来源：Designing indigenous Bacillus-based consortia derived from citrus fruit to confer resistance against the green mold pathogen（Postharvest Biology and Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
绿霉病由指状青霉（Penicillium digitatum）引起，是柑橘采后最具破坏性的病害之一。本研究从经枯草芽孢杆菌L1–21处理的柑橘果实中分离培养可培养微生物，筛选出6株具有体外拮抗活性的细菌，并构建了三种基于芽孢杆菌的合成菌群（SynCom）。其中SynCom-3在果实体内表现出95.70%的相对防治效果，同时系统解析了防御酶活性、果实有机酸及微生物组变化，为开发基于本地微生物的绿色防控策略提供了新思路。
研究背景
柑橘是全球水果产业的基石，年产量达1.58亿吨，在国际鲜果供应链中占据关键地位。然而，采后储运过程中的腐烂问题持续造成重大经济损失。采后病害可占园艺产品损失的50%，其中青霉属真菌——尤其是指状青霉（绿霉病）和意大利青霉（蓝霉病）——是全球柑橘货架期最具破坏性的威胁。绿霉病尤为棘手，在许多生产和储存系统中可占采后损失的90%。该病原通常通过采收及采后操作产生的伤口侵染，其短侵染周期促进分生孢子产生，利于在储存条件下快速传播。
历史上柑橘绿霉病的防控依赖合成杀菌剂，如抑霉唑、咯菌腈、嘧霉胺和噻菌灵。然而，长期化学防治引发了对耐药性、法规限制、残留持久性和环境污染的担忧。因此，开发有效且可持续的生物防治方法成为当务之急，基于芽孢杆菌的解决方案尤其受到关注。
研究方法
2.1 细菌菌株与果实采集
枯草芽孢杆菌L1–21最初分离自健康柑橘叶片，保存于中国云南农业大学分子植物病理学实验室。该菌株在Luria-Bertani（LB）肉汤中于30°C、160 rpm振荡培养16 h复苏，随后于4°C保存备用。2024年6月，从中国云南省昆明市盘龙区当地市场采集新鲜、成熟、无瑕疵、大小均匀的沙糖橘品种（Citrus reticulata cv. Shatangju）果实，要求无可见病害症状。果实逐个用柑橘专用聚氨酯（PU）膜包裹，并在无菌条件下立即运回实验室。
【数据】菌株：B. subtilis L1–21；培养基：LB肉汤；温度：30°C；转速：160 rpm；时间：16 h；保存温度：4°C；采样地：中国云南省昆明市盘龙区；品种：沙糖橘；采样时间：2024年6月
2.2 柑橘果皮内生菌与附生菌的分离与鉴定
果实到达后进行处理，从果皮和内部组织收集附生和内生微生物。为分离附生微生物，先用自来水冲洗3 min去除松散附着碎屑，随后依次用2.5%（v/v）次氯酸钠消毒2 min和75%乙醇（v/v）消毒1 min，用无菌蒸馏水冲洗三次，在层流罩中室温风干。果实随机分为两组，每组9个果实。对照组果实以PU膜包裹，于25°C储存3 d。枯草芽孢杆菌L1–21从4°C保存的菌种中培养，通过离心（10,000 g，15 min）收集菌体用于果实处理。随后将收集的菌体重新悬浮于无菌蒸馏水中（1% v/v），调整浓度至OD600为1.0，制备细菌悬浮液。果实浸入悬浮液中20 min，风干后用PU膜包裹，于25°C储存3 d。
基于培养法的附生微生物回收：表面洗液（见下述步骤）经梯度稀释后涂布于营养琼脂（NA；33 g L⁻¹）培养细菌、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA；200 g L⁻¹）培养真菌，于25°C培养。培养24和48 h后根据形态和色素挑选菌落，采用划线法在NA培养基上传代获得纯培养。真菌分离物通过菌丝尖端转移法纯化：切取活跃生长边缘并转接至新鲜PDA。纯化的细菌分离物保存于20%（v/v）甘油的−80°C条件下，真菌分离物保存于PDA斜面。此阶段未进行分类学鉴定，每个分离物赋予唯一编号。
