Models数据库获取。基于C. militaris中已报道的途径，将异源喷司他丁生物合成、转运和交换反应纳入模型，并将相应的基因-蛋白质-反应关联分配给cns3和cns4。所有新增反应均设为不可逆，通量界限为0至1000 mmol/gDW/h。通量约束根据实验发酵培养基设定，葡萄糖、氧气和无机营养物的摄取通量分别固定为10、20和5 mmol/gDW/h。通量平衡分析在Python中使用COBRApy配合GLPK求解器完成。模拟野生型菌株时最大化生物量形成，而工程菌株则以喷司他丁分泌为目标函数。比较代谢通量分布以确定代谢工程的关键反应。通量变化使用Matplotlib和Seaborn可视化。原始数据和分析脚本见补充信息。
【数据】模型：iMM904；通量界限：0-1000 mmol/gDW/h；摄取通量：葡萄糖10、氧气20、无机营养物5 mmol/gDW/h；求解器：GLPK（COBRApy）
2.6 蛋白质结构预测与分子对接
Cns4转运蛋白的跨膜拓扑结构使用DeepTMHMM网络服务器预测，2D拓扑图随后使用Prouter网络服务器可视化。Cns4蛋白的3D结构使用AlphaFold3建模。配体喷司他丁的结构构象从PubChem数据库获取。蛋白和配体结构均经对接前准备，包括去除水分子、添加极性氢和分配部分电荷。分子对接模拟使用AutoDock Vina执行。为研究假设的胞内捕获机制，搜索空间特异性地靶向大的胞内N端结构域。受体网格框尺寸定义为87.65 Å × 82.60 Å × 115.50 Å，中心坐标为（X: -2.61，Y: -0.99，Z: -2.92）。详尽度参数设为8。对接过程中，Cns4受体保持刚性，而喷司他丁配体允许完全柔性。所得对接姿态根据计算结合亲和力进行评估和排序。结合能最低（-7.4 kcal/mol）的最优构象被选作进一步分析。3D空间结合构象和2D非共价相互作用网络——突出与关键胞内残基（Leu287、Ala292、Asp296、Glu306和Ser947）的特异性氢键和疏水相互作用——使用Discovery Studio Visualizer进行可视化和渲染。
【数据】对接软件：AutoDock Vina；网格框：87.65 Å × 82.60 Å × 115.50 Å；中心坐标：(X: -2.61, Y: -0.99, Z: -2.92)；详尽度：8；最低结合能：-7.4 kcal/mol；关键残基：Leu287、Ala292、Asp296、Glu306、Ser947
2.7 转录组测序与分析
从培养48小时的酿酒酵母菌株W303-T-C3和W303-T-C3C4的三份生物学重复样品中提取总RNA。链特异性cDNA文库由上海美吉生物医药科技有限公司构建并在Illumina下一代测序平台上完成测序。原始读段经质量过滤后比对至酿酒酵母S288C参考基因组，并使用美吉生物云平台（www.majorbio.com）进行差异基因表达分析、功能富集分析和可视化。本研究产生的原始转录组测序数据已提交至NCBI序列读段档案（SRA）数据库，登录号为SRR38489365至SRR38489370。
【数据】菌株：W303-T-C3、W303-T-C3C4；取样时间：48h；生物学重复：3次；测序平台：Illumina；参考基因组：S288C；SRA登录号：SRR38489365-SRR38489370
研究结果
3.1 喷司他丁异源生物合成途径的初步构建与启动子优化
为在酿酒酵母中建立喷司他丁的从头生物合成，首先从冬虫夏草中克隆了核心生物合成基因cns3，该基因编码负责喷司他丁骨架形成的关键酶。构建了半乳糖诱导型表达质粒pYES2-GAL1p-cns3-CYC1t（图2A），并将其转化至底盘菌株W303-1A，获得初始生产菌株W303-G-C3。为进行定量生产分析，使用喷司他丁标准品建立了HPLC方法，在2-15 mg/L范围内呈现优异的线性关系（R² > 0.999）（图S1）。初始摇瓶发酵成功确认了cns3的功能表达和喷司他丁的从头生物合成。半乳糖诱导168小时后，采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析对产物身份进行确定性验证。发酵液中观察到的离子峰（正离子ESI [M+H]+ m/z 269.1259；负离子ESI [M-H]- m/z 267.1086）与喷司他丁的理论计算值完全一致（图S2），证实异源途径成功组装。
