来源：Adaptive laboratory evolution of Lactobacillus helveticus enhances acid tolerance for food-grade, non-GMO applications（Food Research International）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）是发酵乳制品和益生菌制剂中的重要菌种，但酸性环境严重制约其生长与发酵性能。本研究通过适应性实验室进化（ALE），将菌株逐步暴露于从pH 5.0降至4.0的酸性胁迫中，获得两株耐酸进化菌株LH_1E_113–5和LH_2E_117–4。全基因组重测序与代谢组学分析揭示了糖酵解、TCA循环、氨基酸代谢等多层面的协同重编程机制。ALE作为一种非转基因策略，为食品级乳酸菌的工业应用提供了合规且高效的菌株改良路径。
研究背景
乳酸是乳酸菌在碳水化合物发酵过程中合成的关键有机酸，在食品、制药和生物聚合物产业中应用广泛——既是发酵食品的风味增强剂和酸味剂，也是聚乳酸（PLA）生物可降解塑料的核心前体。然而，发酵过程中乳酸的过量积累会造成酸胁迫，降低微生物存活率与整体发酵性能。瑞士乳杆菌因高产乳酸和益生潜力而备受关注，但酸性条件下的生长受限仍是其工业应用的瓶颈。如何在非转基因前提下提升其耐酸性，是食品生物技术领域亟待解决的问题。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
亲本菌株 Lactobacillus helveticus CBT_LH5（KCTC 12936BP）及其进化衍生菌株均在MRS培养基（BD Difco, Detroit, MI, USA）中、37°C、200 rpm振荡条件下培养。每升蒸馏水配制的MRS培养基含：10 g蛋白胨、10 g牛肉浸粉、5 g酵母提取物、20 g葡萄糖、1 g吐温80、5 g乙酸钠、2 g柠檬酸铵、2 g磷酸氢二钾（K₂HPO₄）、0.1 g七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）、0.05 g一水硫酸锰（MnSO₄·H₂O）。酸性条件生长比较实验使用酸化MRS（MRSL）培养基，用D,L-乳酸（Acros Organics, Waltham, MA, USA）调至指定pH。所有菌株于−80°C保存于添加50%（v/v）甘油的脱脂乳中。
【数据】培养基：MRS/MRSL；温度：37°C；转速：200 rpm；葡萄糖：20 g/L；保存条件：−80°C、50%甘油脱脂乳
2.2 LH5菌株的适应性实验室进化（ALE）
为确定ALE的起始酸性条件，亲本菌株LH5在一系列pH条件下培养。细胞先在MRS培养基（pH 6.5）中、37°C预培养16 h，离心收集后用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤并重悬。将菌悬液接种至200 μL用90%（v/v）D,L-乳酸（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）调至pH 2.5–6.5（梯度0.5）的MRS培养基中，初始OD600设为0.1。培养物在96孔微量板中、37°C、200 rpm振荡培养，使用酶标仪（BioTek或Synergy HTX, Agilent Technologies, Winooski, VT, USA）自动混匀后测定OD600。基于不同pH条件下的初步生长筛选（图S1），选择pH 5.0作为ALE的起始条件。将LH5的冷冻保存液接种至50 mL管中的10 mL MRS培养基，37°C、200 rpm振荡培养。细胞经离心收集（4000 rpm，4°C，10 min），用蒸馏水洗涤两次，接种至10 mL MRSL培养基中，初始OD600调至0.1。培养物每24 h依次转移至新鲜MRSL培养基，在无CO₂补充、无气体组成控制的摇瓶中、37°C、200 rpm振荡培养。每次转移所用新鲜MRSL培养基的初始pH从5.0逐步降至4.0——当OD600在当前pH水平下升高并达到平台期后即降低pH，从而逐步增加酸选择压力。ALE完成后，在MRS琼脂平板上分离进化菌株的单菌落并评估耐酸性。将进化菌株在酸胁迫下的生长和存活率与亲本菌株进行比较。各进化培养物的等分试样于−80°C保存于添加50%（v/v）甘油的脱脂乳中备用。
