来源：Systematic engineering of Pichia pastoris for high-level production of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hCSF2）是临床重要的治疗性糖蛋白，其糖基化异质性显著影响药效与半衰期。本研究对毕赤酵母GS115进行系统化工程改造，通过多位点多拷贝整合、信号肽筛选与组合应用、以及蛋白质折叠与转运通路强化，最终在3-L生物反应器中实现rhCSF2产量达3.4 g/L，较此前酵母宿主最高产量提升一个数量级。该策略在糖基化人源化改造菌株SuperMan5中同样适用，产量达4.3 g/L，并实现更均一的人源化N-糖链修饰。
研究背景
人集落刺激因子家族包含三个成员——巨噬细胞集落刺激因子（CSF1/M-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（CSF2/GM-CSF）和粒细胞集落刺激因子（CSF3/G-CSF），这些糖蛋白调控造血细胞增殖分化及哺乳动物髓系细胞生成。近年临床研究显示，hCSF2不仅用于治疗自身免疫疾病、骨髓移植和辐射损伤，还能通过促进交叉呈递树突状细胞分化激发抗肿瘤免疫应答。天然hCSF2由127个氨基酸组成，含两个N-糖基化位点和四个O-糖基化位点。糖基化异质性不仅导致hCSF2表观分子量差异显著，还深刻影响其生理活性与药代动力学特性——例如天然hCSF2的体内半衰期明显长于去糖基化形式。因此，hCSF2的生产必须充分考虑糖基化影响。传统从天然来源提取hCSF2的方法受限于原料与产量，亟需高效的重组表达平台。
研究方法
2.1 菌株、载体与培养基
本研究所用全部菌株与载体见补充材料。构建菌株GGM11、GGM12、GGM13、GGM14、GGM15、GGM16、GGM17、GGM18及MGM15时，相应载体经SalI线性化后转化至毕赤酵母GS115或SuperMan5。采用定量PCR（qPCR）验证仅单拷贝rhCSF2表达盒整合至基因组，排除HIS4位点多拷贝整合的可能（见补充材料）。其余突变菌株均通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑方法构建。相关核苷酸序列见补充材料。
大肠杆菌在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）中培养，添加100 mg/L氨苄青霉素或硫酸卡那霉素。毕赤酵母在30°C下分别于YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）、BMGY培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、1.34%酵母氮碱、0.1 M磷酸钾缓冲液[pH 6.0]、4×10⁻⁵%生物素、40 g/L甘油）、BMMY培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、1.34%酵母氮碱、0.1 M磷酸钾缓冲液[pH 6.0]、4×10⁻⁵%生物素、1%（v/v）甲醇）或MD培养基（20 g/L葡萄糖、1.34%酵母氮碱、4×10⁻⁵%生物素）中培养。YPD和MD平板额外添加20 g/L琼脂。YPD筛选平板含250 mg/L G418硫酸盐或1.37 g/L NaF。甘油补料培养基为灭菌的50%（w/v）甘油溶液，使用前按12 mL/L添加PTM1微量元素（6.0 g/L CuSO₄·5H₂O、0.08 g/L NaI、3.0 g/L MnSO₄·H₂O、0.2 g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.02 g/L H₃BO₃、0.92 g/L CoCl₂·6H₂O、20.0 g/L ZnCl₂、65.0 g/L FeSO₄·7H₂O、0.2 g/L生物素、5 mL/L H₂SO₄）。甲醇补料培养基为100%甲醇，使用前按12 mL/L添加PTM1。上述培养基与试剂的配制主要参照Invitrogen公司的Pichia Expression Kit及Pichia Fermentation Process Guidelines的标准方案。