然而，GAL1启动子存在两个对工业应用至关重要的局限性：需要昂贵的半乳糖作为诱导剂，且被大规模发酵中最具成本效益的碳源——葡萄糖强烈抑制。此外，时间过程分析表明，W303-G-C3菌株中喷司他丁的积累极为缓慢，发酵72小时前产物几乎检测不到。168小时时，喷司他丁产量仅为0.84 mg/L（图2D）。
为解决上述局限并实现高效的葡萄糖基生产，将GAL1启动子替换为强组成型、不受葡萄糖抑制的TDH3启动子，构建质粒pYES2-TDH3p-cns3-CYC1t（图2B），获得重组菌株W303-T-C3。生长曲线分析揭示了不同菌株间差异明显的生长特征（图2C）。野生型W303-1A菌株立即进入指数期并在24小时达到稳定期，而重组菌株表现出约24小时的延长迟滞期，表明异源蛋白表达带来了代谢负担。尽管存在初始生长延迟且最终生物量明显较低——这强烈暗示胞内喷司他丁积累增加的细胞毒性效应——W303-T-C3的产物形成动力学显著改善。喷司他丁在48小时后开始快速积累，168小时达到3.90 mg/L的最终产量，较初始GAL1驱动菌株提高4.64倍（图2D）。TDH3驱动菌株中喷司他丁的显著积累通过HPLC分析得到清晰检测和验证（图S3，绿色迹线）。
这些结果表明，将诱导型GAL1启动子替换为组成型TDH3启动子，不仅消除了对昂贵半乳糖诱导的需求，还显著提高了核心生物合成基因的转录水平。该策略有效克服了途径构建早期的限速瓶颈，加速产物合成，为后续代谢优化提供了更具工业兼容性的平台。
【数据】初始菌株W303-G-C3产量：0.84 mg/L（168h）；W303-T-C3产量：3.90 mg/L（168h）；提升倍数：4.64倍；HPLC线性范围：2-15 mg/L（R²>0.999）；LC-MS离子峰：[M+H]+ m/z 269.1259，[M-H]- m/z 267.1086
3.2 多拷贝基因组整合增强遗传稳定性
附加型质粒表达系统在工业应用中存在两个关键局限：缺乏选择压力时容易丢失，且质粒复制给宿主细胞带来显著代谢负担。为解决这些问题并建立遗传稳定的后续代谢工程平台——这对生物过程放大至关重要——将优化后的TDH3p-cns3-CYC1t表达盒整合至酿酒酵母高重复rDNA位点，获得基因组整合菌株W303-rD-T-C3（图3A）。对阳性转化子进行初步摇瓶发酵筛选后，选择一株高性能克隆。为精确量化所选菌株的基因剂量，以ALG9为单拷贝基因组参考进行基于双标准曲线的绝对定量PCR分析。该分析确认约20拷贝的cns3表达盒成功多拷贝整合至宿主基因组（图S4）。
生长曲线分析显示，基因组整合菌株的最大OD600略低于附加型菌株W303-T-C3（图3B），表明多拷贝整合带来轻度代谢负担——这一现象在将大量细胞资源转向异源蛋白质合成时经常观察到。摇瓶发酵结果表明，W303-rD-T-C3在168小时达到11.25 mg/L的最大喷司他丁产量，较附加型菌株W303-T-C3（3.90 mg/L）提高2.88倍（图3C）。值得注意的是，生产动力学也显著改善。喷司他丁积累在72小时后加速，整个发酵期间产量呈线性增长，与附加型菌株的缓慢且趋于平台期的生产形成鲜明对比。
这些结果表明，多拷贝rDNA整合可作为附加型系统的有效替代方案，有助于规避潜在的质粒不稳定性，支持核心生物合成酶Cns3的高水平表达，为后续菌株优化奠定了稳健的遗传基础。
【数据】整合拷贝数：约20拷贝；W303-rD-T-C3产量：11.25 mg/L（168h）；较W303-T-C3提升：2.88倍；参考基因：ALG9
