来源：Integrated transporter engineering and metabolic flux redistribution for efficient production of 3-fucosyllactose in Escherichia coli（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
3-岩藻糖基乳糖（3-FL）是母乳中关键的岩藻糖基化人乳寡糖，在婴幼儿营养与功能食品领域应用前景广阔。其微生物合成长期受制于产物外排效率低与前体代谢通量失衡两大瓶颈。本研究在大肠杆菌中系统筛选多药外排泵，结合计算机辅助蛋白工程获得高效转运变体C139A/R190L，并通过启动子模块化工程重编程GDP-L-岩藻糖前体通量。最终工程菌株在3 L补料分批发酵中总3-FL产量达65.19 g/L，胞外积累比例高达97%，为目前报道的最高水平。
研究背景
人乳寡糖（HMOs）是母乳中第三大固体组分，在塑造婴儿肠道菌群、增强肠道屏障功能及调节免疫应答中发挥关键作用。3-FL作为代表性岩藻糖基化HMO，能促进有益双歧杆菌生长、抑制病原体黏附并缓解肠道炎症。近年来，其安全性与功能性已获全球监管机构认可，加速了在婴幼儿配方奶粉及功能食品中的应用。
工程微生物合成已成为3-FL规模化生产的主流策略。目前，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中均已成功建立3-FL合成途径。其中，大肠杆菌凭借高生产速率、短发酵周期及遗传操作简便性成为最广泛使用的生产底盘。美国FDA已对源自工程化大肠杆菌BL21(DE3)菌株生产的3-FL发布GRAS认证（GRN 925），进一步凸显该生产体系的应用潜力。然而，3-FL的高效微生物合成仍面临产物外排效率不足与前体代谢通量失衡的双重制约——有限的胞外转运会导致产物胞内积累，引发渗透压与代谢压力、反馈抑制或毒性效应，最终损害细胞生长与生产效率。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用菌株与质粒列于表1与表S1。大肠杆菌DH5α用于常规分子克隆与质粒构建。工程菌株B，即BL21(DE3) ΔlacZΔwcaJΔnudDΔlonΔmtlDΔwcaEΔwcaI，作为本工作的亲本底盘菌株。除非另有说明，所有工程菌株均在Luria–Bertani（LB）培养基中常规培养，其组成为10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl。需要时，向LB或发酵培养基中添加卡那霉素（50 μg/mL）或氨苄青霉素（100 μg/mL）以维持质粒。发酵实验在改良M9CA培养基中进行。基础M9CA培养基含酪蛋白氨基酸（2.0 g/L）、KH₂PO₄（3.0 g/L）、Na₂HPO₄（6.8 g/L）、NH₄Cl（1.0 g/L）和NaCl（0.5 g/L）。培养基进一步补充甘油（30 g/L）、酵母提取物（10.0 g/L）、MgSO₄·7H₂O（1.4 g/L）和盐酸硫胺素（10.0 mg/L）。按先前研究所述配方添加微量元素溶液（1.0 mL/L）。灭菌前，培养基初始pH校准至6.8。所有工程菌株首先接种于5 mL LB培养基，37°C、200 rpm振荡培养约12 h制备种子液。种子液随后以3%（v/v）接种量转接至25 mL发酵培养基，在相同条件下培养至OD600约0.6。随后加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）至终浓度0.4 mM以诱导蛋白表达，再加入乳糖至终浓度6 g/L。培养温度降至28°C，于200 rpm继续发酵72 h。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨+5 g/L酵母提取物+5 g/L NaCl）/改良M9CA（2.0 g/L酪蛋白氨基酸+3.0 g/L KH₂PO₄+6.8 g/L Na₂HPO₄+1.0 g/L NH₄Cl+0.5 g/L NaCl+30 g/L甘油+10.0 g/L酵母提取物+1.4 g/L MgSO₄·7H₂O+10.0 mg/L盐酸硫胺素+1.0 mL/L微量元素）；抗生素：卡那霉素50 μg/mL/氨苄青霉素100 μg/mL；pH：6.8；温度：37°C（种子培养）/28°C（发酵）；转速：200 rpm；时间：种子约12h，发酵72h；接种量：3%（v/v）；诱导剂：IPTG 0.4 mM；底物：乳糖6 g/L