【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；LB培养基组分：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl；抗生素浓度：100 mg/L；毕赤酵母培养温度：30°C；YPD培养基：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖；BMGY含40 g/L甘油；BMMY含1%（v/v）甲醇；MD含20 g/L葡萄糖；YPD筛选平板：250 mg/L G418或1.37 g/L NaF；PTM1添加量：12 mL/L
2.2 细胞生长测定
摇瓶发酵期间，采用紫外-可见分光光度计（Thermo Fisher, Evolution 220）测量600 nm波长下的光密度值（OD600）监测细胞生长。补料分批发酵中，以湿细胞重量监测细胞生长：将各取样时间的发酵液充分混匀，取三个1 mL等分试样分别转移至1.5 mL离心管中。离心并去除上清后，细胞沉淀用去离子水洗涤一次。随后将三管细胞沉淀分别称重，计算平均湿细胞重量。
【数据】OD600测定仪器：紫外-可见分光光度计（Thermo Fisher, Evolution 220）；湿重测定取样量：3×1 mL；洗涤：去离子水一次
2.3 摇瓶培养
从YPD平板挑取单酵母菌落接种至5 mL YPD液体培养基，30°C、220 rpm振荡培养至OD600达2.0–8.0。离心收集细胞沉淀，重悬于20 mL BMGY培养基中至初始OD600为0.2–0.4，同条件培养至OD600达2.0–8.0。离心后，细胞沉淀用无菌水洗涤一次，重悬于50 mL BMMY培养基中至初始OD600为1.0。随后于30°C、220 rpm振荡培养96 h，每24 h添加1%（v/v）甲醇。
【数据】YPD起始培养体积：5 mL；温度：30°C；转速：220 rpm；OD600范围：2.0–8.0；BMGY体积：20 mL；初始OD600：0.2–0.4；BMMY体积：50 mL；初始OD600：1.0；诱导时间：96h；甲醇添加：每24h加1%（v/v）
2.4 补料分批发酵
补料分批发酵方法主要参照Invitrogen公司Pichia Fermentation Process Guidelines。具体发酵步骤如下：从YPD平板挑取单菌落接种至50 mL YPD液体培养基，30°C、220 rpm培养至OD600达2.0–8.0。离心收集细胞，重悬于100 mL BMGY培养基至初始OD600为0.2–0.4，同条件培养至OD600达6.0–8.0。随后将种子培养物转移至含1 L BMGY培养基的3-L生物反应器中。初始发酵条件设为30°C、pH 6.0、通气速率1.0 vvm。搅拌转速（400–800 rpm）自动调节以维持溶解氧（DO）≥20%。培养持续至初始甘油耗尽——以DO急剧上升至100%为标志。随后以6.0 mL/h速率启动甘油补料。当湿细胞重量达200.0–220.0 g/L时停止补料，进入30分钟饥饿阶段。甘油完全耗尽后，启动甲醇补料诱导rhCSF2表达。诱导期间温度调至29.5°C，搅拌固定为800 rpm，DO维持≥20%。甲醇补料按以下方案进行：0–5 h为2.4 mL/h，6–24 h为3.6 mL/h，25–48 h为4.8 mL/h，49–120 h为6.0 mL/h。
【数据】种子液YPD体积：50 mL；BMGY体积：100 mL；初始OD600：0.2–0.4；发酵罐装液量：1 L BMGY；温度：30°C（诱导期29.5°C）；pH：6.0；通气：1.0 vvm；搅拌：400–800 rpm（诱导期固定800 rpm）；DO：≥20%；甘油补料速率：6.0 mL/h；补料停止湿重：200.0–220.0 g/L；饥饿时间：30 min；甲醇补料：0–5h 2.4 mL/h、6–24h 3.6 mL/h、25–48h 4.8 mL/h、49–120h 6.0 mL/h
2.5 rhCSF2的纯化