内生微生物回收：在层流罩中无菌切取处理组和对照组果实的果皮组织，分为两部分。一部分保存于含20%（v/v）无菌甘油的−80°C条件下长期储存。第二部分立即处理进行培养——无菌研磨组织释放内生微生物，按上述方法进行涂布和分离。
【数据】表面消毒：2.5%次氯酸钠2 min + 75%乙醇1 min；冲洗：无菌蒸馏水3次；处理浓度：OD600 = 1.0；浸果时间：20 min；储存条件：25°C、3 d；培养基：NA（33 g L⁻¹）、PDA（200 g L⁻¹）；培养温度：25°C；细菌保藏：20%甘油、−80°C
2.3 内生菌L1–21处理后微生物群定量及分子分析样品制备
为评估内生菌L1–21处理后微生物群的变化，无菌切取对照组和处理组果实的果皮组织，转移至含0.02%（v/v）Tween−80的1 L无菌盐水中。通过数字加热超声波浴超声处理5 min（200 W，50 Hz）使附着于果皮表面的微生物脱落。所得悬浮液过滤后于5000 g离心10 min沉淀微生物。沉淀分为两份：一份保存于−80°C的20%甘油中用于长期储存和后续培养分离，第二份用于PCR微生物鉴定。细菌群落使用引物F338/F806扩增16S rRNA基因，真菌群落使用ITS引物扩增。选取20条细菌和6条真菌与已知分类群相似度最高的代表性序列进行系统发育分析。在MEGA X中使用Neighbor-Joining方法构建系统发育树，bootstrap分析（1000次重复）评估分支模式的可靠性。
【数据】超声参数：200 W、50 Hz、5 min；离心：5000 g、10 min；Tween−80浓度：0.02%（v/v）；引物：F338/F806（16S rRNA）、ITS引物；建树方法：MEGA X Neighbor-Joining；bootstrap：1000次重复
2.4 对绿霉病病原的拮抗试验
从中国云南省昆明市当地市场采集呈现典型绿霉病症状的柑橘果实，使用无菌手套采集，逐个用柑橘PU膜包裹并立即运回实验室。从感病组织中分离致病菌（指状青霉）并在PDA培养基上维持培养。分生孢子悬浮液通过向产孢培养物中加入无菌0.85%盐水并轻轻刮取分生孢子制备。用血球计数板调整悬浮液至1 × 10⁴孢子 mL⁻¹。
细菌分离物（内生和附生）及L1–21于LB肉汤（10 g L⁻¹蛋白胨、5 g L⁻¹酵母提取物、10 g L⁻¹ NaCl）中30°C、160 rpm振荡预培养16 h。培养物于10,000 g离心15 min，上清液经0.22 µm滤膜过滤除菌获得无细胞上清液。需要细菌接种物的试验中，悬浮液调整至1 × 10⁶ CFU mL⁻¹，细胞密度通过OD600分光光度法测定。
对指状青霉的拮抗活性采用PDA平板上的交叉培养（双培养）法评估。简要步骤：将100 µL分生孢子悬浮液（1 × 10⁴孢子 mL⁻¹）均匀涂布于PDA平板上。24 h后，在距平板中心2.5 cm的四个对称点接种1 × 10⁶ CFU mL⁻¹的细菌菌饼，每个平板三次重复。平板于25 ± 1°C培养7 d。拮抗作用表现为与不含细菌的对照病原相比出现明显抑菌圈和/或病原径向生长减少。菌丝生长抑制百分比在7 d时通过径向生长测量确定，计算公式为：
抑制率（%）=（D1 − D2）/ D1 × 100
其中D1 = 对照平板中指状青霉菌落直径（mm），D2 = 处理平板中指状青霉菌落直径（mm）。
