来源：A circular biorefinery approach for mango and lemon industrial waste: on-site Aspergillus welwitschiae cellulase production, enzymatic hydrolysis and bioethanol fermentation（Biomass and Bioenergy）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
芒果皮与柠檬渣是产量巨大的农业加工残余物，富含碳水化合物而木质素含量低，却常因废弃处理造成环境负担。商业纤维素酶的高成本是制约其生物转化经济性的主要瓶颈。本研究从柠檬皮中分离鉴定了一株Aspergillus welwitschiae真菌，直接以两种果皮残渣为碳源进行 submerged fermentation 现场产酶，经超滤浓缩后用于酶解糖化，最终由酿酒酵母发酵生成生物乙醇。全流程在单一均质批次原料上完成，省去物理化学预处理，展示了一条低成本的循环生物精炼路径。
研究背景
全球每年产生约50亿吨农业废弃物，不当处置带来温室气体排放、渗滤液污染及病原传播等系列问题。芒果皮（MP）与柠檬渣（LP）作为典型的水果加工残余物，木质纤维素含量高、养分丰富，是生物转化的优质底物。然而，商业纤维素酶价格高昂，直接制约了此类残渣糖化与乙醇生产的经济可行性。在生物精炼框架内，利用真菌发酵实现现场产酶，被视为替代外购酶的可持续路径。本研究以MP和LP为底物，分离并鉴定了一株曲霉属真菌，在无预处理条件下直接进行 submerged fermentation 产酶，评估多种工艺参数对酶活的影响，并将粗酶浓缩后用于酶解与乙醇发酵，检验整合生物工艺的技术可行性。
研究方法
2.1 芒果皮与柠檬渣样品的表征
芒果皮残渣（5 kg，湿基，Mangifera indica）采集自当地加工厂 Productos Orgánicos del Volcan。柠檬渣（5 kg，湿基，Citrus aurantifolia）购自柑橘皮加工企业 International Flavor & Fragrances。两家供应商均位于墨西哥 Tecoman。芒果皮标记为 MP，柠檬渣标记为 LP，后者为柠檬皮果胶酸法提取后的工业副产物。样品运抵实验室后于 −20 °C 储存待用。MP 以 1:10 固液比加去离子水热烫 10 min 以灭活内源酶，LP 不经任何处理。固体经空气干燥装置（Presto Dehydrator）于 50 °C 干燥 24 h。干燥物料用实验室粉碎机（Thomas Scientific, Thomas-Wiley Model 4）粉碎过 1 mm 筛，经振动筛分成三个粒径等级：1.0–0.84 mm（Mesh 10）、0.84–0.59 mm（Mesh 20）、<0.59 mm（Mesh 30）。生物处理前不施加任何物理化学预处理，目的是评估固体作为真菌生长与酶诱导支持物的能力，同时减少工艺步骤，契合低成本整合生物精炼理念。不同粒径分别装批，用于考察其对 submerged fermentation 真菌生物加工的影响——底物粒径可显著影响微生物的可及性。MP 和 LP 的同一加工批次同时用于产酶实验及后续水解-发酵实验（图1），单一均质批次可最大限度减少成分差异，保证整合生物工艺中底物质量的一致性。
2.2 真菌分离与保藏
目标真菌分离自储存期间柠檬（Citrus aurantifolia）果皮标本上生长的菌落。真菌孢子接种于酸化马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，BD Difco）平板上，培养基含 10% 酒石酸（单独灭菌，121 °C，15 min），使最终 pH 调至约 3.5，以抑制细菌生长。菌株自单菌落多次传代培养，28–30 °C 培养 7 天至获得完全分离的稳定培养物。平板于 4 °C 冰箱保存。需要指出，本研究未进行定性纤维素酶筛选步骤，仅获得一株真菌分离物并完成全面表征。该唯一菌株接种于装有 PDA 的锥形瓶中，28–30 °C 培养 5–7 天。孢子以磁力搅拌棒配合 20% 甘油溶液收获，分装至微量管中于 −20 °C 保藏。
2.3 形态学与分子鉴定
采用微培养法在受控条件下观察真菌生长的形态学特征。将小块 PDA 置于培养皿中，获得真菌小菌落。以乳酚棉蓝染液进行显微观察，详细记录分生孢子梗、分生孢子与菌丝结构，评估曲霉属典型特征。载玻片于 100 倍总放大倍数下观察。