将诱导后的毕赤酵母培养液分装至50 mL离心管离心，收集上清并经0.45 μm滤膜过滤，获得粗蛋白提取液。将提取液上样至预平衡的镍柱。上样完成后，用Buffer A（2.42 g/L Tris、14.61 g/L NaCl、1.36 g/L咪唑，pH 8.0）洗涤层析柱以去除非特异性结合蛋白。随后用Buffer B（2.42 g/L Tris、14.61 g/L NaCl、34.04 g/L咪唑，pH 8.0）洗脱目标蛋白，收集约10–15 mL纯化组分。为进行缓冲液置换与浓缩，将洗脱液转移至超滤管中离心浓缩至体积减为250–500 μL。随后加入10 mL置换缓冲液（2.42 g/L Tris、14.61 g/L NaCl，pH 8.0），再次浓缩至250–500 μL。该置换步骤重复2–3次。最后从超滤装置中回收浓缩蛋白溶液，保存于−20°C。
【数据】过滤膜孔径：0.45 μm；Buffer A：2.42 g/L Tris、14.61 g/L NaCl、1.36 g/L咪唑，pH 8.0；Buffer B：2.42 g/L Tris、14.61 g/L NaCl、34.04 g/L咪唑，pH 8.0；洗脱收集体积：10–15 mL；浓缩终体积：250–500 μL；置换缓冲液体积：10 mL；置换次数：2–3次；保存温度：−20°C
2.6 蛋白浓度定量
蛋白浓度采用Bradford蛋白定量试剂盒（Sangon Biotech, C503031）测定。摇瓶培养样品中，rhCSF2水平通过从重组菌株上清蛋白含量中减去对照菌株GGM0或MGM0的上清蛋白含量来估算。补料分批发酵样品中，rhCSF2水平通过Bradford法结合ImageJ定量分析估算。
【数据】定量方法：Bradford法（Sangon Biotech, C503031）；摇瓶样品计算方式：重组菌上清总蛋白−对照菌上清总蛋白；发酵样品：Bradford法+ImageJ
2.7 SDS-PAGE分析
SDS-PAGE分析按照制造商方案（Yeasen Biotechnology, 20327ES62）进行。取30 μL发酵上清（经0.45 μm滤膜过滤）或纯化蛋白溶液，与10 μL 4×SDS-PAGE上样缓冲液混合，煮沸5–10 min使蛋白变性。随后依次向凝胶孔中加入4 μL蛋白marker及适量变性样品。
【数据】上清/蛋白样品量：30 μL；4×上样缓冲液：10 μL；煮沸时间：5–10 min；蛋白marker：4 μL；滤膜：0.45 μm
2.8 SDS-PAGE胶条质谱鉴定
将SDS-PAGE上30–40 kDa范围内差异表达的蛋白条带切下，按此前描述的方法进行LC-MS/MS鉴定。
【数据】胶条分子量范围：30–40 kDa；鉴定方法：LC-MS/MS
2.9 RNA-seq分析与实时荧光定量PCR（RT-qPCR）
菌株GGM42及对照菌株GGM0在BMMY培养基中诱导36 h后，收集细胞沉淀，采用此前描述的方法提取总RNA。随后进行转录组测序。文库构建、RNA-seq及生物信息学分析由诺禾致源科技股份有限公司（北京）完成。RT-qPCR按前述报道方法进行，以ACT1基因为内参对相对表达量进行归一化。
【数据】诱导时间：36h；培养基：BMMY；内参基因：ACT1
研究结果
3.1 rhCSF2表达盒在毕赤酵母多位点的多拷贝整合
异源基因整合至毕赤酵母基因组的拷贝数是决定最终蛋白产量的关键因素。传统单位点多拷贝整合策略依赖抗生素筛选，且通过同源重组丢失基因的风险较高。如图1A所示，为解决这一局限，研究者在毕赤酵母GS115的五个不同基因组位点整合了αMF-rhCSF2表达盒（简称αMF-rhCSF2），包括HIS4位点和四个已确认的中性位点（IntE13、IntE26、PNSIV9和PNSI16），旨在构建携带不同αMF-rhCSF2拷贝数的一系列重组菌株（见补充材料）。
摇瓶发酵显示，五株重组菌株的生长曲线均与对照菌株GGM0（GS115, HIS4::pPIC9）相当，表明增加基因拷贝数并未损害细胞生长（图1B）。rhCSF2产量随基因拷贝数递增：单拷贝菌株GGM11产量为51.0 ± 2.5 mg/L，双拷贝（GGM21）、三拷贝（GGM31）、四拷贝（GGM41）和五拷贝（GGM51）菌株产量分别为149.2 ± 0.4 mg/L、204.7 ± 2.0 mg/L、223.9 ± 2.4 mg/L和248.0 ± 2.0 mg/L（图1B）。与GGM11相比，GGM51的rhCSF2产量提高3.9倍，证实αMF-rhCSF2的多拷贝整合能有效提升毕赤酵母中rhCSF2的产量。然而，随着拷贝数增加，rhCSF2产量的增幅逐渐减小，提示αMF信号肽介导的分泌效率可能正接近上限。从发酵上清纯化后，GGM51所表达rhCSF2的SDS-PAGE分析显示分子量在25至40 kDa范围内的蛋白条带（图1C）。观察到的分子量异质性与rhCSF2序列中两个N-糖基化位点和四个O-糖基化位点一致——蛋白质糖基化已知会增加表观分子量。此外，在约15 kDa处观察到一条与rhCSF2非糖基化形式对应的微弱条带，与先前报道相符。
