来源：Engineering Bacillus subtilis as a sustainable platform for the production of functional bile acids（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
胆汁酸7α-脱羟基化途径是肠道菌群中一个高效但难以异源重建的多步氧化还原反应链，传统研究依赖厌氧梭菌或体外酶法，规模化潜力受限。本研究首次在食品级好氧宿主枯草芽孢杆菌中完整重建该途径，通过模块化基因表达实现多种胆汁酸中间产物的可控积累。研究验证了BaiB、BaiA2、BaiCD等关键酶在枯草芽孢杆菌中的功能活性，并建立全细胞催化体系，为胆汁酸的可持续生物合成奠定平台基础。
研究背景
人体肠道菌群携带数百条代谢途径，是胃肠道中大多数小分子的主要来源，其中许多分子经血液循环影响外周组织与器官系统。初级胆汁酸的7α-脱羟基化是其中备受关注的途径之一——执行该功能的菌群数量虽少，却能高效处理浓度约1 mM的初级胆汁酸库，意味着该途径在少数细胞中通量极高。胆汁酸是胆固醇衍生的两亲性分子，在肝脏合成，主要功能是促进脂肪及脂溶性维生素的消化吸收。大量研究表明，胆汁酸还是调控多种生理过程的信号分子。初级胆汁酸包括胆酸（CA）和鹅脱氧胆酸（CDCA），经7α-脱羟基化途径转化为最丰富的次级胆汁酸——脱氧胆酸（DCA）和石胆酸（LCA）。迄今报道的胆汁酸生物合成研究多聚焦于在梭菌中异源表达部分bai基因，或在E. coli中表达单个Bai酶后进行体外酶促反应。这些方法虽有助于阐明酶功能，但规模化与转化潜力受限。本研究尝试在枯草芽孢杆菌胞内好氧条件下异源重建完整胆汁酸7α-脱羟基化途径，克服了长期依赖厌氧培养的瓶颈。
研究方法
Bai酶的表达
培养条件如前所述，诱导剂木糖在发酵第8小时加入培养基。BaiH与BaiCD的表达存在两个显著例外：诱导后，向培养基中补充1 mM黄素单核苷酸、200 μM FeCl₃和600 μM半胱氨酸。蛋白发酵24小时后，收集培养样品，随后在4°C下以12,000×g离心8分钟分离细胞。每克细胞沉淀重悬于10 mL缓冲液（含20 mM Tris pH 7.5、50 mM NaCl、10%甘油），确保细胞悬液均匀。随后加入预先配制的溶菌酶溶液至终浓度200 mg/L，混合物在37°C孵育1小时以充分破坏枯草芽孢杆菌细胞壁。溶液黏度增加可作为裂解成功的指标。此后，向细胞重悬液中加入10 mM巯基乙醇。随后使用超声破碎仪破碎细胞获得细胞裂解液。破碎后的混合物以12,000×g离心8分钟，小心收集上清液供进一步分析。
【数据】诱导剂：木糖（第8小时）；补充剂：1 mM FMN、200 μM FeCl₃、600 μM半胱氨酸；离心：12,000×g、4°C、8分钟；重悬缓冲液：20 mM Tris pH 7.5、50 mM NaCl、10%甘油；溶菌酶终浓度：200 mg/L；孵育：37°C、1小时；巯基乙醇：10 mM
SDS-PAGE与Western blotting分析
SDS-PAGE分析中，上清液与5×上样缓冲液混合并煮沸10分钟。随后，制备的样品与标记物在MES SDS电泳缓冲液中用12% Bolt Bis-Tris Plus凝胶分离。采用考马斯亮蓝R250染色显示不同分子量的蛋白质。Western blotting中，含重组蛋白的凝胶转印至0.2-μm聚偏二氟乙烯膜。膜用TBST（150 mM NaCl、20 mM Tris pH 8.0、0.1% Tween 20）洗涤三次，然后在含脱脂奶粉的TBST溶液中孵育2小时，随后与一抗（1:2000稀释）在4°C孵育过夜。三次洗涤后，膜与山羊抗兔二抗（1:5000稀释）孵育1小时。此后，膜用TBST洗涤三次，每次10分钟，确保彻底去除未结合物质。最后，使用增强化学发光（ECL）显色试剂盒显色，对靶蛋白进行灵敏检测。
