来源：Alleviating the Crabtree effect for high-level production of squalene in Saccharomyces cerevisiae（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
酿酒酵母虽为工业生物制造的核心底盘，但其固有的Crabtree效应严重限制能量得率并使碳流偏向乙醇生成。本研究通过多维代谢工程策略——调控SNF1/AMPK能量感知系统、引入MTH1转录调控因子A81D突变体、增强线粒体呼吸及提升细胞胁迫耐受性——系统缓解Crabtree效应。最终工程菌株C47在50-L补料分批反应器中实现57.2 g/L角鲨烯产量，为目前报道的最高水平，产率达0.47 g/L/h。
研究背景
酿酒酵母作为GRAS（公认安全）微生物，是工业生物技术的基石，广泛应用于乙醇发酵、重组蛋白生产及药物合成。然而，其工业潜力受制于葡萄糖诱导的Crabtree效应：当葡萄糖浓度超过约0.15 g/L时，即使在有氧条件下，酵母仍转向发酵代谢，将60–75%的碳流导向乙醇生成。该效应导致三大后果：一是高达30%的输入葡萄糖转化为挥发性副产物造成碳损失；二是与完全呼吸代谢相比，ATP得率骤降约9倍；三是三羧酸循环中间体被大量消耗，削弱非乙醇产物的前体供给。本研究以角鲨烯高产为模型，系统探索缓解Crabtree效应的多维工程策略。
研究方法
菌株、培养基与培养条件
菌株构建流程见附图S1，本研究所用酵母菌株完整列表见表S1。酵母菌株在YPD培养基（2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物）中培养；重组大肠杆菌在添加100 μg/mL氨苄青霉素的Luria–Bertani培养基中培养。携带pitch质粒（Cas9蛋白表达质粒）的转化子在SD-Leu培养基（含2% D-葡萄糖、缺乏亮氨酸的合成 dropout 培养基）上筛选。同时携带pTCL和gRNA质粒的菌株在SD-Leu-Ura培养基（缺乏亮氨酸和尿嘧啶）上筛选。为消除gRNA表达质粒，菌株进一步在SD-Leu-5-FoA培养基（SD-Leu补充1 mg/mL 5-氟乳清酸）上筛选。所有SD培养基购自北京FunGenome公司。本研究的亲本菌株为SquMC13，为本实验室前期开发的产角鲨烯酿酒酵母菌株。
【数据】YPD培养基：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物；氨苄青霉素：100 μg/mL；5-氟乳清酸：1 mg/mL；亲本菌株：SquMC13
质粒构建
本研究所用质粒和引物分别列于表S2和表S3。所有DNA序列使用KOD FX101高保真聚合酶（TOYOBO，大阪，日本）扩增。质粒组装采用Gibson一步克隆系统（Vazyme，南京，中国）。靶向特定基因组位点的gRNA质粒使用CRISPRdirect（http://crispr.dbcls.jp/）设计，并通过PCR和in-fusion克隆构建。
【数据】聚合酶：KOD FX101（TOYOBO）；克隆系统：Gibson一步克隆（Vazyme）；gRNA设计工具：CRISPRdirect
酵母菌株构建
菌株构建时，将扩增的上、下游同源臂以及含有至少40 bp与同源臂重叠的基因表达盒共同转化至酿酒酵母中，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research，Irvine，CA，USA）。转化细胞随后涂布于SD-Leu-Ura固体培养基，培养2–3天。为实现连续基因编辑，工程菌株随后交叉划线于SD-Leu-5-FoA平板以去除gRNA质粒。
【数据】同源臂重叠长度：≥40 bp；转化试剂盒：Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit；培养时间：2–3天
工程酵母的摇瓶培养
工程酵母菌株在含50 mL YPD培养基的250-mL摇瓶中培养。首先将单菌落接种于5 mL YPD培养基，30°C、220 rpm振荡培养12 h。随后将培养物转接至15 mL YPD培养基，调整初始OD600为0.1，在相同条件下培养约14 h。之后，将该种子培养物以初始OD600为0.2接种至50 mL新鲜YPD培养基，于30°C、220 rpm振荡培养约7天。
