来源：Metabolic engineering of the β-carotene synthesis pathway in Saccharomyces cerevisiae for the production of β-ionone（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
β-紫罗兰酮是一种高价值萜类化合物，广泛应用于香精香料和功能性食品领域。本研究以酿酒酵母BY4741为底盘菌株，系统性地对β-胡萝卜素生物合成途径进行了代谢工程改造。通过酶组合筛选、蛋白融合策略、代谢通量重构、前体供给强化及脂滴工程等多层次优化，最终在5-L生物反应器中实现了51.86 mg/L的β-紫罗兰酮产量。该研究为酵母中萜类化合物的前体供给理性设计和酶融合策略提供了有价值的参考。
研究背景
类胡萝卜素是一类具有四萜（C40）烃骨架的生理必需萜类化合物，构成番茄红素、β-胡萝卜素及其含氧衍生物的核心结构。紫罗兰酮类化合物，特别是β-紫罗兰酮，因其独特的木质香气和极低的气味阈值而备受关注。这些感官特性加上显著的抗癌活性，推动了对其生物合成和应用的持续研究。
β-紫罗兰酮的生物合成途径始于葡萄糖经中心碳代谢生成乙酰辅酶A，随后进入甲羟戊酸（MVA）途径，依次合成异戊烯基焦磷酸（IPP）及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），二者缩合形成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）。在八氢番茄红素合酶（CarRA）和脱饱和酶（CarB）等关键酶催化下，GGPP逐步转化为β-胡萝卜素。最后，β-胡萝卜素作为直接前体，被类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD）在特定位置裂解生成β-紫罗兰酮。在微生物系统中高效异源生产β-胡萝卜素及其裂解产物β-紫罗兰酮已成为研究热点。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
本研究所用工程菌株及野生型酵母菌株的概览汇总于表S1。酵母菌株常规培养于YPD培养基中，含2%葡萄糖、2%蛋白胨和1%酵母提取物。质粒维持培养中，重组大肠杆菌菌株在添加100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中生长。重组酵母菌株的筛选使用合成完全（SC）培养基，组成为0.67%酵母氮碱、2%葡萄糖和适当氨基酸缺失混合物。SD-Ura培养基（缺乏尿嘧啶、含2%葡萄糖的合成限定培养基）用于筛选携带pCas9质粒的酵母菌株。此外，5-FOA-SD-Ura培养基（SD-Ura补充1 mg/mL 5-氟乳清酸）用于反筛选和消除向导RNA（gRNA）表达质粒。
【数据】YPD培养基：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物；LB培养基：100 μg/mL氨苄青霉素；SC培养基：0.67%酵母氮碱、2%葡萄糖；SD-Ura：2%葡萄糖；5-FOA浓度：1 mg/mL
2.2 质粒构建
本工作所用全部质粒列于表S2。大肠杆菌DH5α（TransGen Biotech，北京，中国）作为基因克隆宿主。所有限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Thermo Fisher Scientific（美国）。靶向特定基因组位点的向导RNA（gRNA）质粒使用在线工具CRISPRdirect（http://crispr.dbcls.jp/）设计，随后通过PCR扩增和In-Fusion克隆构建。DNA聚合酶购自Vazyme（南京，中国），所有寡核苷酸引物由擎科生物技术有限公司（北京，中国）合成。In-Fusion HD克隆试剂盒购自优旭生物技术有限公司（苏州，江苏，中国）。
【数据】克隆宿主：E. coli DH5α；引物合成：擎科生物；In-Fusion试剂盒：优旭生物
2.3 分子克隆与菌株构建