【数据】预培养：pH 6.5、37°C、16 h；pH筛选范围：2.5–6.5（梯度0.5）；初始OD600：0.1；ALE起始pH：5.0；转移间隔：24 h；pH降低终点：4.0；离心：4000 rpm、4°C、10 min
2.3 耐酸筛选
亲本菌株LH5与进化菌株的耐酸性通过活菌计数评估。分离菌株先在MRS培养基中、37°C、200 rpm振荡过夜培养。细胞经离心收集（4000 rpm，4°C，10 min），PBS洗涤。用90%（v/v）D,L-乳酸将MRS培养基pH调至4.0。细胞以初始OD600为0.3重悬于MRSL培养基，37°C、200 rpm振荡培养。在0、24、48和72 h采集样品，PBS梯度稀释后涂布于MRS琼脂平板。37°C培养48 h后，计数菌落形成单位（CFU），以log CFU/mL表示酸胁迫下的细胞存活率。
【数据】筛选pH：4.0；初始OD600：0.3；采样时间点：0、24、48、72 h；琼脂平板培养：37°C、48 h；计数单位：log CFU/mL
2.4 摇瓶发酵性能比较
为评估发酵性能，亲本与进化菌株在酸性和非酸性条件下进行分批培养。细胞在MRS培养基中培养并经PBS洗涤后，接种至含有100 mL新鲜MRS（初始pH 6.5）或MRSL（初始pH 4.0）培养基的250 mL锥形瓶中，初始OD600调至0.3。培养物在37°C、200 rpm振荡培养。酸性培养中，每24 h定期添加5 M NaOH将pH维持在4.0–4.3之间。比较进化菌株与亲本菌株的细胞生长（OD600）、葡萄糖消耗和乳酸产量。发酵期间，使用配备Aminex HPX-87H色谱柱（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）的高效液相色谱系统（HPLC; Waters, Milford, MA, USA）定量培养上清液中的葡萄糖和乳酸浓度。色谱柱维持在65°C，流动相为5 mM H₂SO₄，流速0.5 mL/min。检测使用设定为55°C的示差折光检测器（RID），定量基于标准品制备的标准曲线。所有实验设三次重复。
【数据】培养体积：100 mL/250 mL锥形瓶；初始pH：6.5（MRS）/4.0（MRSL）；初始OD600：0.3；pH维持范围：4.0–4.3（5 M NaOH，每24 h）；HPLC柱温：65°C；流动相：5 mM H₂SO₄，0.5 mL/min；RID温度：55°C
2.5 进化菌株全基因组重测序
进化菌株的基因组分析使用Illumina MiSeq平台完成。基因组DNA文库使用TruSeq Nano DNA Prep试剂盒（Illumina, San Diego, CA, USA）制备，测序使用MiSeq 600-cycle试剂盒生成2 × 300 bp双端读段。原始读段质量使用FastQC v0.11.8评估。使用Unicycler v0.5.0进行从头基因组组装，使用Prokka v1.14.6（https://github.com/tseemann/prokka）进行基因组注释。
【数据】测序平台：Illumina MiSeq；读段类型：2 × 300 bp双端；组装工具：Unicycler v0.5.0；注释工具：Prokka v1.14.6
2.6 基于GC/TOF-MS的非靶向代谢物分析