【数据】孢子悬浮液浓度：1 × 10⁴孢子 mL⁻¹；细菌悬浮液浓度：1 × 10⁶ CFU mL⁻¹；LB培养基组成：10 g L⁻¹蛋白胨、5 g L⁻¹酵母提取物、10 g L⁻¹ NaCl；预培养条件：30°C、160 rpm、16 h；离心：10,000 g、15 min；滤膜孔径：0.22 µm；培养条件：25 ± 1°C、7 d；接种位点：距中心2.5 cm四个对称点
2.5 内生菌L1–21与分离细菌间协同/拮抗作用评估
内生菌L1–21与回收细菌分离物之间潜在的拮抗相互作用在NA培养基上评估。制备NA平板并以L1–21菌株划线——在平板上划一条直线。使用灭菌打孔器在等距位置打四个对称孔（直径5 mm），每孔距平板中心2.5 cm，向每孔中加入5 µL各待测分离物的悬浮液。为评估相互抑制，反向进行同样试验：每个待测分离物在NA平板上以圆形线条划线，按上述方法制备四个5 mm孔（距中心2.5 cm），每孔加入5 µL L1–21悬浮液。每个配对三次重复，平板于37°C培养24 h。拮抗相互作用通过划线旁或孔周围出现明显抑菌圈和/或细菌生长减少（与对照生长相比）来确定。
【数据】培养基：NA；孔直径：5 mm；孔位置：距中心2.5 cm；加样量：5 µL；培养条件：37°C、24 h；重复：3次
2.6 拮抗菌与内生菌L1–21组合（SynCom策略）抑制效果测定与比较
为测定对绿霉病病原（指状青霉）的真菌菌丝生长抑制百分比，枯草芽孢杆菌L1–21和表1所列分离菌株在LB培养基中于160 rpm、37°C旋转摇床上培养2 d。简要步骤：将100 µL病原体悬浮液均匀涂布于PDA平板上。24 h后，在距平板中心2.5 cm的四个对称点接种各菌株悬浮液（1 × 10⁶ CFU mL⁻¹），每个处理三次重复。平板于25 ± 1°C培养7 d。抑制率按前述公式计算。基于配对组合试验结果，选择表现最佳的菌株组合构建三种合成菌群（SynCom-1、SynCom-2和SynCom-3），用于后续果实体内试验。
【数据】预培养条件：LB培养基、160 rpm、37°C、2 d；孢子浓度：1 × 10⁴孢子 mL⁻¹（100 µL涂布）；细菌浓度：1 × 10⁶ CFU mL⁻¹；培养条件：25 ± 1°C、7 d；构建的合成菌群：SynCom-1、SynCom-2、SynCom-3
研究结果
3.1 枯草芽孢杆菌L1–21内生菌处理后柑橘可培养细菌和真菌群落及其拮抗活性
在柑橘果实上施用枯草芽孢杆菌L1–21后，从柑橘附生和内生群落中回收了21株可培养细菌和7株可培养真菌分离物（图1）。真菌方面，分离物1被鉴定为指状青霉，其余真菌分离物归属于子囊菌门（图1-A和B）。21株细菌分离物中，7株（菌株1、3、12、13、14、15和21）回收自附生区室，其余14株（菌株2、4–11和16–20）归类为内生菌（图1-C和D）。
所选分离物与枯草芽孢杆菌L1–21表现出强烈的协同相互作用。共接种实验显示，受试菌株间未检测到相互拮抗，表明其具有病害防治潜力（图1E）。基于抑制强度，从初筛中表现最优的附生和内生分离物被进一步用于共培养试验中的拮抗活性评估——分别单独测试以及与内生菌L1–21组合测试。
【数据】分离物总数：21株细菌 + 7株真菌；附生细菌：7株；内生细菌：14株；真菌归属：1株指状青霉 + 6株子囊菌门；拮抗相互作用：未检出
3.2 枯草芽孢杆菌L1–21与本地芽孢杆菌单独及合成菌群形式对指状青霉的抗真菌活性
从初筛文库中，附生菌株14和内生菌株2、10、16、19和20因其对指状青霉的强拮抗活性被选出。后续试验验证了这些发现——枯草芽孢杆菌L1–21及相关分离物导致指状青霉显著（p < 0.01至p < 0.0001）受抑，证实所选菌群具有强大的体外拮抗作用（图2）。