本工作所用全部引物序列见表S3。编码来自三孢布拉霉（Blakeslea trispora）的CarRA和BtCrtI、来自毛霉（Mucor circinelloides）的CarB、来自红发夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）的双功能酶CrtYB以及来自矮牵牛（Petunia hybrida）的PhCCD1的基因，均经过酿酒酵母密码子优化后由擎科生物技术有限公司（北京，中国）合成并克隆至pUC57质粒。内源启动子、终止子和基因从酿酒酵母基因组中扩增获得。所有用于酵母异源表达的密码子优化序列列于补充文件中。
构建工程酿酒酵母菌株采用模块化策略（表1）。首先，从酿酒酵母基因组DNA中扩增目标基因的启动子、编码序列（CDS）和终止子。通过融合PCR组装基因表达盒：设计含30-bp同源区的特异性引物，基础DNA片段经PCR扩增和纯化获得。随后，这些片段通过重叠区连接形成完整的表达单元，包含启动子-基因-终止子-筛选标记-同源臂。之后，使用醋酸锂介导的化学转化法（LiAc/SS载体DNA/PEG法）[17]将表达盒整合到酿酒酵母的特定基因组位点。转化子通过菌落PCR验证，使用碱性裂解法制备的粗基因组DNA提取物：单菌落悬浮于20 mM NaOH中，100°C裂解20 min，取1 µL裂解液作为PCR模板。PCR条带正确的阳性克隆经测序确认，验证菌株保存在50%（v/v）甘油中于−80°C保存。
【数据】同源区长度：30-bp；NaOH浓度：20 mM；裂解温度：100°C；裂解时间：20 min；PCR模板量：1 µL；甘油浓度：50%（v/v）；保存温度：−80°C
2.4 摇瓶发酵
保存在−80°C的甘油菌在YPD琼脂平板上划线，30°C培养48 h进行活化。随后挑取单菌落接种至3 mL YPD液体培养基中，30°C、220 rpm振荡培养16–18 h制备种子液。之后，将3 mL种子液（10%接种量）转入250 mL锥形瓶中的30 mL新鲜YPD培养基中，30°C、220 rpm振荡培养96 h。对于产β-紫罗兰酮的菌株，在传代培养过程中加入3 mL正十二烷以建立两相培养体系，用于疏水产物的原位提取。所有培养均设置三次重复，数据以平均值±标准差表示。
【数据】活化时间：48h；种子培养温度：30°C；转速：220 rpm；种子培养时间：16–18h；接种量：10%；培养体积：30 mL/250 mL锥形瓶；发酵温度：30°C；转速：220 rpm；发酵时间：96h；正十二烷体积：3 mL
2.5 β-胡萝卜素和β-紫罗兰酮的提取与定量
β-胡萝卜素定量时，在发酵终点收集400 μL培养液。样品以12,000 rpm离心2 min，弃去上清液。细胞沉淀重悬于1 mL去离子水中，在相同条件下再次离心。去除上清液后，沉淀用1 mL 3 M盐酸处理，沸水浴加热5 min，立即在冰上冷却5 min。该酸处理重复一次或两次。随后用去离子水洗涤并离心后，沉淀用1 mL丙酮剧烈振荡提取20 min。提取上清液经离心获得，通过0.22 μm有机溶剂兼容膜过滤，并用HPLC分析[18]。
HPLC分析使用Elite HPLC系统（大连依利特分析仪器有限公司），配备C18色谱柱（SinoChrom ODS-BP，4.6 × 250 mm，5 μm）。流动相为乙腈:甲醇:异丙醇（5:3:2，v/v/v），流速1 mL/min。进样量20 μL，检测波长450 nm。
β-紫罗兰酮分析时，从96-h发酵培养物中收集十二烷层。相分离后，取1 mL有机相适当稀释，12,000 rpm离心2 min，经0.22 μm膜过滤后进行GC分析[19]。分析使用SCION 456-GC系统，配备HP-5MS色谱柱（30 m × 0.250 mm，0.25 μm膜厚）和FID检测器。升温程序如下：初始温度50°C保持1 min，以10°C/min升至160°C，再以20°C/min升至230°C并保持10 min。所有结果报告为三次生物学重复的平均值。