非靶向代谢物谱分析使用气相色谱-飞行时间质谱（GC/TOF-MS）。将含内标（2-氯-L-苯丙氨酸，0.01 mg/mL）的500 μL甲醇加入细胞沉淀中，用Retsch MM 400混合球磨仪（Retsch, Haan, Germany）匀浆并超声处理10 min。匀浆液于14,000 rpm、4°C离心10 min，经0.2-μm PTFE针头过滤器（Daegu, South Korea）过滤，在真空浓缩仪中干燥（24 h）。干燥提取物用甲醇复溶至4000 ppm。衍生化时，向干燥提取物中加入50 μL甲氧胺盐酸盐（20 mg/mL吡啶溶液），30°C孵育90 min，随后加入50 μL MSTFA，37°C孵育30 min。过滤后，样品在配备Pegasus HT TOF-MS（Leco, St. Joseph, MI, USA）的Agilent 7890A GC（Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）上分析，使用Rtx-5MS色谱柱（30 m × 0.25 mm内径；J&W Scientific, Santa Clara, CA, USA）。氦气为载气，恒定流速1.5 mL/min。
【数据】内标：2-氯-L-苯丙氨酸（0.01 mg/mL）；甲醇体积：500 μL；超声：10 min；离心：14,000 rpm、4°C、10 min；干燥：24 h；复溶浓度：4000 ppm；衍生化：甲氧胺盐酸盐30°C 90 min + MSTFA 37°C 30 min；载气流速：1.5 mL/min
2.7 胞内代谢物数据处理与统计分析
GC/TOF-MS数据使用LECO ChromaTOF软件（LECO）转换为NetCDF（*.cdf）格式。数据使用MetAlign进行峰检测、保留时间校正和比对。多变量统计分析在SIMCA-P+（Umetrics, Umeå, Sweden）中进行。显著性代谢物基于PLS-DA得分图的变量投影重要性（VIP）值>0.7和单因素方差分析（STATISTICA 7, version 7.0, StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA）的p值<0.05筛选。代谢物鉴定通过将保留时间、碎裂谱和元素组成与标准品、文献及NIST（v2.0）、Wiley8和HMDB等公共数据库比对进行初步归属。层次聚类分析（HCA）和热图生成使用RStudio（version 2023.12.1; Posit Software, PBC, Boston, MA, USA）运行R version 4.3.4（R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria）完成。
【数据】VIP阈值：>0.7；p值阈值：<0.05；数据库：NIST v2.0、Wiley8、HMDB；软件：SIMCA-P+、STATISTICA 7、R 4.3.4
研究结果
3.1 LH5的ALE及进化菌株的分离
为获得瑞士乳杆菌耐酸突变株，以亲本菌株LH5进行了ALE。ALE之前，在不同pH条件下评估了LH5的耐酸性。该菌株在pH 4.0及以下未检测到生长，表明其对酸性环境高度敏感，且在pH 5.0下的生长显著慢于pH 6.5（图S1）。基于这些结果，选择pH 5.0作为ALE的起始条件。ALE在MRSL培养基中进行了120次连续传代，期间pH从5.0逐步降至4.0以施加持续酸胁迫。建立了两个独立进化谱系，命名为1E和2E（图1）。
为评估进化菌株，将其生长曲线与亲本菌株进行比较。谱系1E的第113、114和117次转移及谱系2E的第103、113和117次转移在pH 4.1培养时显示出最高的OD600值（图1a–b）。其中，谱系1E的第113次转移（即113–1、113–4和113–5）和谱系2E的第117次转移（即117–3、117–4和117–6）在低pH下持续表现出最强且最稳定的生长。这些分离株因此被选作进一步分离和表征的对象。分离株LH_1E_113–5和LH_2E_117–4在pH 6.5的MRS培养基中表现出优于亲本菌株的生长（图2a–b）。通过在调至pH 4.1的MRSL培养基中培养进一步评估耐酸性。在这些酸性条件下，两个进化菌株的生长均显著优于亲本菌株（图2c–d）。在MRS琼脂平板上的单菌落分离过程中，亲本与进化菌株之间未观察到菌落形态的明显差异，表明菌株筛选基于耐酸性生长和存活能力而非可见菌落形态。在24、48和72 h通过平板涂布对活菌进行计数。进化菌株 consistently 表现出显著更高的活菌数，而亲本菌株在相同条件下存活率降低（图2e–f）。
