来源：Metabolic engineering of Escherichia coli Nissle 1917 for efficient de novo biosynthesis of carnosine（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
肌肽（β-丙氨酰-L-组氨酸）在医药、营养保健和化妆品行业需求日益增长，但微生物发酵生产效率长期受限。本研究以大肠杆菌Nissle 1917为底盘，通过鉴定并敲除内源降解酶PepD、筛选高效β-丙氨酸与L-组氨酸合成关键酶、基于结构指导的BacD饱和突变（获得W332F突变体，产量提升51%）、系统强化L-组氨酸合成与ATP供给等多层次策略，最终在5-L发酵罐中实现14.39 g/L肌肽产量——这是迄今报道的微生物发酵法生产肌肽的最高水平。
研究背景
肌肽是一种天然二肽，1900年首次从马骨骼肌提取物中发现。后续研究证实其广泛存在于脊椎动物肌肉和脑组织中。凭借独特的理化性质，肌肽在抗氧化防御、金属离子螯合、pH缓冲、抗糖基化及延缓细胞衰老等多种生理过程中发挥关键作用。近期研究还提示其在COVID-19管理中具有潜在治疗价值——通过减弱细胞因子风暴减轻组织损伤。基于这些广泛的生理活性，肌肽已被制药、营养保健和化妆品行业广泛采用，市场规模随新应用发现持续扩大。
目前肌肽的工业化生产主要依赖化学合成法。该方法虽可行，但受限于肽键形成的固有复杂性，需要多步保护和脱保护操作。这些操作不仅推高生产成本，还产生大量环境污染物，制约了规模化发展。微生物发酵法有望提供更绿色高效的替代路线，但肌肽在细菌中的高效生产面临多重瓶颈——包括内源肽酶降解、前体供给不足、合成酶催化效率低等问题。
研究方法
2.1 菌株、质粒与试剂
大肠杆菌Nissle 1917作为代谢工程改造的起始菌株，DH5α作为克隆宿主。枯草芽孢杆菌168、谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌KT2440和多形拟杆菌DSM 2079作为实验室保存的基因克隆来源菌株。表达质粒载体为pTrc99a，基因组编辑使用CRISPR/Cas9系统。分析级肌肽、L-组氨酸和β-丙氨酸标准品购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。阿拉伯糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）及抗生素（卡那霉素、壮观霉素）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。高保真DNA聚合酶（Phanta Max）、FastPure凝胶DNA提取试剂盒及ClonExpress II一步克隆试剂盒购自诺唯赞生物科技（南京）。其余化学品均为分析级市售试剂。所有质粒经测序验证，本研究所用寡核苷酸引物由生工生物工程（苏州）合成。
【数据】起始菌株：E. coli Nissle 1917；克隆宿主：DH5α；基因来源：B. subtilis 168、C. glutamicum、P. putida KT2440、B. thetaiotaomicron DSM 2079；表达载体：pTrc99a；编辑系统：CRISPR/Cas9；抗生素：卡那霉素、壮观霉素
2.2 质粒构建与基因组编辑
本文所述基因序列使用Phanta Max超保真DNA聚合酶从大肠杆菌Nissle 1917、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌或多形拟杆菌的基因组DNA中扩增获得。表达载体pTrc99a通过PCR线性化。纯化后的PCR片段按照制造商说明书使用ClonExpress II一步克隆试剂盒（诺唯赞，南京）组装至线性化载体中。质粒pWT-BsY2作为所有基因修饰的模板。使用特异性引物对进行定点突变，在目标位点引入单氨基酸替换。所有构建的突变质粒均经DNA测序验证。
大肠杆菌Nissle 1917的基因组编辑（包括基因缺失和染色体整合）使用CRISPR/Cas9系统，操作流程参照本课题组前期研究（Fang et al., 2020）。简要流程如下：先将辅助质粒pCas（携带cas9基因）转化至宿主菌株。随后引入特异性pTarget系列质粒（携带sgRNA和供体DNA）引导基因组编辑。基因缺失时，供体DNA通过直接融合上下游同源臂构建；启动子替换或基因置换时，将目标序列插入同源臂之间。阳性突变体通过菌落PCR和DNA测序鉴定。最后，通过IPTG诱导和37°C培养依次消除pTarget和pCas质粒。隐性基因敲除通过以下方式实现：使用引物pMut1-sg-F/R和pMut2-sg-F/R突变Pcas，将突变后的Pcas导入细胞，然后添加0.5 mM IPTG诱导敲除。