【数据】凝胶：12% Bolt Bis-Tris Plus；转印膜：0.2-μm PVDF；TBST配方：150 mM NaCl、20 mM Tris pH 8.0、0.1% Tween 20；一抗稀释度：1:2000（4°C过夜）；二抗稀释度：1:5000（1小时）；洗涤：3次×10分钟
代谢物提取
反应样品经冻干后，用适量甲醇复溶，随后以10,000×g离心8分钟收集上清液。上清液经氮吹浓缩后用乙腈复溶。最终离心去除颗粒物后，上清液进行LC-MS分析。
【数据】离心：10,000×g、8分钟；复溶溶剂：甲醇→乙腈；浓缩方式：氮吹
代谢物分析与检测
代谢物提取物采用WATERS ACQUITY UPLC系统联用WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS进行分析，色谱柱为1.7 μm、2.1×150 mm BEH C18柱。流动相由乙腈和0.1%甲酸溶液组成，流速0.3 mL/min，15分钟梯度洗脱：0-5分钟，30%乙腈和70% 0.1%甲酸；5-10分钟，80%乙腈和20% 0.1%甲酸；10-15分钟，100%乙腈。所有数据均在负离子模式下采集。
【数据】色谱柱：BEH C18（1.7 μm，2.1×150 mm）；流速：0.3 mL/min；梯度：15分钟；采集模式：负离子
Bai酶体外活性评价
仅表达单一Bai酶的枯草芽孢杆菌发酵24小时后，收集菌体，裂解破碎，离心获得粗酶提取物。阴性对照使用携带相同载体但不含bai基因的枯草芽孢杆菌制备类似提取物。底物溶于pH 7.5缓冲液中，组成包括20 mM Tris、10 mM BME、10%甘油、50 mM NaCl、200 μM NAD或200 μM NADH（依据反应性质而定）、100 μM CoA、200 μM ATP和50 mM MgCl₂。含底物的缓冲液与粗酶提取物混合，在37°C孵育6小时。在2小时、4小时、6小时分别取样，实验重复三次。样品经前处理后用LC-MS分析。
【数据】缓冲液：20 mM Tris pH 7.5、10 mM BME、10%甘油、50 mM NaCl；辅因子：200 μM NAD/NADH、100 μM CoA、200 μM ATP、50 mM MgCl₂；孵育：37°C、6小时；取样时间点：2h、4h、6h；重复次数：3次
全细胞催化
发酵过程中，培养物在第6小时用脱水四环素诱导，第8小时用木糖诱导。第24小时，离心收集细胞，重悬于缓冲液（20 mM Tris pH 7.5、50 mM NaCl、10%甘油、10 mM BME）中，加入底物后引入全细胞催化体系。混合物在37°C、150 rpm摇床中孵育6小时。在2小时、4小时、6小时分别取样，进行三次独立实验重复，并设空白对照。样品制备完成后，用LC-MS分析终产物的生成情况。
【数据】诱导时间：脱水四环素（第6小时）、木糖（第8小时）；重悬缓冲液：20 mM Tris pH 7.5、50 mM NaCl、10%甘油、10 mM BME；催化条件：37°C、150 rpm、6小时；取样时间点：2h、4h、6h
研究结果
Bai酶在枯草芽孢杆菌中的表达
天然枯草芽孢杆菌产生八种非必需胞外蛋白酶，对异源分泌蛋白构成显著降解风险，可能导致目标产物大量损失。为克服这一挑战并转化枯草芽孢杆菌BS168菌株，研究实施了一系列连续操作以增强菌株高效稳定表达外源蛋白的能力，同时尽量减少蛋白水解降解。这些操作包括：制备诱导型超感受态细胞、通过回复突变失活trpC2和gudB、敲除六种非必需胞外蛋白酶（AprE、NprE、Epr、Mpr、Bpr和NprB）。所得菌株G600用于本研究以实现最佳蛋白产量和生长（图1A）。在胆汁酸生产方面，胞外蛋白酶预计不会直接干扰途径性能，因为胆汁酸7α-脱羟基化酶被有意设计为胞内表达，催化反应发生在细胞质中。枯草芽孢杆菌以高蛋白酶分泌著称，这通常会使异源蛋白生产复杂化。为尽量减少对蛋白产量的潜在间接影响，研究采用了蛋白酶缺陷型背景，敲除了八种非必需胞外蛋白酶。该策略常用于提高异源蛋白稳定性和表达一致性，即使对胞内表达的酶也是如此。蛋白酶敲除是作为预防性和宿主优化措施实施的，而非胞内途径功能的直接要求。