各分离物中，菌株16表现出最高抑制率60.28 ± 1.56%，其次为菌株2（54.47 ± 1.83%）、10（53.05 ± 2.62%）、14（54.53 ± 1.37%）、20（54.3 ± 1.54%）和L1–21（51.5 ± 1.01%），均与CK对照比较；菌株19的抑制率最低，为44.3 ± 0.86%（图2A和B）。
重要的是，PDA上的成对SynCom评估揭示了拮抗菌株间的协同和加性相互作用（图2C和D）。组合L1–21 + 2（53.67%）、L1–21 + 14（63.76%）、L1–21 + 16（66.9%）和10 + 16（60.07%）对指状青霉产生最高的生长抑制，被确定为菌株L1–21与所选本地分离物之间的协同配对。相反，含分离物L1–21 + 19（18.38 ± 3.8%）、2 + 19（9.5 ± 1.45%）、10 + 19（21.41 ± 1.4%）、14 + 19（9.17 ± 0.6%）、16 + 19（5.56 ± 1.45%）和19 + 20（30.16 ± 1.7%）的菌群表现出极低的抑制活性，表明这些配对缺乏协同效益（图2C和D）。值得注意的是，抑制有限的菌群组合未被纳入后续实验。这些实验支持潜在菌株的菌群组合能对病原体产生显著抑制，因此根据建立生物防治效果的能力选择表现最佳的菌株。
【数据】菌株16抑制率：60.28 ± 1.56%；菌株2：54.47 ± 1.83%；菌株10：53.05 ± 2.62%；菌株14：54.53 ± 1.37%；菌株20：54.3 ± 1.54%；L1–21：51.5 ± 1.01%；菌株19：44.3 ± 0.86%；最佳配对抑制率：L1–21 + 2 = 53.67%，L1–21 + 14 = 63.76%，L1–21 + 16 = 66.9%，10 + 16 = 60.07%；最差配对：16 + 19 = 5.56 ± 1.45%；显著性：p < 0.01至p < 0.0001
3.3 枯草芽孢杆菌对指状青霉引起的病害严重度和发病率的生物防治效果
接种枯草芽孢杆菌L1–21及其衍生的SynCom显著降低了绿霉病病害（与P-CK相比，p < 0.05；图3A-C）。为展示基于拮抗作用的多菌群组合的效果，根据上述实验组装了SynCom−1、SynCom−2和SynCom−3（表1）进行进一步分析。
单独用枯草芽孢杆菌L1–21处理的果实，以及SynCom处理组（SynCom−1 + P、SynCom−2 + P和SynCom−3 + P）均显著降低了病害严重度，对照P-CK为93.06%（图3A）。值得注意的是，SynCom−3 + P表现出最强的生物防治效果，将病害严重度限制在10%以下，相对防治效果达95.70%，显著高于所有其他处理（p < 0.05；图3B）。L1–21 + P单独处理的防效（58.89%）与SynCom−1 + P（61.96%）和SynCom−2 + P（66.25%）在统计学上相当，而SynCom−3的优异表现突出了优化微生物菌群的协同增效作用（图3B和C）。正如预期，SynCom−3在果实体内与其他受试SynCom相比表现出可能的互补性。
【数据】P-CK病害严重度：93.06%；SynCom−3 + P病害严重度：<10%；SynCom−3相对防效：95.70%；L1–21 + P防效：58.89%；SynCom−1 + P防效：61.96%；SynCom−2 + P防效：66.25%；显著性：p < 0.05
3.4 基于枯草芽孢杆菌的处理对感染指状青霉的柑橘防御相关酶活性的影响
#### 3.4.1 柑橘果实防御酶
通过测定柑橘果实中五种防御相关酶的活性，进一步检验了与病害抑制相关的寄主防御激活。防御相关酶（PAL、脂肪酶、几丁质酶、过氧化物酶和中性蛋白酶）的比较分析揭示了内生菌引发和病原体攻击果实之间在不同处理下的明显激活模式（p < 0.0001；图4），表明细菌接种物以酶特异性方式调节寄主防御反应。