2.2 质粒构建
本研究所用引物列于表S2。负责3-FL生物合成的关键酶模块遵循先前建立的设计，其中manB、manC、gmd和wcaG基因使用pRSFDuet-1载体共表达（pRSF-CBGW）。对于糖基转移酶表达质粒，以先前构建的基于pETDuet-1骨架的DS/D质粒为模板。mdfA、acrD、mdtK和emrE基因从大肠杆菌基因组扩增，随后使用ClonExpress II一步克隆试剂盒组装至pETDuet-1载体中实现协调表达。为进一步调控外排泵表达水平，在相应基因上游引入不同强度的核糖体结合位点（RBS）序列。所有重组质粒经DNA测序验证后转化至合适的大肠杆菌宿主菌株进行后续实验。
【数据】载体：pRSFDuet-1（manB-manC-gmd-wcaG共表达）/pETDuet-1（DS/D糖基转移酶及外排泵基因）；克隆试剂盒：ClonExpress II一步克隆试剂盒；外排泵基因：mdfA、acrD、mdtK、emrE
2.3 突变体文库的筛选与构建
为构建具有潜在改善稳定性与功能性的突变体文库，采用多种计算机辅助蛋白设计工具鉴定靶蛋白中的有益突变位点。EVCoupling用于基于多序列比对与进化偶联分析评估突变效应，保留具有正效应值的替换。DeepDDG用于预测折叠自由能变化（ΔΔG = ΔG_野生型 − ΔG_突变体），选择ΔΔG > 0的变体作为潜在稳定化突变。此外，HotSpot Wizard 3.0用于基于结构与功能的热点分析，重点关注位于功能区域、柔性区段或底物结合口袋与通道附近的非高度保守残基。基于上述标准，筛选出50个候选突变位点用于后续文库构建。
定点突变使用表S2所列引物进行。采用基于一步PCR的突变策略引入目标氨基酸替换，以DS/D-(RT72)mdfA为模板。PCR扩增按照2× Phanta Flash Master Mix的厂商方案进行。扩增后，PCR产物经DpnI在37°C处理30 min，随后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。阳性克隆经DNA测序确认后，导入含有pRSF-CBGW的B菌株中，基于3-FL产量进行功能评价。组合突变体以先前轮次获得的质粒为模板通过迭代突变生成。
【数据】突变预测工具：EVCoupling、DeepDDG（ΔΔG > 0为稳定化突变）、HotSpot Wizard 3.0；候选突变位点：50个；模板：DS/D-(RT72)mdfA；DpnI消化：37°C、30 min；宿主：E. coli DH5α；功能评价菌株：B菌株（含pRSF-CBGW）
2.4 CRISPR-Cpf1介导的基因组启动子替换
基因组启动子工程采用基于CRISPR-Cpf1的编辑系统进行，该系统与先前描述的方法基本一致，仅作少量修改。该系统由编码Cpf1核酸酶与λ-Red重组机制的辅助质粒pEgCpf1，以及携带靶标特异性crRNA的编辑质粒pcrEG组成。对于gmd-wcaG操纵子的启动子工程，使用CHOPCHOP网络工具设计含有23-nt间隔序列、靶向gmd上游区域的crRNA，随后克隆至pcrEG中。具体而言，通过供体DNA介导的同源重组，将gmd的天然上游非编码区替换为含有选定启动子的调控盒。供体DNA两侧为约1-kb的上游与下游同源臂。相同策略应用于manC-manB操纵子的启动子工程。本研究所用所有启动子序列列于表S3。