研究主要聚焦于bai操纵子编码的酶。从C. scindens VPI 12708中分离并克隆了7α-脱羟基化反应所必需的七个基因，包括baiB、baiA2、baiCD、baiE、baiF、baiH和baiG。每个基因分别插入稳定的pHT载体，采用P xylA启动子并携带C端His6标签。枯草芽孢杆菌在好氧条件下培养以单独表达每个Bai蛋白。Western blotting分析确认了BaiB、BaiA2、BaiCD、BaiE和BaiF在枯草芽孢杆菌中的特异性蛋白产物（图1B）。然而，未观察到BaiH对应的可检测条带。相比之下，在好氧条件下当BaiH在E. coli BL21(DE3)中表达时，检测到清晰条带，且通过体外酶催化实验鉴定了反应产物，表明在该宿主中表达成功。这种差异表达模式提示蛋白生产存在宿主特异性限制，并强调了细胞环境对异源基因表达的影响。枯草芽孢杆菌无法表达BaiH可能源于密码子使用、mRNA稳定性、蛋白折叠或翻译后加工与E. coli的差异。需要进一步研究阐明这种宿主依赖性表达的分子机制。此外，实验证据表明某些Bai酶（如BaiA2和BaiCD）的表达水平可能是影响整体催化效率和途径顺畅进展的关键因素。为解决靶蛋白稳定性的潜在限制，研究采用数据驱动方法预测并破坏额外的宿主蛋白酶（如eepC基因），但这些干预未显著改善酶性能。值得注意的是，表达模块的优化被证明是增强靶蛋白表达的有效途径。未来研究将聚焦于优化表达架构和增加基因拷贝数以提升这些关键酶的水平。重要的是，结果表明枯草芽孢杆菌能够功能性表达胆汁酸7α-脱羟基化途径中的大多数酶，凸显其作为重建这一复杂代谢过程宿主的巨大潜力。
【数据】菌株：BS168（野生型）→ 168KS（整合P xylA-comK）→ BSZR/BSZRG（trpC2和gudB回复突变）→ G600（敲除6种胞外蛋白酶）；基因来源：C. scindens VPI 12708；载体：pHT（P xylA启动子、C端His6标签）；成功表达：BaiB、BaiA2、BaiCD、BaiE、BaiF；未检测到：BaiH（E. coli BL21(DE3)中可表达）
Bai酶体外活性评价
首先在体外评价了BaiB酶的活性，该酶催化胆汁酸7α-脱羟基化途径的起始步骤。LC-MS分析持续检测到一种物质的时间依赖性生成，其精确质荷比与胆酰-CoA一致——即CA 7α-脱羟基化反应的初始产物（图2A）。还观察到反应体系中缺乏Mg²⁺导致酶活性显著降低。相反，对照反应中未观察到类似胆酰-CoA的化合物，表明野生型菌株缺乏催化该转化的酶。由于无法获得商业化的胆酰-CoA标准品，研究按照先前文献描述的方案尝试化学合成了胆酰-CoA。体外反应产物与化学合成标准品表现出一致的保留时间和相同的质荷比（图2A）。通过LC-MS检测与分析，获得了胆酰-CoA的主要质谱碎片。以CA为参照，推断其极性和保留时间，结果与现有文献报道一致。这些结果表明，在枯草芽孢杆菌中表达的BaiB具有功能活性，能够催化CA与辅酶A形成胆酰-CoA，从而验证其在胆汁酸7α-脱羟基化途径中的作用。