3.3 AAH1敲除阻断嘌呤竞争途径实现协同增产
喷司他丁是一种核苷类似物，其结构与内源嘌呤核苷高度相似。在酿酒酵母中，AAH1编码腺嘌呤氨基水解酶，这是嘌呤补救途径中的关键酶，催化腺嘌呤脱氨生成次黄嘌呤。由于喷司他丁生物合成直接来源于嘌呤代谢网络，天然Aah1酶可能对生产产生两方面负面影响：一方面竞争关键前体腺嘌呤，另一方面可能因底物交叉反应性而混杂识别并降解结构相似的喷司他丁产物。
为应对上述双重挑战——消除竞争性代谢途径以增强上游前体AMP的积累，同时防止潜在产物降解——构建了高效的CRISPR-Cas9介导的AAH1敲除载体（图3D），生成AAH1缺陷底盘菌株PK1。在此优化背景下，首先引入附加型质粒pYES2-TDH3p-cns3-CYC1t获得菌株PK1-T-C3。作为另一种稳健策略，将TDH3p-cns3-CYC1t表达盒整合至aah1Δ菌株的多拷贝rDNA位点，获得PK1-rD-T-C3。
在转化子的初步筛选中，随机整合克隆的群体水平发酵分析显示，PK1-rD-T-C3文库的中位产量和整体分布较W303-rD-T-C3文库显著上移（图S4）。初步筛选后，选择一株高产克隆进行详细表征。关键的是，绝对qPCR分析确认该特定PK1-rD-T-C3克隆中整合的cns3拷贝数（约26拷贝）与W303-rD-T-C3菌株高度相当。这一经验证据明确排除了基因剂量偏差，证实PK1底盘中所观察到的增产效果源于AAH1敲除与多拷贝整合的协同效应。
【数据】PK1-rD-T-C3整合拷贝数：约26拷贝；AAH1功能：腺嘌呤脱氨生成次黄嘌呤；敲除方法：CRISPR-Cas9
（原文结果部分后续内容未在节选范围内，但根据摘要与讨论，研究还实现了16.28 mg/L的最高产量（较初始提升19.38倍），并通过表达Cns4外排泵获得8.27 mg/L产量且显著加速生产过程。分子对接揭示Asp296、Ala292等关键残基通过特异性氢键和疏水相互作用捕获喷司他丁。转录组学证明Cns4全局重编程碳和能量代谢以增强前体供应和细胞稳健性。相关结果见图4至图8。）
讨论与解读
本研究通过组合代谢工程策略系统改造了酿酒酵母，实现了抗肿瘤核苷喷司他丁的高效异源生物合成。从核心生物合成基因cns3的初始半乳糖诱导表达出发，首先将受葡萄糖抑制的GAL1启动子替换为强组成型TDH3启动子，实现了以葡萄糖为唯一碳源的高效生产且无需昂贵诱导。随后通过多拷贝rDNA基因组整合增强遗传稳定性，并通过AAH1敲除阻断嘌呤前体耗散，最高喷司他丁产量达16.28 mg/L，较初始菌株提升19.38倍。更重要的是，引入冬虫夏草来源的转运蛋白Cns4后，喷司他丁产量较仅表达Cns3的质粒对照菌株提高1.90倍，并通过解决关键产物毒性瓶颈，大幅缩短了达到最大产量所需的时间。然而，研究也认识到通过附加型质粒过表达如此大的膜蛋白会带来显著代谢负担，因此建议未来优化应聚焦于启动子强度的精细调控——采用动态调控或生物传感器驱动的启动子，对精确平衡高效产物外排与宿主细胞适应性至关重要。
编译者解读
该研究是典型的"途径构建-耐受性破解-全局优化"三段式合成生物学策略。亮点在于将FBA代谢模型指导的转运蛋白挖掘与分子对接、转录组学分析相结合，从"被动解除毒性"升级为"主动外排产物"，为其他高毒性核苷类产物的细胞工厂构建提供了方法论参考。值得关注的是，Cns4的发现完全依赖计算预测而非传统筛选，体现了AI辅助蛋白功能挖掘在途径工程中的落地价值。局限在于摇瓶水平的产量距离工业化仍有数量级差距，且附加型过表达Cns4的代谢负担问题尚未根本解决。后续若能实现Cns4的基因组整合表达并耦合动态调控启动子，有望进一步释放生产潜力。
参考来源
期刊：Journal of Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.07.008
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.07.008