PAL活性在不同处理间表现出明显差异（图4A）。P-CK表现出最强的PAL活性（11.25 U g⁻¹），高于N-CK（8.57 U g⁻¹），表明病原体感染本身足以诱导PAL。相比之下，仅内生菌处理（包括L1–21和SynCom 1、2和3）的PAL活性相对较低。内生菌处理后果实受到病原体攻击时，PAL活性再次升高——L1–21 + P达到10.49 U g⁻¹，SynCom−1 + P和SynCom−3 + P维持高PAL活性（分别约为10.14和10.33 U g⁻¹），而SynCom−2 + P呈中间水平（9.12 U g⁻¹）。这些结果表明，尽管内生菌单独不组成性激活PAL，但SynCom−1、SynCom−2和SynCom−3的接种各自在不同程度上抑制了病原体诱导的PAL反应。这种抑制可能反映了防御信号减弱与耐受性增强之间的权衡，其对抗病性的影响有待进一步研究。
总体而言，内生菌预施用对脂肪酶活性产生了处理特异性效应——SynCom−1单独处理诱导最高活性（106 nmol/min/g），而L1–21单独处理将脂肪酶活性降至63.1 U g⁻¹，L1–21 + P处理部分恢复至78.9 U g⁻¹，但差异不显著（图4B）。相比之下，P-CK的脂肪酶活性（74.8 U g⁻¹）略低于N-CK（83.0 U g⁻¹）。类似地，SynCom−2单独处理的活性显著较低（后续病原体攻击时显著增加即为证据），而SynCom−3单独处理将脂肪酶活性维持在对照N-CK相当的水平（83.0 U g⁻¹）。病原体攻击后，脂肪酶反应并未趋同于统一的中等或类对照状态。相反，结果明显依赖具体处理：SynCom−2 + P（78.3 U g⁻¹）相对于SynCom−2单独处理显著增加，而L1–21 + P（78.9 U g⁻¹）与L1–21单独处理无显著差异，SynCom−3 + P（81.1 U g⁻¹）与SynCom−3单独处理也无显著差异。这些发现表明感染并不总是逆转脂肪酶的调节。初始内生菌引发的状态与随后病原体暴露之间的相互作用产生不同结果，可能归因于各合成菌群特定的资源分配或免疫信号差异。
类似地，P-CK感染单独即升高了几丁质酶活性，达到17.1 U g⁻¹，而N-CK为9.5 U g⁻¹（图4C）。令人意外的是，SynCom−2（11.12 U g⁻¹）和SynCom−3 + P（11.6 U g⁻¹）——与最高生物防治效果相关的处理——其几丁质酶活性显著低于病原体攻击的P-CK对照（17.1 U g⁻¹）。
【数据】P-CK PAL活性：11.25 U g⁻¹；N-CK PAL活性：8.57 U g⁻¹；L1–21 + P PAL活性：10.49 U g⁻¹；SynCom−1 + P PAL活性：约10.14 U g⁻¹；SynCom−3 + P PAL活性：约10.33 U g⁻¹；SynCom−2 + P PAL活性：9.12 U g⁻¹；SynCom−1单独脂肪酶活性：106 nmol/min/g；L1–21单独脂肪酶活性：63.1 U g⁻¹；L1–21 + P脂肪酶活性：78.9 U g⁻¹；P-CK脂肪酶活性：74.8 U g⁻¹；N-CK脂肪酶活性：83.0 U g⁻¹；SynCom−2 + P脂肪酶活性：78.3 U g⁻¹；SynCom−3 + P脂肪酶活性：81.1 U g⁻¹；P-CK几丁质酶活性：17.1 U g⁻¹；N-CK几丁质酶活性：9.5 U g⁻¹；SynCom−2几丁质酶活性：11.12 U g⁻¹；SynCom−3 + P几丁质酶活性：11.6 U g⁻¹；显著性：p < 0.0001
3.5 柑橘果实中有机酸含量