接下来验证了BaiA2的氧化与还原活性。先前研究表明BaiA2可催化CA转化为3-氧代胆酸（3-oxo-CA）。为更好地控制底物浓度，选择该特定反应来验证在G600菌株中异源表达的BaiA2的氧化活性。LC-MS检测到3-oxo-CA，证实了BaiA2在此步骤的催化活性（图2B）。为评价BaiA2的还原活性，以3-氧代脱氧胆酸（3-oxo-DCA）为底物，与BaiA2在反应体系中共孵育。LC-MS分析显示DCA的时间依赖性生成（图2C）。这些结果表明，在枯草芽孢杆菌中异源表达的BaiA2可催化该途径中的氧化和还原反应。空白对照中未检测到反应产物，证实野生型菌株缺乏能催化这些反应的内源酶。由于缺乏商业化的3-氧代胆酰-CoA和3-氧代-4,5-脱氢胆酰-CoA标准品，无法直接验证BaiCD的氧化活性。然而，可以评估该酶的还原活性。为此，基于先前方法化学合成了底物3-氧代-4,5-脱氢脱氧胆酸（3-oxo-4,5-dehydro-DCA），样品的NMR和质谱数据见补充信息。将3-oxo-4,5-dehydro-DCA作为底物引入含BaiCD的体外反应体系，并设空白对照。LC-MS检测到3-oxo-DCA，体外酶促反应产量为0.4 μg/g。对照组未检测到该产物（图2D）。尽管未检测到异源表达BaiH的对应Western blotting条带，但先前研究表明枯草芽孢杆菌拥有丰富的氧化还原酶库，其中部分酶可能执行与BaiH类似的功能。为验证该假设，研究使用先前方法化学合成了底物3-氧代-4,5-6,7-二脱氢脱氧胆酸（3-oxo-4,5-6,7-didehydro-DCA）……
【数据】BaiB产物：胆酰-CoA（与化学合成标准品保留时间和质荷比一致）；BaiA2氧化产物：3-oxo-CA；BaiA2还原产物：DCA（由3-oxo-DCA生成）；BaiCD还原产物：3-oxo-DCA（由3-oxo-4,5-dehydro-DCA生成）；体外酶促产量：0.4 μg/g；关键辅因子：Mg²⁺（缺乏时酶活性显著降低）
讨论与解读
本研究除baiG外，大多数异源途径基因采用质粒系统表达，以便快速验证酶活性和途径可行性。尽管使用了稳定且兼容的质粒，质粒表达在大规模发酵生产中可能面临长期稳定性和鲁棒性挑战。通过优化表达模块和开发生物传感器辅助的调控策略，研究旨在平衡基因表达水平、减少代谢负担并确保途径长期稳定性。为此，已在宿主基因组中鉴定出八个合适的基因组整合位点，进一步的菌株工程工作正在进行中。此外，动态调控策略（如代谢物或辅因子响应的生物传感器、阶段特异性或条件依赖性启动子）可能进一步实现对途径酶表达的时间和定量控制。本研究在好氧宿主中重建了胆汁酸7α-脱羟基化的多步氧化还原反应。偏离天然生产者的严格厌氧环境必然伴随氧化还原格局的扰动。因此，为胆汁酸生产工程化合适的胞内氧化还原环境是当前研究的重点。可行策略包括引入相容的电子传递伴侣（如铁氧还蛋白/黄素氧还蛋白系统）以增强辅因子再生。
编译者解读
本研究的关键价值在于将胆汁酸7α-脱羟基化这一严格厌氧的多酶氧化还原途径移植到食品级好氧宿主中，直接回应了该领域长期存在的规模化瓶颈。方法选择上，模块化表达策略使多种胆汁酸中间产物可按需积累，这是天然厌氧宿主难以实现的灵活性。值得注意的是，BaiH在枯草芽孢杆菌中无法表达而在E. coli中可表达的差异，提示异源多酶途径重建时"单一宿主万能"假设的局限。当前平台距离工业化仍有距离——胆汁酸毒性耐受、氧化还原环境适配、好氧发酵的氧需求控制等问题均需进一步菌株工程解决。但作为概念验证，该系统证明了"好氧平台生产厌氧途径代谢物"的可行性，对其它氧气敏感型肠道菌群代谢物的异源生产具有方法学借鉴意义。
参考来源
Zang Y. Engineering Bacillus subtilis as a sustainable platform for the production of functional bile acids. Trends in Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.03.021
DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.03.021