【数据】样品量：400 μL；离心：12,000 rpm、2 min；盐酸浓度：3 M；沸水浴：5 min；冰浴：5 min；丙酮提取：1 mL、20 min；滤膜：0.22 μm；HPLC色谱柱：C18（4.6 × 250 mm，5 μm）；流动相：乙腈:甲醇:异丙醇=5:3:2；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：450 nm；GC色谱柱：HP-5MS（30 m × 0.250 mm，0.25 μm）；升温程序：50°C保持1 min→10°C/min至160°C→20°C/min至230°C保持10 min
2.6 5-L生物反应器补料分批发酵
取YPD琼脂平板上的菌株BI01单菌落接种5-L生物反应器进行补料分批发酵。单菌落首先接种至3 mL液体YPD培养基中过夜培养。该一级种子液随后转入200 mL新鲜YPD培养基中制备二级种子液。在30°C、220 rpm培养16 h后，以10%的初始体积比将二级培养物接种至5-L生物反应器。补料分批发酵以2 L YPD培养基启动。使用2.5 M H₂SO₄和5 M NH₃·H₂O自动维持pH为5.5。温度控制在30°C，通气速率设为每分钟每体积2体积（vvm），溶解氧（DO）水平维持在35%以上。培养12 h后加入10%（v/v）的十二烷作为覆盖层。当初始葡萄糖在20 h耗尽时，开始补料。补料液含500 g/L葡萄糖、9.0 g/L KH₂PO₄、3.5 g/L K₂SO₄、0.28 g/L Na₂SO₄、5.12 g/L MgSO₄·7H₂O、10 mL/L微量元素溶液和12 mL/L维生素溶液。补料以2 mL/min的恒定速率供给。
【数据】pH：5.5（2.5 M H₂SO₄/5 M NH₃·H₂O调节）；温度：30°C；通气速率：2 vvm；DO：>35%；十二烷添加：10%（v/v）、12h后；补料起始时间：20h；补料组成：500 g/L葡萄糖、9.0 g/L KH₂PO₄、3.5 g/L K₂SO₄、0.28 g/L Na₂SO₄、5.12 g/L MgSO₄·7H₂O、10 mL/L微量元素、12 mL/L维生素；补料速率：2 mL/min
研究结果
3.1 β-胡萝卜素生物合成途径的筛选与强化
GGPP是β-胡萝卜素生物合成的必需前体。为在酿酒酵母BY4741中建立β-胡萝卜素生产，首先强化了底盘菌株中GGPP的供给。由于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGr）是MVA途径的限速酶[20]，因此同时过表达了内源截短型tHMG1和来自Ruegeria pomeroyi的异源NADH依赖性HMGr[21]（图1A）。已有研究表明，将GGPP合酶（BTS1）与FPP合酶（ERG20）融合可有效提高萜类化合物产量[22]。近期，通过将BTS1与ERG20 F96C突变体及米替二烯合酶融合，实现了米替二烯的高水平生产（172.77 mg/L）[23]。据此，将该融合表达模块与两个HMGr基因（tHMG1和NADH-HMGr）一起整合到染色体GAL80位点，获得工程菌株BC00。GAL80的缺失解除了GAL启动子系统对半乳糖的依赖性，使异源基因能够组成型高水平表达。
目前，工程微生物中β-胡萝卜素生物合成主要采用两条途径：1）来自三孢布拉霉的番茄红素环化酶（CarRA）与来自毛霉的八氢番茄红素脱饱和酶（CarB）的组合；2）来自红发夫酵母的双功能酶CrtYB——同时具有八氢番茄红素合酶和番茄红素环化酶活性——与八氢番茄红素脱饱和酶CrtI配对。选择这些系统是基于它们在酵母中作为最常用β-胡萝卜素生物合成模块的广泛文献记录[20,24]。作者承认这些酶来自不同真菌门，可能在蛋白质折叠、膜定位或辅因子需求方面存在差异。为尽量减少初始筛选中的潜在偏差，所有基因均针对酿酒酵母表达进行了密码子优化，置于相同的启动子和终止子下，并整合到相同的基因组位点，以确保可比较的表达环境。Liang等人先前的工作表明，来自三孢布拉霉的BtCrtI在番茄红素生产和调控类胡萝卜素谱方面表现出更优性能。因此，选择BtCrtI用于途径构建。
两种异源基因组合均整合到菌株BC00中。所得菌株BC01和BC02分别产生1.99 mg/L和1.28 mg/L的β-胡萝卜素。由于CarRA-CarB组合表现出更高的β-胡萝卜素生产能力（图1B），选择其作为后续优化研究的基础途径。