这些结果证实LH_1E_113–5和LH_2E_117–4通过ALE获得了增强的耐酸性，表现为低pH胁迫下生长和存活能力的提升。
【数据】ALE传代次数：120次；pH范围：5.0→4.0；筛选pH：4.1；进化谱系：1E、2E；活菌计数时间点：24、48、72 h
3.2 亲本与进化菌株分批发酵性能的比较分析
为研究发酵性能差异，在pH 6.5的MRS培养基标准条件下对亲本菌株和进化菌株进行了分批培养（图3）。比较了细胞生长（OD600）、葡萄糖消耗和乳酸产量等发酵参数。进化菌株的最大OD600值高于亲本菌株，表明发酵期间细胞生长改善（图3a）。指数期的比生长速率测定结果为：亲本菌株0.1779 ± 0.0035 h⁻¹，LH_1E_113–5为0.1612 ± 0.0082 h⁻¹，LH_2E_117–4为0.1641 ± 0.0083 h⁻¹，各菌株间无显著差异。这些结果表明进化菌株的比生长速率并未高于亲本菌株，其改善的表型体现在延长培养期间的更大生长幅度上。此外，与亲本菌株相比，进化菌株消耗了更多葡萄糖（图3b）并产生了更多乳酸（图3c）。
这些结果表明，随着发酵过程中pH下降，进化菌株表现出更强的耐酸胁迫能力。尤其在发酵终点（104 h），差异显著：LH_1E_113–5和LH_2E_117–4达到更高的OD600值（分别为6.06和6.41，亲本菌株为3.44），残留葡萄糖水平更低（12.32 g/L和13.26 g/L对20.35 g/L），乳酸产量更高（38.38 g/L和40.77 g/L对27.66 g/L）。单菌落分离后在初始pH 6.5的MRS培养基中培养仍观察到发酵性能改善，表明进化表型在ALE选择过程之外得以保留。这些结果进一步表明，进化菌株在发酵过程中pH下降时表现出增强的耐酸胁迫能力。这些发现提示ALE提升了进化菌株在培养环境逐渐酸化时维持生长和发酵的能力。
【数据】比生长速率：亲本0.1779 ± 0.0035 h⁻¹、LH_1E_113–5为0.1612 ± 0.0082 h⁻¹、LH_2E_117–4为0.1641 ± 0.0083 h⁻¹；发酵终点（104 h）OD600：6.06/6.41/3.44；残留葡萄糖：12.32/13.26/20.35 g/L；乳酸产量：38.38/40.77/27.66 g/L
3.3 亲本与进化菌株胞内代谢物谱比较
为比较亲本菌株LH5与进化菌株LH_1E_113–5和LH_2E_117–4的胞内代谢物谱，使用GC/TOF-MS进行了非靶向代谢组学分析。培养物在初始pH 6.5的MRS培养基中、37°C振荡培养。24 h后用5 M NaOH将pH调至4.0–4.3以模拟适应性进化条件，在对数中期12 h时提取胞内代谢物。共鉴定出55种代谢物，归为氨基酸、有机酸、糖类、脂肪酸、胺类及其他类别（表S2）。主成分分析（PCA）显示亲本与进化菌株沿PC1明显分离（图3d）。模型拟合度良好（R² = 0.602），预测度高（Q² = 0.897）。在PC1载荷绝对值最高的代谢物中，丝氨酸、丙氨酸、琥珀酸和甘油在进化菌株中升高，而乳酸和富马酸降低（图3e）。HCA进一步证实了这些差异（图4）。
进化菌株LH_1E_113–5的丙二醇、乳酸及亮氨酸、脯氨酸等氨基酸水平升高，提示糖酵解、丙酮酸代谢和氨基酸生物合成途径被激活。鉴于氨基酸在耐酸性和胞内pH调节中的关键作用（Guan & Liu, 2020; Senouci-Rezkallah et al., 2011），其丰度增加可能有助于该菌株生存能力的增强。相比之下，LH_2E_117–4的硼酸、富马酸和丙氨酰胺水平升高（图5），与TCA循环活性增强、脂质代谢和核苷酸生物合成途径的激活一致。总之，这些发现表明进化菌株通过重编程代谢以适应酸胁迫，增加能量产生、氨基酸生物合成和膜稳定性。值得注意的是，两个进化菌株中亮氨酸、缬氨酸和脯氨酸丰度的升高可能有助于耐酸性改善，从而支持酸性条件下生长和发酵效率的提升（Goswami et al., 2022; Jung & Lee, 2020; Valle et al., 2008）。