【数据】摇瓶规格：250 mL；培养基体积：50 mL；初始OD600：0.1（种子）→0.2（发酵）；温度：30°C；转速：220 rpm；培养时间：12 h→14 h→约7天
角鲨烯提取与定量
角鲨烯提取时，取600 μL培养样品与600 μL乙酸乙酯及1.5 g氧化锆珠（直径0.5 mm）混合于2-mL微量离心管中。混合物使用冷冻研磨机（上海净信，中国）在55 Hz、4°C条件下处理30 min。随后样品于12,000 rpm离心10 min，收集上层有机相，用无水硫酸钠脱水后用于气相色谱（GC）分析。GC系统（7890A；安捷伦科技，Santa Clara，CA，USA）配备HP-5色谱柱（30 m × 0.25 mm，膜厚0.25 μm）和火焰离子化检测器。柱温箱温度维持在290°C保持8 min，保留时间为3.8 min。角鲨烯采用外标法定量。结果以三次重复的平均值报告。
【数据】样品量：600 μL；乙酸乙酯：600 μL；氧化锆珠：1.5 g（0.5 mm）；研磨条件：55 Hz、4°C、30 min；离心：12,000 rpm、10 min；GC柱温：290°C、8 min；保留时间：3.8 min
乙醇含量测定
将单菌落接种于5 mL YPD培养基，30°C、220 rpm培养12 h。随后转接至15 mL YPD培养基，调整初始OD600为0.1，在相同条件下培养约14 h。最后将菌株接种于50 mL YPD培养基，30°C、220 rpm培养（直至培养基中葡萄糖耗尽），使用乙醇含量检测试剂盒（Solarbio，北京，中国）进行检测。
【数据】培养温度：30°C；转速：220 rpm；检测试剂盒：Solarbio乙醇检测试剂盒
ATP含量测定
胞内ATP水平使用基于萤火虫荧光素酶的ATP检测试剂盒（碧云天，上海，中国）测定，按照制造商说明书操作。ATP定量前将细胞悬液归一化至相同OD600。生成标准曲线，ATP浓度以纳摩尔（nM）表示。
【数据】检测方法：萤火虫荧光素酶法ATP试剂盒；单位：nM
NADPH/NADP+比值测定
胞内NADPH/NADP+比值使用商业辅酶II（NADP+/NADPH）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京，中国）测定，按照制造商方案操作。
【数据】检测试剂盒：南京建成辅酶II检测试剂盒
实时荧光定量PCR分析
使用商业RNA提取试剂盒（Vazyme）从酿酒酵母菌株中提取总RNA，按照制造商说明书操作。纯化的RNA经dsDNase处理后，使用UnionScript第一链cDNA合成试剂盒（金沙生物，中国）反转录为第一链cDNA。实时荧光定量PCR（qPCR）使用基于SYBR的qPCR预混液在实时PCR检测系统上进行。每个条件分析三个生物学重复。基因表达水平以内参基因ACT1归一化，相对转录丰度采用2–ΔΔCt法计算。在限定培养条件下进行RT-qPCR分析时，工程菌株在亮氨酸缺失合成培养基（SC-Leu；北京盘诺生物技术，中国）中培养，补充2 g/L亮氨酸以满足菌株的营养缺陷型需求。培养物在30°C、200 rpm振荡培养至指数中期后进行RNA提取。
【数据】内参基因：ACT1；计算方法：2–ΔΔCt；SC-Leu培养基补加亮氨酸：2 g/L；培养条件：30°C、200 rpm
线粒体膜电位评估
线粒体膜电位（Δψm）是线粒体在融合与分裂动态过程中的重要质量指标，使用四甲基罗丹明乙酯染色法（碧云天）评估，按照制造商说明书操作。
【数据】染色试剂：四甲基罗丹明乙酯（TMRE）
激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体形态
工程菌株的线粒体形态变化使用AIR共聚焦激光扫描显微镜（尼康，东京，日本）观察。细胞在YPD培养基中培养24 h后离心收集。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次后，细胞重悬于PBS中。PBS配方含10 mM Na₂HPO₄、2 mM NaH₂PO₄、135 mM NaCl和4.7 mM KCl，pH调至7.4。线粒体绿色荧光在488 nm波长激发，使用相应发射通道检测。
【数据】PBS配方：10 mM Na₂HPO₄、2 mM NaH₂PO₄、135 mM NaCl、4.7 mM KCl；pH 7.4；激发波长：488 nm
胞内活性氧水平测定