此外，使用相同的CRISPR-Cpf1介导基因组编辑策略构建了MdfA缺失菌株。设计了靶向MdfA编码序列的crRNA，通过两侧含约1-kb同源臂的供体DNA经同源重组缺失MdfA基因。基因组编辑时，首先通过化学转化将Cpf1表达质粒导入工程大肠杆菌B菌株。所得菌株随后与crRNA表达质粒及相应供体DNA共电转。转化子在含卡那霉素和壮观霉素的培养基上筛选。在crRNA引导下，Cpf1在靶位点产生双链断裂，随后通过λ-Red介导的同源重组修复，实现天然启动子的精准替换。候选菌落经菌落PCR筛选并由DNA测序进一步确认。验证后的启动子替换菌株用于后续3-FL生物合成实验。
【数据】编辑系统：CRISPR-Cpf1（pEgCpf1 + pcrEG）；crRNA间隔序列：23-nt；同源臂：约1-kb上/下游；筛选抗生素：卡那霉素+壮观霉素；验证方法：菌落PCR+DNA测序
2.5 实时荧光定量PCR
为评估manC-manB和gmd-wcaG启动子替换前后靶基因的转录变化，进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析。发酵样品在RNA提取前先调整至相同细胞密度。使用FstPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2提取总RNA，使用HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）逆转录试剂盒合成互补DNA（cDNA）。定量PCR使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix按厂商说明进行。16S rRNA基因作为内参进行归一化。所有测定均设三个独立生物学重复，相对转录水平采用2^−ΔΔCt法计算。本研究所用引物序列列于表S2。
【数据】RNA提取试剂盒：FstPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2；逆转录试剂盒：HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）；qPCR试剂：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix；内参基因：16S rRNA；计算方法：2^−ΔΔCt法；生物学重复：3个
2.6 SDS-PAGE分析
为验证目标蛋白的表达水平，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。
【数据】分析方法：SDS-PAGE；检测目标：MdfA蛋白表达水平
研究结果
3.1 不同多药外排泵对3-FL生物合成的影响
用于3-FL生产的工程大肠杆菌菌株的构建如图1所示。大肠杆菌中3-FL的高效生物合成不仅依赖于岩藻糖基转移酶的催化活性和合成途径的代谢通量，还依赖于产物向胞外环境的快速外排。有限的外排可能导致目标产物在胞内积累，引发渗透压与代谢压力以及反馈抑制或毒性效应，最终损害细胞生长与生产力。越来越多的证据表明，外排泵工程可增强高价值生物产品（包括氨基酸、糖类和生物燃料）的生产，凸显了"外排能力"在微生物细胞工厂中的重要性。在3-FL生物合成方面，mdtM的染色体过表达已被证明能显著提高3-FL产量。然而，此类研究主要依赖天然泵的直接过表达，而系统优化表达水平或工程化改造具有增强外排性能的转运蛋白变体的研究仍然有限。因此，需要一种整合外排泵选择、表达调控与转运蛋白工程的更全面工程策略，以最大化3-FL外排并提高整体产量。
根据Du等人的报道，从大肠杆菌主要外排泵家族中选取了四种代表性多药外排泵，包括来自主要促进因子超家族（MFS）的MdfA、来自耐药-结节-细胞分裂（RND）家族的AcrD、来自多药与毒素外排（MATE）家族的MdtK，以及来自小型多药耐药（SMR）家族的EmrE。这些转运蛋白已被报道可介导结构多样底物的外排。特别是MdfA转运蛋白展现出广泛的底物混杂性，能够转运糖类、氨基酸、药物及其他小分子。同样，AcrD、MdtK和EmrE也被证明能识别多种极性化合物。该选择策略旨在涵盖多个转运蛋白家族与转运机制，从而最大化鉴定能够促进3-FL外排的转运蛋白的可能性。