【数据】鉴定代谢物总数：55种；PCA：R² = 0.602、Q² = 0.897；代谢物提取时间点：对数中期12 h；pH调节：5 M NaOH调至4.0–4.3
3.4 进化菌株全基因组重测序
对LH_1E_113–5和LH_2E_117–4进行全基因组重测序以阐明其耐酸性增强的遗传基础。测序获得LH_1E_113–5的2,048,322,434 bp（13,630,972条读段）和LH_2E_117–4的2,069,256,272 bp（13,776,840条读段）数据，GC含量分别为36.73%和37.41%（表S1）。测序质量高，Q20值高于97%、Q30值高于91%，确保遗传变异的可靠检测。与亲本基因组比较分析，在LH_1E_113–5中鉴定出40个突变，在LH_2E_117–4中鉴定出48个突变（表1和表2）。这些突变与基因组稳定性、代谢物外排、中心碳代谢、丙酮酸代谢、氧化应激防御和蛋白质合成相关，提示对酸胁迫的协同适应。
在两个进化菌株LH_1E_113–5和LH_2E_117–4中均鉴定到与基因组稳定性和代谢物外排相关的突变。具体而言，在ATP依赖性解旋酶/核酸酶相关基因中检测到突变……
【数据】测序数据量：LH_1E_113–5为2,048,322,434 bp（13,630,972 reads）；LH_2E_117–4为2,069,256,272 bp（13,776,840 reads）；GC含量：36.73%/37.41%；Q20>97%、Q30>91%；突变数：40个（LH_1E_113–5）/48个（LH_2E_117–4）
讨论与解读
本研究证实，通过ALE可增强瑞士乳杆菌的耐酸性，并借助整合多组学方法阐明了其潜在机制。进化菌株LH_1E_113–5和LH_2E_117–4在低pH条件下表现出显著改善的生长、存活率和乳酸产量，凸显了其在工业发酵和食品生物技术应用中的潜力。全基因组重测序在与糖酵解（pfkA和ldh_2）、丙酮酸代谢（pox5和eno）、氧化应激反应（rclA_1）、氨基酸代谢（metG）和膜转运（bmr3_2）相关的基因中鉴定出关键突变。代谢组学分析揭示了协同变化，包括TCA循环和磷酸戊糖途径的激活、氨基酸和脂质代谢的重编程以及发酵谱的改变。综合来看，这些发现表明瑞士乳杆菌耐酸性的增强源于多层次遗传和代谢适应，强化了能量产生、氧化还原平衡、膜重塑和渗透保护能力。
编译者解读：本研究最值得称道之处在于将ALE与多组学联用，构建了从"表型筛选—遗传变异定位—代谢通路重构"的完整因果链条。选择非转基因策略精准回应了食品级菌株改良的法规约束，工业转化路径清晰。不过，研究识别的40–48个突变散布于多个代谢通路，哪些是驱动耐酸性的核心突变、哪些为伴随突变，仍需反向遗传学验证。此外，ALE在摇瓶条件下进行，发酵罐中的氧传质和pH动态与摇瓶差异显著，进化表型能否在工业规模稳定表达，尚待中试验证。后续若能将组学预测的关键位点（如ldh_2、rclA_1）与CRISPR介导的碱基编辑结合，有望实现精准化育种与进化工程的深度融合。
参考来源
Lee, S.-H. (2026). Adaptive laboratory evolution of Lactobacillus helveticus enhances acid tolerance for food-grade, non-GMO applications. Food Research International, 2026. DOI: 10.1016/j.foodres.2026.119730
DOI: 10.1016/j.foodres.2026.119730