胞内活性氧（ROS）水平使用荧光探针2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）测定。简要步骤如下：取1 mL酵母培养物，8,000 rpm离心5 min收集细胞，弃上清。细胞沉淀用PBS（pH 7.4）洗涤两次。洗涤后，细胞重悬于990 μL PBS中，加入10 μL 10 mM DCFH-DA溶液。悬浮液轻轻混匀，30°C避光孵育30 min。随后细胞再次用PBS（pH 7.4）洗涤以去除多余探针。取200 μL细胞悬液转移至黑色96孔微孔板，使用酶标仪在激发波长488 nm、发射波长525 nm下测定荧光强度。计算OCR前需从样品孔中扣除空白孔荧光值。
【数据】DCFH-DA浓度：10 mM；孵育条件：30°C、30 min、避光；激发/发射波长：488/525 nm
耗氧速率测定
细胞耗氧速率（OCR）使用F…
（原文此处截断，后续方法内容未提供）
【数据】原文未详述
研究结果
通过调控SNF1/AMPK能量传感器缓解Crabtree效应
葡萄糖阻遏（分解代谢物阻遏）是Crabtree效应的关键分子机制，它抑制了参与呼吸作用和替代碳源利用的基因。这种阻遏主要通过抑制Snf1/AMPK复合物介导——该复合物是激活呼吸途径所需的核心能量传感器。Snf1活性取决于其调节亚基Snf4，并在葡萄糖存在时被抑制（图1A）。机制上，这种抑制通过Glc7–Reg1蛋白磷酸酶1（PP1）复合物对Snf1的去磷酸化实现，其中Reg1作为靶向亚基将Glc7招募至Snf1。因此，通过恢复Snf1活性来解除葡萄糖阻遏，有望减弱Crabtree效应并改善细胞能量状态，从而有利于角鲨烯生物合成。
根据已有报道，敲除编码PP1调节亚基的REG1（该亚基引导Glc7作用于葡萄糖阻遏靶标）可减少Glc7介导的Snf1失活，从而缓解葡萄糖阻遏。基于此原理，我们在SquMC13菌株中敲除了REG1以降低Glc7活性并缓解葡萄糖阻遏。所得C01菌株的角鲨烯产量为3.1 ± 0.1 g/L，较亲本SquMC13菌株（2.7 ± 0.1 g/L）提高14.8%，与设计预期一致（图1B）。
为验证葡萄糖阻遏和Crabtree效应是否得到缓解，我们定量了Snf1依赖性呼吸基因（ICL1、FBP1和CIT1）的表达并测定了残余乙醇浓度。与SquMC13相比，C01菌株中ICL1、FBP1和CIT1的转录本丰度分别降至亲本水平的45%、58%和53%。同时，乙醇积累量下降4.43%（图1C–E）。这些数据表明，虽然C01中乙醇产量略有降低，但呼吸基因的转录并未上调。综合来看，这些结果表明在测试条件下，C01中葡萄糖阻遏和Crabtree表型的缓解仍然有限。单独敲除REG1未能完全重新激活Snf1介导的呼吸途径，但确实在碳代谢和角鲨烯合成方面带来了边际改善。
为进一步研究Snf1复合物对Crabtree效应的调控影响，我们在SquMC13中分别过表达SNF1（菌株C02）、SNF4（菌株C03）以及两者同时过表达（菌株C04）。所得C02和C04菌株的角鲨烯产量分别提高至3.1 ± 0.2 g/L（提高14.8%）和2.9 ± 0.2 g/L（提高7.41%），而C03菌株与SquMC13相比下降了3.7%（图1B）。这些结果表明，激活催化性Snf1亚基——而非其调节伙伴Snf4——对于在富葡萄糖条件下解除葡萄糖阻遏和促进呼吸代谢至关重要，从而有利于呼吸代谢和萜类生物合成。
由于Snf1/AMPK复合物激活仅部分缓解了葡萄糖阻遏，我们考察了将葡萄糖信号传递至转录抑制因子的上游因子。己糖激酶Hxk2以及转录抑制因子Mig1、Mig2和Mig3构成葡萄糖阻遏通路的主要组分，作用于葡萄糖感知与转录调控之间的界面（图1A）。其中，Hxk2发挥双重作用，不仅是糖酵解酶，还通过促进Mig1介导的转录抑制而成为葡萄糖阻遏的关键调节因子。作为该阻遏的主要效应因子，Mig1结合葡萄糖可阻遏基因（如GAL簇基因）的启动子以抑制其转录。此外，酵母细胞含有两个相关的锌指蛋白Mig2和Mig3，它们对部分葡萄糖可阻遏基因亚群发挥较弱或条件依赖性的阻遏效应。
基于葡萄糖阻遏强烈促进Crabtree效应的观察，我们选择了四个主要调节因子——Hxk2、Mig1、Mig2和Mig3——在SquMC13中进行靶向失活，分别生成C05–C08菌株。在高葡萄糖条件下（2%葡萄糖），Hxk2与Mig1协同激活低亲和力葡萄糖转运蛋白Hxt1，同时抑制高亲和力转运蛋白Hxt2和Hxt4。HXK2敲除（菌株C05）使角鲨烯产量提高16.5%，并伴随葡萄糖去阻遏特征的转录变化（图1B）。RT-qPCR分析进一步显示，HXT1的表达水平显著上调至对照的2.54倍，而HXT2表达也增加至对照的1.51倍。相比之下，HXT4表达降至对照的81%（图1D）。这些结果表明，HXK2敲除改变了高葡萄糖条件下葡萄糖转运蛋白基因的转录模式，而非简单逆转经典的葡萄糖阻遏。HXT1表达增加以及HXT2和HXT4的差异调控表明葡萄糖摄取和碳代谢发生了部分重塑。这些发现提示HXK2敲除部分影响了葡萄糖阻遏相关调控，并有助于改善角鲨烯生物合成。