【数据】整合位点数：5个（HIS4、IntE13、IntE26、PNSIV9、PNSI16）；GGM11产量：51.0 ± 2.5 mg/L；GGM21产量：149.2 ± 0.4 mg/L；GGM31产量：204.7 ± 2.0 mg/L；GGM41产量：223.9 ± 2.4 mg/L；GGM51产量：248.0 ± 2.0 mg/L；GGM51/GGM11倍数：3.9倍；SDS-PAGE条带范围：25–40 kDa及约15 kDa
3.2 分泌信号肽的筛选
上述结果表明αMF的分泌能力对rhCSF2产量似乎存在上限。为突破此限制，研究者探索了毕赤酵母内源信号肽（SP），以期找到更高效的替代方案。本研究选取了七个已报道的内源SP（SP-0030、SP-DSE4、SP-MSB2、SP-PRY2、SP-FRE2、SP-DAN4和SP-FLO5）进行筛选与功能评价。沿用单拷贝菌株GGM11的构建策略，从亲本菌株GS115出发，构建了GGM12至GGM18菌株——每株携带一个含不同内源SP的单拷贝rhCSF2表达盒。
摇瓶发酵显示七个SP的分泌效率存在显著差异。如图1D所示，使用SP-PRY2和SP-FLO5可获得较高的rhCSF2产量，分别达71.1 ± 2.5 mg/L和66.6 ± 1.3 mg/L，较αMF-rhCSF2的51.0 ± 2.5 mg/L有大幅提升。相比之下，SP-0030、SP-DSE4、SP-MSB2和SP-FRE2导致的rhCSF2产量明显较低。值得注意的是，SP-DAN4未能介导任何可检测到的rhCSF2分泌表达。综合来看，这些结果证明内源信号肽SP-PRY2在增强rhCSF2分泌方面具有更优能力。
SP-PRY2的潜力通过将PRY2-rhCSF2表达盒（简称PRY2-rhCSF2）整合至多个位点（HIS4位点、中性位点IntE13和IntE26）进一步评估。如图1E所示，菌株GGM22（携带两个PRY2-rhCSF2）和GGM32（携带三个PRY2-rhCSF2）的生长与对照菌株GGM0基本一致。然而，GGM32的rhCSF2产量（148.0 ± 11.2 mg/L）低于GGM22（170.4 ± 5.1 mg/L），提示SP-PRY2赋予的分泌能力在整合两个表达盒后可能趋于饱和。与GGM21（携带两个αMF-rhCSF2）相比，GGM22的rhCSF2产量提高14.2%，但仍显著低于GGM51（携带五个αMF-rhCSF2）。SP-PRY2为何对rhCSF2效果最佳尚不清楚——关于Pry2的研究仍有限。据此前报道，Pry2是一种酵母病程相关蛋白，在内质网（ER）中结合游离甾醇和醋酸甾醇并将其转运至细胞表面，从而介导甾醇输出。由于Pry2的分泌与酵母细胞的生理状态密切相关，Pry2的分泌量可能受到一定限制。综上，这些结果表明SP-PRY2虽比αMF具有更高的分泌效率，但受拷贝数限制，最终制约了rhCSF2的整体产量。
【数据】SP-PRY2菌株产量：71.1 ± 2.5 mg/L；SP-FLO5菌株产量：66.6 ± 1.3 mg/L；αMF单拷贝产量：51.0 ± 2.5 mg/L；GGM22产量：170.4 ± 5.1 mg/L；GGM32产量：148.0 ± 11.2 mg/L；GGM22较GGM21提升：14.2%
3.3 分泌信号肽的组合应用
基于SP-PRY2与αMF各自的优势，研究者设计了一种组合策略以突破rhCSF2在毕赤酵母中的分泌瓶颈。如图1F所示，将αMF-rhCSF2依次整合至GGM22（携带两个PRY2-rhCSF2）的三个中性位点（IntE26、PNSIV9和PNSI16），分别生成菌株GGM33（携带两个PRY2-rhCSF2和一个αMF-rhCSF2）、GGM42（携带两个PRY2-rhCSF2和两个αMF-rhCSF2）和GGM52（携带两个PRY2-rhCSF2和三个αMF-rhCSF2）。