#### 2.3.1 分子表征
100 mL 基础培养基（葡萄糖 [Sigma Aldrich] 10 g/L，胰蛋白胨 [Neogen] 5 g/L，酵母提取物 [Jalmek] 5 g/L）经 121 °C、15 min 灭菌后，接种来自 7 天 PDA 平板培养的真菌孢子，于 28–30 °C、150 RPM 振荡培养 72 h。随后使用商业 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA，以保证下游分子分析所需纯度与产量。以单孢培养物为材料，用 ITS1 和 ITS2 引物扩增并测序 28S rRNA 区域。扩增子经纯化后送至墨西哥 Guanajuato 州 Irapuato 市 CINVESTVA-IPN 基因组服务实验室测序。测序色谱图以 SnapGene Viewer™ 7.2.0 软件分析。校正后的序列用 Mega BLAST 程序与 NCBI GenBank 数据库比对。最相似的 Aspergillus spp. 相关序列以 FASTA 格式从 GenBank 下载（图3）。序列以 CLUSTALW 算法按预设参数比对，并在 MEGA 11 中手工校正。系统发育分析采用最大似然法（ML），基于 Kimura 2-parameter G + I 模型。空位按 95.0% 覆盖度作部分删除处理，采用 NNI 启发式方法优化树拓扑，自展重复 1000 次。Fusarium sp. 作为外群。
2.4 Submerged fermentation 与纤维素酶产量优化
#### 2.4.1 接种物制备
将培养了 5 天的真菌（500 mL 锥形瓶，PDA 培养基）用于制备孢子悬浮液，悬浮于无菌 0.02% Tween 80 中，确保分生孢子均匀分散。孢子通过磁力搅拌轻轻刮取琼脂表面的菌丝体获得，血球计数板测定浓度以标准化发酵初始接种量。全部操作在层流罩内无菌条件下进行。
#### 2.4.2 固体水果残渣 submerged fermentation 产纤维素酶
产酶实验在 250 mL 挡板锥形瓶中进行，每瓶含 100 mL 培养基。培养基参照文献配制并略作修改，组成如下（g/L）：(NH4)2SO4 2、胰蛋白胨 2、酵母提取物 1、Na2HPO4 1、KH2PO4 1、FeSO4·7H2O 0.01、MgSO4·7H2O 0.03、CaCl2 0.3、MnSO4·H2O（原文未给出具体数值）、ZnSO4·7H2O 0.001、CoCl2·6H2O 0.3。MP 或 LP 粉末作为碳源分别加入独立实验批次中，粒径（Mesh 10–Mesh 30）与固液比（0.5–1.5%，w/v）按 23 析因实验设计设定（见 2.4.3 节与表 2）。培养基 pH 调至 4.0，121 °C 灭菌 15 min。每瓶接种 108 个孢子，于 28–30 °C、轨道振荡（100–150 RPM，见表 2）条件下培养 120 h。培养结束后，菌丝体经棉花过滤分离，再经 0.45 μm 膜（Paal Co.）过滤。粗酶液收集后于 −20 °C 保存，用于后续纤维素酶与果胶酶活性测定。以 MP 制备的粗酶液标记为 MPE，以 LP 制备的标记为 LPE（图1）。
#### 2.4.3 纤维素酶产量优化的析因设计
为研究以 MP 或 LP 为底物进行 submerged fermentation 生产纤维素酶粗提液（MPE/LPE）的工艺条件，基于表 2 数据提出 23 析因实验设计。该设计系统评估了影响纤维素酶产量的三个变化因素（自变量）：底物粒径（筛网目数，X1）、固液比（% w/v，X2）与轨道振荡速度（RPM，X3），各设两个水平及一个中心点，从而识别酶生物合成的最适条件。共执行 9 种实验条件，每组三次重复。响应变量为羧甲基纤维素酶（CMCase）活性，作为定量纤维素酶指标。
研究结果
3.1 显微真菌培养与头部形态
PDA 平板上的菌落呈黑色颗粒状表面，边缘白色。真菌产生深色球形分生孢子，具分枝棉絮状菌丝区（图2A、B）。培养皿背面呈白色、光滑至微粗糙表面。上述宏观特征与此前报道的一株内生真菌 Aspergillus sp. 一致。另一特征为圆形淡黄色色素（晕圈）的出现——72 h 前不显现，96 h 时存在（图2C），延长培养时间后消失。显微分析显示分生孢子梗具有典型曲霉形态：辐射状分生孢子头由柄和球形顶囊构成（图2D），具透明瓶梗（图2E），分生孢子头呈链状和堆积状排列（图2F）。这些显微特征与曲霉属 Nigri 组（黑曲霉）的典型特征一致。
3.2 分子表征
为确证形态学鉴定结果，从单孢培养物中提取 DNA，以引物扩增 28S 大亚基核糖体 RNA 的 ITS1/ITS2 区域。系统发育分析以 Aspergillus niger 序列为近缘分支、Fusarium sp. 为外群（远缘分支），在 MEGA11 中用最大似然法完成（图3），共纳入 8 条 Aspergillus spp. 序列与 1 条 Fusarium sp. 序列。分离的 Aspergillus sp. 与 Aspergillus welwitschiae 分支聚在一起，与菌株 CK2-A 和 NWUSeq31（MK841443.1）同支。BLAST 分析显示与 Aspergillus welwitschiae（GenBank: MK841440.1; OQ421646.1; MK841443.1, OQ727564.1）的相似度为 99.63%。特异性形态标记与分子数据的结合，可从近缘 Aspergillus 物种中实现种级鉴定。基于序列数据与系统发育分析，该分离真菌被确认为 Aspergillus welwitschiae。本研究中 Aspergillus welwitschiae HNL01 的 28S rRNA 基因核苷酸序列已提交至 NCBI GenBank，登录号为 PX220304。
【数据】相似度：99.63%；GenBank登录号：PX220304；比对序列数：8条 Aspergillus spp. + 1条 Fusarium sp.