主要阻遏因子Mig1的敲除（菌株C06）使角鲨烯产量提高30%，胞内ATP和NAD(P)H/NAD(P)+水平分别提升46.9%和20.2%（图1F和G）。转录水平分析揭示了MIG1敲除菌株C06中中心碳代谢的广泛重塑。在发酵和糖酵解基因中，PDC1表达增至对照的1.51倍，而ADH1和ENO2分别显著上调4.54倍和6.28倍，表明糖酵解通量和下游氧化还原代谢活性增强（图1D和E）。与线粒体能量代谢相关的基因也表现出显著的转录变化。RT-qPCR分析显示CIT1表达降至对照的30%，而SDH2和COX4表达水平分别显著增加5.45倍和5.85倍（图1D和E）。SDH2和COX4（均参与线粒体呼吸代谢和电子传递）的强烈上调表明，尽管CIT1表达降低，呼吸相关代谢活性仍有所增强。综合来看，这些结果表明MIG1敲除并非简单地将代谢从发酵转向呼吸，而是部分缓解了葡萄糖阻遏并广泛激活了糖酵解和呼吸代谢途径。这种协调的代谢重塑可能有助于改善胞内能量供应和还原力可用性，从而支持角鲨烯生物合成的增强。
为进一步评估MIG1敲除表型在限定营养条件下的稳健性，C06菌株在SC培养基中进行了评估（图S2A和B）。相比之下，MIG2敲除（菌株C07）严重损害生长和角鲨烯合成，而MIG3敲除（菌株C08）仅产生适度改善，这与它们作为碳通量次要或条件特异性调节因子的角色一致。这些结果表明，选择性解除葡萄糖阻遏——特别是通过MIG1敲除——可在…
（原文结果后续部分未完整提供）
【数据】C01角鲨烯产量：3.1 ± 0.1 g/L（较SquMC13提高14.8%）；SquMC13产量：2.7 ± 0.1 g/L；ICL1/FBP1/CIT1表达：降至亲本45%/58%/53%；乙醇积累下降：4.43%；C02产量：3.1 ± 0.2 g/L（+14.8%）；C04产量：2.9 ± 0.2 g/L（+7.41%）；C03产量：下降3.7%；C05（HXK2敲除）：产量+16.5%，HXT1表达2.54倍，HXT2 1.51倍，HXT4降至81%；C06（MIG1敲除）：产量+30%，ATP+46.9%，NAD(P)H/NAD(P)+ +20.2%，PDC1 1.51倍，ADH1 4.54倍，ENO2 6.28倍，CIT1降至30%，SDH2 5.45倍，COX4 5.85倍
讨论与解读
本研究通过逐步调控SNF1/AMPK通路、转录/代谢调节因子、线粒体呼吸能力及细胞胁迫耐受性，构建了工程菌株C47，在50-L补料分批生物反应器中实现57.2 g/L的角鲨烯产量纪录。与乙醇溢流减少相对应，在线尾气分析显示RQ从约1.3（亲本SquMC13菌株）降至约1.0（C47），支持溢流代谢的缓解和呼吸代谢的增强。这项工作验证了缓解Crabtree效应是释放酵母生物合成潜力的有效策略，为工业化角鲨烯生产奠定基础，也为高价值萜类和非乙醇代谢物的可持续合成建立了有前景的平台。
编译者解读
本研究的方法论亮点在于"多维协同"而非单一靶点改造——从能量感知（Snf1/AMPK）、转录调控（Mig1/MTH1）到线粒体功能与胁迫耐受层层递进，体现了系统代谢工程的成熟范式。值得注意的是，作者并未追求彻底消除Crabtree效应，而是通过"部分缓解"实现碳流再平衡，这一思路在工业菌株设计中更具可操作性。57.2 g/L的角鲨烯产量在真核微生物中具有里程碑意义。局限在于，部分机制解释（如MIG1敲除后糖酵解与呼吸基因同时上调的生理意义）仍停留在转录关联层面，更深层的代谢通量验证或可成为后续研究方向。
参考来源
Tang S. Alleviating the Crabtree effect for high-level production of squalene in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering, 2027. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102542
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102542