摇瓶发酵显示GGM33的生长与对照菌株GGM0相当（图1E）。GGM33的rhCSF2产量升至259.2 ± 4.1 mg/L，较GGM22提高52.1%。此外，虽然GGM42的生长较GGM0受损，但其rhCSF2产量更高，达386.8 ± 9.1 mg/L，较GGM33提高49.2%（图1E）。这些观察表明rhCSF2的高水平生产开始损害细胞生长，暗示毕赤酵母天然分泌途径对rhCSF2的分泌能力可能已接近极限。这一推测得到后续观察的佐证——GGM52在摇瓶发酵中rhCSF2产量回落至316.4 ± 28.6 mg/L（图1E）。总之，GGM42实现的高产rhCSF2证明信号肽的组合策略是增强毕赤酵母重组蛋白生产的有前景的方法。
【数据】GGM33产量：259.2 ± 4.1 mg/L（较GGM22提高52.1%）；GGM42产量：386.8 ± 9.1 mg/L（较GGM33提高49.2%）；GGM52产量：316.4 ± 28.6 mg/L
3.4 基于比较转录组学的蛋白折叠负担缓解
为阐明菌株GGM42生长表型改变的潜在原因，研究者对GGM42与对照菌株GGM0进行了比较转录组分析（BioProject: PRJNA1441818）。差异表达基因（DEGs）以FPKM值变化超过2倍为标准鉴定。在上调基因中，KEGG富集最显著的途径为分子伴侣与蛋白质折叠催化剂途径（图2A）。其他富集途径主要与酵母信号转导、氨基酸代谢和细胞生长相关。这些数据提示GGM42中rhCSF2的高水平生产增加了蛋白折叠负担，导致分子伴侣上调——如ATPase Kar2、热休克蛋白Hsp70（如Ssa2和Ssa4）及Hsp90（见补充材料）——这些分子伴侣均参与ER内蛋白质折叠辅助。下调基因的KEGG富集分析鉴定到与丙酮酸代谢、脂肪酸代谢和氨基酸代谢相关的途径，但均未显示强统计学显著性。
【数据】DEG判定标准：FPKM变化>2倍；上调最显著途径：分子伴侣与蛋白质折叠催化剂；上调分子伴侣：Kar2、Hsp70（Ssa2/Ssa4）、Hsp90；下调途径：丙酮酸代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢
讨论与解读
本研究对毕赤酵母GS115进行了系统化工程改造以实现rhCSF2的高水平生产。工程策略涵盖增加rhCSF2基因剂量、筛选合适信号肽、不同信号肽的组合应用以及强化蛋白质折叠与转运途径，构建了一系列产rhCSF2菌株。本研究首次证明rhCSF2表达盒的多位点整合及内源与外源信号肽的联合使用对提高rhCSF2产量至关重要。同时，分子伴侣与囊泡运输组分的过表达进一步缓解了分泌瓶颈。重要的是，该工程策略在人源化糖基化改造菌株SuperMan5中验证了普适性，实现了带有更均一人源化N-糖链的rhCSF2生产。经3-L生物反应器高密度发酵，两株优化菌株GGM83和MGM83实现了酵母表达系统中迄今报道的最高rhCSF2产量。该工作通过在人源化糖基化改造菌株中实现rhCSF2的高水平生产，为利用微生物系统高效生产人源治疗性糖蛋白奠定了基础。
【数据】GGM83与MGM83：3-L生物反应器中实现迄今酵母表达系统最高rhCSF2产量
编译者解读
从合成生物学工程逻辑看，本研究呈现了清晰的"步步为营"策略——拷贝数叠加遭遇分泌瓶颈后，转而筛选内源信号肽，再以组合信号肽策略突破单一信号肽的饱和限制，最后用转录组数据指导分子伴侣与转运通路的靶向强化，思路值得借鉴。3.4 g/L与4.3 g/L的产量数据确实亮眼，但需注意这建立在多轮基因组编辑与筛选的基础之上，工程周期较长。另外，SuperMan5菌株中实现人源化糖链修饰与高产兼得，对治疗性糖蛋白的微生物制造具有切实的推动意义。不足之处在于，分泌瓶颈的分子机制仍停留在转录组推测层面，Kar2等靶点的过表达效果有待更系统的蛋白水平验证。
参考来源
Cheng Z, et al. Systematic engineering of Pichia pastoris for high-level production of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135498
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135498