为尽量减少初始比较中翻译起始强度差异带来的偏差，在后续RBS优化之前，选择BBa_B0034作为所有外排泵基因的共同RBS。该策略产生了携带不同外排泵候选基因的菌株B1-B4（图2A）。在所测试的外排泵中，MdfA对3-FL生产表现出积极作用。与菌株B-DS/D（6.16 g/L）相比，将MdfA引入菌株B4使总3-FL产量提高至6.39 g/L，并将外排比例从约0.82提升至0.90。MdfA属于MFS家族的次级转运蛋白，利用质子电化学梯度介导多种化合物的跨膜转运。MdfA介导外排的示意如图2B所示。在3-FL生物合成背景下，mdfA的过表达可能增加3-FL被捕获并进入质子偶联转运循环的概率，从而提高外排比例并促进胞外积累。与此一致的是，在E. coli W3110S中过表达mdfA显著增加了LNT-II在培养基中的积累。类似地，额外染色体整合mdfA被证明可增强LNnT的生产。综上，这些发现支持MdfA在HMO转运与生物合成中广泛发挥积极作用。
为进一步验证MdfA在3-FL外排中的作用，构建了MdfA缺失菌株及相应的回补菌株并进行评价（图S1）。MdfA缺失导致胞内3-FL积累增加，同时总3-FL产量降至5.21 g/L，外排比例降至0.72。相反，重新引入MdfA基本恢复3-FL产量与外排性能。这些结果表明内源MdfA有助于3-FL的外排，增强MdfA介导的转运有利于更高效的3-FL生物合成。
【数据】对照菌株B-DS/D总3-FL产量：6.16 g/L；MdfA过表达菌株B4总3-FL产量：6.39 g/L；外排比例：0.82→0.90；MdfA缺失菌株总3-FL产量：5.21 g/L，外排比例：0.72；外排泵候选基因：mdfA（MFS）、acrD（RND）、mdtK（MATE）、emrE（SMR）
3.2 RBS优化对工程菌株3-FL生产的影响
RBS是位于起始密码子上游的RNA序列，促进核糖体对mRNA的识别与结合。RBS强度调控已被广泛应用于调节翻译效率，从而平衡关键途径蛋白的表达并改善目标代谢物的生物合成。本研究中，MdfA位于DS/D表达盒下游并共享相同的T7转录系统（图2A）。因此，选择RBS工程作为在不改变上游转录架构或影响其他途径模块表达的情况下，在翻译水平微调MdfA表达的简便策略。
除初始筛选中使用的BBa_B0034外，选取了五个不同强度的RBS序列构建mdfA表达盒，包括Duet载体中原本存在的T7 RBS及其变体（T71和T72），以及来自MIT Registry的RBS29、RBS31和RBS35。携带中等强度RBST72的菌株（B6）表现最佳，摇瓶中总3-FL产量达6.61 g/L，较对照菌株B-DS/D提高7%，外排比例升至0.99（图2C）。与发酵结果一致，对携带相应MdfA表达质粒的菌株进行SDS-PAGE分析显示，T72驱动构建体中MdfA对应蛋白条带的灰度值高于BBa_B0034驱动构建体（图S2），表明T72控制下MdfA表达增强。相比之下，携带RBS BBa_B0029的菌株B7在3-FL产量与生物量方面均显著下降。根据Zhu等人报道的强度排序（BBa_B0029 > T72 > BBa_B0034），这些结果表明在本系统中适度增加mdfA翻译起始强度更有利于3-FL积累，而过强的RBS可能施加表达负担，从而损害生长与生产力。
【数据】最佳RBS：T72（中等强度）；菌株B6总3-FL产量：6.61 g/L（较对照B-DS/D提高7%）；外排比例：0.99；RBS强度排序：BBa_B0029 > T72 > BBa_B0034
3.3 计算机辅助鉴定MdfA突变热点