果实有机酸含量分析揭示了不同处理间的显著差异（图5）。柠檬酸作为柑橘果实中最丰富的有机酸，其含量在不同处理间表现出明显变化。苹果酸、富马酸、乳酸和莽草酸也表现出处理依赖性的变化模式。不同处理间有机酸谱的差异表明，内生菌处理不仅影响寄主防御反应，还调节果实初级代谢。
【数据】检测的有机酸：柠檬酸、富马酸、乳酸、苹果酸、莽草酸；生物学重复：3次（3 × 6个果实）；显著性阈值：p < 0.05
3.6 枯草芽孢杆菌L1–21和合成菌群对有或无指状青霉攻击的柑橘果实初级代谢产物的影响
对柑橘果实中初级代谢产物的定量分析显示，不同处理下果糖、蔗糖、核糖和葡萄糖含量呈现处理依赖性变化（图6）。内生菌处理和病原体攻击均影响了果实中可溶性糖的含量和组成，表明微生物处理与果实代谢之间存在复杂的相互作用。
【数据】检测的糖类：果糖、蔗糖、核糖、葡萄糖；处理组：CK、P、L1–21、L1–21 + P、SynCom−1、SynCom−2、SynCom−3（含或不含病原体攻击）
3.7 枯草芽孢杆菌L1–21处理后柑橘内生和附生细菌群落的比较分析
对枯草芽孢杆菌L1–21处理后果实内生和附生细菌群落的比较分析显示，处理和对照组之间在细菌群落结构上存在明显差异（图7）。层级聚类分析表明，内生菌L1–21的施用引起了柑橘相关有益微生物组的组成变化，多个细菌分类群（芽孢杆菌属、左氏乳杆菌属、明串珠菌属）差异富集，同时抑制了机会主义属（如Kozakia和Shimwellia）的生长。
【数据】分析区域：内生区室和附生区室；处理组：TR（处理）和CR（对照）；差异富集分类群：Bacillus、Levilactobacillus、Leuconostoc；受抑制属：Kozakia、Shimwellia
讨论与解读
采后腐烂——尤其是指状青霉引起的绿霉病——对全球柑橘产业构成重大经济威胁。由于病原体耐药性增强以及环境和公共健康问题的日益突出，依赖合成杀菌剂的策略正变得不可持续。因此，开发有效且可持续的生物防治方法至关重要，基于芽孢杆菌的解决方案是其中的重要方向。
本研究突出了柑橘本源内生菌株枯草芽孢杆菌L1–21的生物防治潜力——该菌株能够调节柑橘微生物群落的结构和功能，驱动微生物组成变化。在此基础上，研究发现一些潜在细菌与内生菌L1–21形成协同相互作用，并据此开发了SynCom。源自果实的芽孢杆菌单独或与本地内生菌和附生菌组成菌群后，通过直接拮抗和协同重塑果实微生物结构及寄主生理防御（以多种酶的形式）来对抗指状青霉。单独菌株的频繁使用往往对病原体施加选择压力，导致难以管理的抗性菌株进化。相比之下，SynCom策略在农业中控制多样化病原体方面日益受到青睐，耐药性发展风险较低。
编译者解读：本研究的方法学亮点在于"本土微生物资源挖掘+合成菌群设计"的完整链条——从经L1–21处理后的果实中回收可培养微生物，再通过成对组合筛选协同增效配方，最终获得防效超95%的SynCom-3。这一策略避免了外源菌株适应性差的问题，也降低了单一菌株防效不稳的风险。SynCom-3在几丁质酶活性低于P-CK的情况下仍实现最高防效，提示其保护机制可能更多依赖微生物竞争和代谢调节而非单纯激活寄主免疫，值得深入研究。局限在于可培养方法仅能覆盖部分微生物多样性，宏基因组视角或可提供更完整的群落互作图景。
参考来源
Mawdod PA. Designing indigenous Bacillus-based consortia derived from citrus fruit to confer resistance against the green mold pathogen. Postharvest Biology and Technology, 2027.
DOI: 10.1016/j.postharvbio.2026.114636
DOI: 10.1016/j.postharvbio.2026.114636