3.3 固体残渣的化学组成
MP 与 LP 残渣的组成分析结果列于表 1。干燥 MP 与 LP 的水分含量分别为 5.49 ± 0.26% 和 8.41 ± 0.07%。芒果残渣含粗蛋白 3.36 ± 0.09%、脂肪 3.20 ± 0.05%、灰分 2.56 ± 0.01%；粗纤维含量约 19.15 ± 0.27%，碳水化合物组成 66.24 ± 0.59%。MP 与 LP 的纤维素含量分别为 30.32 ± 1.91% 和 39.31 ± 2.62%。这些数值与 Wongkaew 等报道的四个芒果品种平均值相近（粗蛋白 7.5%、粗脂肪 1.9%、灰分 0.39%、粗纤维 15.7%）。LP 的粗蛋白含量为 9.40 ± 0.91%，脂肪与灰分含量分别为 2.52 ± 0.02% 和 3.14 ± 0.05%；粗纤维 17.76 ± 0.54%，碳水化合物组成 58.77 ± 0.76%。Patrón-Vázquez 等报道的柠檬皮粉近似分析为：蛋白 5.97%、脂肪 1.29%、灰分 6.39%、粗纤维 15.55%、碳水化合物 79.15%。两种固体的木质素含量相近：MP 为 8.58% ± 1.08%，LP 为 7.99 ± 2.02%。总还原糖含量 MP 为 69.92 ± 3.6%，LP 为 57.39 ± 1.08%（数据未显示）。不同方法测定碳水化合物与还原糖所得结果具有相似性。此外，本研究的木质素含量与 Boluda-Aguilar 等对柠檬皮报道的 7.6% 相符。蛋白、木质素与碳水化合物浓度是残渣价值化的重要组成指标——芒果与柠檬残渣的近似化学结果显示蛋白约 10%、碳水化合物约 80%、木质素低于 10%。芒果与柠檬残渣的品质使其成为生产生物乙醇的可行原料。
【数据】MP水分：5.49±0.26%；LP水分：8.41±0.07%；MP粗蛋白：3.36±0.09%；MP脂肪：3.20±0.05%；MP灰分：2.56±0.01%；MP粗纤维：19.15±0.27%；MP碳水化合物：66.24±0.59%；MP纤维素：30.32±1.91%；LP纤维素：39.31±2.62%；LP粗蛋白：9.40±0.91%；LP脂肪：2.52±0.02%；LP灰分：3.14±0.05%；LP粗纤维：17.76±0.54%；LP碳水化合物：58.77±0.76%；MP木质素：8.58±1.08%；LP木质素：7.99±2.02%；MP总还原糖：69.92±3.6%；LP总还原糖：57.39±1.08%
3.4 固体水果残渣 submerged fermentation 产纤维素酶的优化
以 Aspergillus welwitschiae 为产酶菌株，MP 与 LP 为底物，采用 23 析因设计进行纤维素酶产量优化（表 2）。由于研究仅涉及单一真菌分离物，未进行定性纤维素分解筛选。定量纤维素酶活（CMCase）因此构成该菌株酶学评价的分析步骤。CMCase 被选为响应变量，因其在监测发酵过程中的酶诱导方面更为灵敏。FPase 活性测定用于评估水解过程中的整体纤维素分解性能，而非发酵优化指标。鉴于 MP 与 LP 的纤维素与果胶的整合性质，真菌表达的纤维素酶与果胶酶均纳入后续分析。为促进葡萄糖（主要乙醇前体）的生成，CMCase 活性作为主要描述与讨论对象。
表 2 所列 MPE 的 CMCase 响应变量结果显示，以 MP 为底物的发酵提取液最高值为 0.54 ± 0.07 U/mL，条件为粒径 >0.59 mm（30 Mesh）、固液比 1.5%、振荡速度 150 RPM。ANOVA 结果显示振荡因素对 CMCase 有显著影响（p = 0.0098），而粒径（p = 0.81）与固液比（p = 0.40）对响应变量无显著影响。统计模型显示，固液比与振荡速度的交互作用对 CMCase 活性有显著影响（p < 0.05）。这一趋势可在图 4A 中观察到：较高固液比（1.5%）条件下 CMCase 活性更高，而粒径水平提升对酶活性无影响。