多药外排转运蛋白通过调节代谢物的胞内积累与外排维持细胞稳态，这一功能对于生产被动膜扩散有限的小分子产品尤为关键。本研究中，MFS型外排泵MdfA被引入并展示了对3-FL分泌的有益效果及对胞内积累的缓解作用。重要的是，外排泵对生产性能的贡献不仅取决于其表达水平，还取决于底物识别与质子偶联转运过程。由于野生型MdfA适应于外排结构多样的广谱化合物，它可能并非最大化3-FL外排或在发酵条件下维持稳定性的最优选择。理性与半理性蛋白工程已被广泛用于优化蛋白质功能，包括催化活性、稳定性等。
【数据】外排泵功能决定因素：表达水平+底物识别+质子偶联转运过程；工程策略：理性与半理性蛋白工程
3.4 分子对接分析
利用内向开放构象的MdfA结构对MdfA与3-FL进行分子对接分析。图4显示了野生型MdfA及其突变体中3-FL结合位点的整体结构与局部放大视图。在整体视图中，3-FL 5 Å范围内的残基以粉色突出显示。
【数据】对接结构：内向开放构象MdfA；分析范围：3-FL 5 Å内残基
3.5 GDP-L-岩藻糖供给增强对3-FL生物合成的促进
为增强GDP-L-岩藻糖前体供给，对关键基因簇进行了天然启动子替换策略。图5A展示了3-FL生物合成途径中关键基因簇的天然启动子替换策略示意图。manC-manB和gmd-wcaG基因簇的天然启动子替换对3-FL生产的影响分别如图5B与图5C所示。通过模块化启动子工程增强GDP-L-岩藻糖供给，摇瓶发酵中3-FL产量提高至7.65 g/L。
【数据】摇瓶3-FL产量：7.65 g/L；改造靶点：manC-manB与gmd-wcaG基因簇启动子
3.6 3-L补料分批发酵生产3-FL
工程菌株BG4M3-3在3-L生物反应器中进行补料分批发酵（图6）。发酵过程中间歇补充乳糖溶液，全程监测甘油、乳糖和3-FL浓度及OD600。最终，工程菌株BG4M3-3在3-L补料分批发酵中达到最大总3-FL产量65.19 g/L，胞外积累比例97%，乳糖转化率0.90 mol/mol。
【数据】发酵规模：3-L补料分批；最大总3-FL产量：65.19 g/L；胞外积累比例：97%；乳糖转化率：0.90 mol/mol；补料方式：间歇补充乳糖溶液
讨论与解读
本研究通过半理性外排泵工程与代谢通量再分配的协同策略，在大肠杆菌中实现了3-FL的高水平生产。经系统筛选与结构引导工程，MdfA被确定为改善3-FL分泌的有效靶点。分子对接与结构分析提示，C139A/R190L变体通过改变底物结合腔的局部微环境与构象特性促进3-FL外排。与模块化启动子工程增强GDP-L-岩藻糖供给相结合，摇瓶发酵中3-FL产量提高至7.65 g/L。3-L补料分批发酵中，工程菌株BG4M3-3达到最大总3-FL产量65.19 g/L，胞外积累比例97%，乳糖转化率0.90 mol/mol。高效的胞外分泌不仅增加了产物积累，还有助于简化下游纯化工艺并降低生产成本，凸显了该工艺的工业适用性。
编译者解读：本研究的技术亮点在于将"产物外排"这一常被忽视的瓶颈提升至与代谢通量同等重要的工程高度。传统HMO合成优化多聚焦于途径酶表达与前体供给，而本研究通过计算机辅助蛋白工程对外排泵MdfA进行底物适配性改造，并采用启动子模块化工程协调前体通量，形成了"外排-合成"双轮驱动的系统策略。65.19 g/L的产量与97%的胞外分泌比例不仅刷新了3-FL合成的记录，更意味着下游纯化成本可大幅降低——这对工业化生产的经济性至关重要。该策略对其它复杂寡糖的微生物合成具有直接借鉴意义。
参考来源
Jia R. Integrated transporter engineering and metabolic flux redistribution for efficient production of 3-fucosyllactose in Escherichia coli[J]. Food Bioscience, 2026. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109441
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109441