【数据】菌株BC00：整合tHMG1、NADH-HMGr、ERG20 F96C-BTS1融合模块于GAL80位点；菌株BC01（CarRA+CarB组合）：β-胡萝卜素1.99 mg/L；菌株BC02（CrtYB+CrtI组合）：β-胡萝卜素1.28 mg/L；米替二烯参考产量：172.77 mg/L
3.2 通过融合蛋白策略强化β-胡萝卜素生产
酶融合技术将多个功能酶共价连接成单条多肽链，已被证明可增强酶-酶协同作用并促进底物通道效应，从而提高途径通量和产物产量[25–27]。融合CarRA和CarB的理论依据是底物通道原理——将连续作用的酶拉近可产生高局部浓度的中间产物，并最大限度地减少竞争途径的干扰[28]。此外，接头序列的选择可显著影响融合蛋白的功能，因为接头长度和柔性会影响融合结构域的空间构型[29]。
为促进GGPP向β-胡萝卜素的转化，使用四种不同接头——Linker1（GSTSSGSSG）、Linker2（GSTSSG）、Linker3（GGG）和Linker4（GGGS）（图2A）——将CarRA和CarB融合。相应的融合构建体（CarRA–linker–CarB）整合到菌株BC01中。融合表达显著提高了大多数菌株的β-胡萝卜素产量。除携带Linker3（GGG）的BC05外，所有其他融合菌株的β-胡萝卜素滴度均显著高于对照菌株BC01（图2C）。产量最高的菌株为BC04，表达CarRA–Linker2–CarB融合蛋白，β-胡萝卜素达到13.74 mg/L——比BC01（1.99 mg/L）提高约6.9倍。
选择融合CarRA和CarB基于两点考虑。第一，这两种酶催化连续反应：CarB通过四次脱饱和步骤将八氢番茄红素转化为番茄红素，CarRA随后将番茄红素环化为β-胡萝卜素。番茄红素是不稳定的中间产物，容易发生非酶异构化和降解；两种酶之间的物理邻近可能有助于引导该中间产物并减少损失。第二，先前研究已确定八氢番茄红素脱饱和酶[24]和CarRA[30]都是类胡萝卜素生物合成中的限速步骤。具体而言，平衡CarRA和CarB的表达水平已被证明可减少八氢番茄红素和番茄红素的积累，同时提高β-胡萝卜素产量。CarRA是一种双功能蛋白，包含N端番茄红素环化酶结构域和C端八氢番茄红素合酶结构域，两者之间由推定蛋白酶切割位点分隔[31]。
尽管酶融合提高了两步酶促反应的效率，但也给酶带来了空间约束。为进一步研究CarRA和CarB在β-胡萝卜素生物合成中的功能作用和潜在化学计量关系，在BC04背景下共表达游离形式的CarRA和CarB构建了菌株BC07。同时分别引入额外拷贝的CarRA–Linker1–CarB和CarRA–Linker2–CarB构建菌株BC08和BC09。三株重组菌株的β-胡萝卜素产量均显著增加（图2C），表明CarRA和CarB表达水平提高有助于类胡萝卜素产量增加。其中，菌株BC07（游离额外拷贝）达到最高滴度26.29 mg/L，超过融合菌株BC08（19.58 mg/L）和BC09（21.22 mg/L）。
鉴于BC07-BC09的拷贝数增加相似，BC07的优越性能表明，灵活的化学计量比刚性1:1融合更具优势。相比之下，额外的游离CarRA和CarB拷贝可能改善酶协作，从而可能获得更高的β-胡萝卜素产量。此外，融合蛋白可能限制酶活性位点的构象动力学，从而降低催化效率并促进β-胡萝卜素的局部积累，这可能加剧反馈抑制。相比之下，共表达允许酶的空间分布，可能缓解此类抑制效应。例如，在细胞色素P450系统中已清楚证明，P450和CPR（细胞色素P450还原酶）的最佳催化效率不一定需要1:1共表达。相反，优化电子传递效率需要调节两种酶之间的比例[32]。这些观察表明CarRA和CarB之间的特定相互作用机制值得进一步研究。
尽管早期阶段ERG20 F96C和BTS1的融合表达已产生β-胡萝卜素，但产量仍然相对较低。受天然多功能酶结构特征的启发——如米替二烯生物合成合酶理性设计中所展示的线性组装实现221.5 mg/L滴度的范例[23]——采用了类似策略。天然双功能酶通常含有C端异戊烯基转移酶结构域，可自发组装成多聚体，促进高效GGPP合成并将底物直接引导至下游环化酶结构域[33]。为增强工程菌株BC07中的GGPP供给，构建了三种人工多功能酶PvPT、GsPT和CcPT——分别将其各自的Fink型异戊烯基转移酶序列与CarRA融合，同时共过表达CarB（图2B）。作为对照，通过整合ERG20 F96C∼BTS1融合构建菌株BC13。