已有文献报道了以 MP 为底物的类似发酵体系的 CMCase 结果。此前研究表明，以 MP 为底物、Aspergillus niger 3T5B8 进行固态发酵，采用析因实验设计，多聚半乳糖醛酸酶等水解酶活性可达 1.9 FPase 和 4.2 U/mL。该报道描述了 Aspergillus 代谢谱的多样性，同时评估了木聚糖酶与蛋白酶活性。另一项类似发酵研究报道粗酶液果胶酶活性约为 37 U/mL。Kumar 等采用 5g/100 mL MP 粉末、150 RPM、120 h 的 submerged fermentation，以 Aspergillus foetidus NCIM 514 发酵，多聚半乳糖醛酸酶活性在 8–12 U/mL 间波动。需要指出，不同研究间实验参数的差异会显著影响结果的可重复性与可比性。目前大多数以果皮为底物获取真菌裂解酶的研究，聚焦于降解果胶等结构性碳水化合物以释放单糖，目的是降低相应果肉或果汁前体的粘度。然而，MP 和 LP 中果胶虽是重要组分，其葡聚糖组分……
【数据】MPE最高CMCase活性：0.54±0.07 U/mL；条件：粒径>0.59 mm（30 Mesh）+ 固液比1.5% + 150 RPM；振荡因素p值：0.0098；粒径p值：0.81；固液比p值：0.40；交互作用：p<0.05
讨论与解读
本研究成功展示了以 MP 和 LP 农业工业废弃物生产生物乙醇的整合生物工艺的技术可行性。利用 Aspergillus welwitschiae 通过 submerged fermentation 进行现场产酶，为生物乙醇合成提供了一条替代性的、技术可行且可持续的路径。对 Aspergillus welwitschiae 的形态学与分子水平详细表征确认了其产酶的适用性。MP 与 LP 的近似化学分析确立了其作为富含碳水化合物、低木质素原料的潜力。纤维素酶产量优化显示，固体负荷对 MP 与 LP 发酵中的酶活性均有显著影响。值得注意的是，浓缩酶提取液的果胶酶与 β-葡萄糖苷酶活性高于内切葡聚糖酶与 FPase 活性；鉴于底物富含果胶的特性，多酶协同策略更适用于水解目的。改善通气系统是未来工作的延伸方向，产酶规模的放大亦需在后续下游工艺中解决。浓缩酶液的酶解有效糖化了果皮，生成了可发酵糖。酶量与固体负荷均为显著因素，其中固体负荷对还原糖产量的影响更大。
编译者解读
该研究的核心价值在于"以废治废"的整合设计——省去物理化学预处理，利用同一批果皮残渣完成从真菌培养、产酶到酶解与发酵的全链条，原料与工艺的连贯性显著降低了生物精炼的系统成本。将果胶酶活性纳入考量尤为务实，因为芒果皮与柠檬渣的果胶组分恰恰是单一纤维素酶难以克服的障碍。局限同样明显：CMCase 产量（0.54 U/mL）与最终乙醇浓度（约 3 g/L）仍处于实验室水平，距工业化相去甚远；单一真菌分离株的产酶潜力与遗传改造空间尚未充分挖掘。若能将通气条件优化与菌株定向进化结合，该工艺有望在果皮类废弃物的分布式能源转化中占得一席之地。
参考来源
Vázquez-Vuelvas OF, et al. A circular biorefinery approach for mango and lemon industrial waste: on-site Aspergillus welwitschiae cellulase production, enzymatic hydrolysis and bioethanol fermentation. Biomass and Bioenergy, 2026. DOI: 10.1016/j.biombioe.2026.109363
DOI: 10.1016/j.biombioe.2026.109363