【数据】四种接头：Linker1（GSTSSGSSG）、Linker2（GSTSSG）、Linker3（GGG）、Linker4（GGGS）；菌株BC04（CarRA–Linker2–CarB）：β-胡萝卜素13.74 mg/L（较BC01提高6.9倍）；菌株BC05（Linker3）：无显著提高；菌株BC07：β-胡萝卜素26.29 mg/L；菌株BC08：19.58 mg/L；菌株BC09：21.22 mg/L；米替二烯线性组装参考产量：221.5 mg/L
3.3 增强乙酰辅酶A和NADPH供给对β-胡萝卜素生产的影响
（以下内容对应原文结果部分3.3节，涉及角鲨烯途径下调、PDH旁路强化乙酰辅酶A供给及辅因子再生的影响）
【数据】原文未详述本节完整数值
3.4 调控脂滴合成水平与大小对β-胡萝卜素生物合成的影响
（以下内容对应原文结果部分3.4节，涉及脂滴合成相关基因表达强化及脂滴大小调控对β-胡萝卜素积累的影响）
【数据】原文未详述本节完整数值
3.5 由β-胡萝卜素生产β-紫罗兰酮
在获得高产β-胡萝卜素的菌株后，引入矮牵牛来源的裂解酶PhCCD1，将β-胡萝卜素裂解为β-紫罗兰酮。摇瓶培养中，β-紫罗兰酮产量达到14.26 mg/L，同时检测到残余β-胡萝卜素水平（图5A）。在5-L生物反应器中进行补料分批发酵，追踪了细胞生长和β-紫罗兰酮滴度的时间曲线（图5B）。发酵过程中β-紫罗兰酮滴度持续上升，最终达到51.86 mg/L。
【数据】摇瓶β-紫罗兰酮产量：14.26 mg/L；5-L生物反应器β-紫罗兰酮产量：51.86 mg/L
讨论与解读
本研究成功构建了一株能够从头生物合成β-胡萝卜素和β-紫罗兰酮的工程酿酒酵母BY4741菌株。首先评估了两种将GGPP转化为β-胡萝卜素的异源酶组合。作者承认初始酶筛选未控制不同门类来源酶之间可能存在的蛋白质表达或膜靶向差异。然而，CarRA + CarB系统在相同条件下的持续优越性证明了其选择的合理性，未来研究可包括Western blot和定位分析以进一步比较这些系统。在此基础上，融合表达策略加上额外拷贝的游离形式CarRA和CarB显著提高了β-胡萝卜素产量。为进一步增加GGPP积累，构建了包含天然多功能酶PT与CarRA的融合蛋白。随后通过系统代谢工程增强MVA途径通量，包括下调竞争性角鲨烯分支、实施PDH旁路以增加乙酰辅酶A供给，以及优化辅因子再生以提高NADPH水平。最后，通过调控脂滴合成和大小，扩大了β-胡萝卜素的胞内储存能力，摇瓶滴度达到86.04 mg/L。在此高产菌株基础上引入β-紫罗兰酮合成基因PhCCD1，实现了β-紫罗兰酮的直接生产。
编译者解读
本研究展示了典型的"底盘工程-途径筛选-融合优化-前体供给-储存扩容"多层级代谢工程策略。值得关注的是，作者在酶融合策略中发现了刚性1:1融合并非最优——游离共表达（BC07）反而优于融合表达（BC08/BC09），这为萜类合成途径中多亚基酶的组装方式提供了重要参考。脂滴工程的引入也体现了真核宿主中产物储存空间作为限速因素的新认知。局限在于初始酶筛选未进行蛋白表达水平的归一化验证，且β-紫罗兰酮最终产量距离工业化仍有差距。该策略框架对其它萜类化合物的酵母异源生产具有直接借鉴价值。
参考来源
Liu Y. Metabolic engineering of the β-carotene synthesis pathway in Saccharomyces cerevisiae for the production of β-ionone. Biochemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.bej.2026.110304
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110304