【数据】PCR聚合酶：Phanta Max超保真DNA聚合酶；组装试剂盒：ClonExpress II；基因组编辑：CRISPR/Cas9（pCas + pTarget）；敲除诱导：0.5 mM IPTG；培养温度：37°C
2.3 培养基与培养条件
大肠杆菌DH5α作为质粒构建的克隆菌株，在LB培养基（10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物）中37°C培养。所有基因组编辑操作均使用LB培养基。摇瓶发酵种子培养基为LB，37°C、220 rpm培养18 h。摇瓶发酵培养基含：20 g/L葡萄糖、2 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L (NH₄)₂SO₄、2 g/L柠檬酸、7 g/L K₂HPO₄、1 g/L MgSO₄、0.1 g/L VB₁及5 ml/L微量元素溶液。1000×微量元素溶液含：3 g/L FeSO₄·7H₂O、4.5 g/L CaCl₂·2H₂O、4.5 g/L ZnSO₄·7H₂O、0.84 g/L MnCl₂·2H₂O、0.3 g/L CuSO₄·5H₂O、0.3 g/L CoCl₂·6H₂O、0.4 g/L Na₂MoO₄·2H₂O、1 g/L H₃BO₃、0.1 g/L KI。灭菌葡萄糖在接种时加入培养基，使终浓度为20 g/L。发酵过程中每12 h向摇瓶补加葡萄糖一次，共补加三次，每次使终浓度达到20 g/L。质粒构建、大肠杆菌培养和发酵过程中使用的主要抗生素为50 μg/mL卡那霉素和壮观霉素盐酸盐。
5-L发酵罐种子培养基为TB培养基：24 g/L酵母提取物、12 g/L蛋白胨、5 g/L甘油、3.28 g/L K₂HPO₄·3H₂O、2.31 g/L KH₂PO₄。5-L生物反应器发酵培养基以摇瓶培养基为基础，另加0.5 ml/L消泡剂。补料培养基单独灭菌后混合，含500 g/L葡萄糖、50 g/L酵母提取物、10 g/L (NH₄)₂SO₄、5 g/L MgSO₄·7H₂O、10 g/L KH₂PO₄、2 g/L K₂HPO₄、0.1 g/L VB₁及5 ml/L微量元素溶液。
【数据】LB培养基：10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物；种子培养：37°C、220 rpm、18 h；摇瓶发酵：20 g/L葡萄糖、5 g/L (NH₄)₂SO₄、7 g/L K₂HPO₄、1 g/L MgSO₄；补糖策略：每12 h一次×3次，终浓度20 g/L；抗生素浓度：50 μg/mL；5-L罐种子：TB培养基；补料：500 g/L葡萄糖
2.4 启动子-RBS文库的构建与表征
为优化基因表达水平，以超折叠GFP（sfGFP）为报告基因构建了启动子和核糖体结合位点（RBS）的组合文库。质粒pWT-PR作为骨架载体。对pWT-PR中sfGFP基因上游的原始调控区域进行突变或替换为不同的启动子-RBS组合，生成一系列不同表达强度的衍生质粒。
表征时，将携带这些质粒的工程大肠杆菌Nissle 1917菌株接种于含200 µL LB培养基（含适当抗生素）的96孔微孔板中。培养物在37°C振荡培养12 h。使用酶标仪同时测定荧光强度和细胞密度（OD₆₀₀）。sfGFP的激发和发射波长分别设为488 nm和520 nm。相对表达强度以特异性荧光强度（荧光值/OD₆₀₀）计算，以消除细胞生长差异的影响。
【数据】培养体系：96孔板、200 µL LB；温度：37°C；时间：12 h；激发/发射波长：488/520 nm；表征指标：荧光强度/OD₆₀₀
2.5 同源建模、分子对接与分子动力学模拟
二肽连接酶的晶体结构从蛋白质数据库获取（PDB ID: 3W0M）。基于3W0M使用Pymol生成突变体模型。使用AutoDock Vina进行肌肽（从PubChem获取）的分子对接。可视化使用PyMOL分子图形系统（版本2.5.0，Schrödinger, LLC）完成。随后使用GROMACS软件结合CHARMM36力场（Best et al., 2012）和TIP3P水模型进行分子动力学（MD）模拟。系统经溶剂化、中和及平衡（NVT和NPT阶段）后，进行100 ns生产运行。
【数据】模板结构：PDB ID 3W0M；对接软件：AutoDock Vina；可视化：PyMOL 2.5.0；MD模拟：GROMACS + CHARMM36 + TIP3P；生产运行：100 ns
2.6 全细胞生物催化与酶活测定
为评估工程菌株的催化性能，在摇瓶体系中开展全细胞生物催化实验。重组菌株按上述方法在50 mL LB培养基中培养。细胞通过离心收集（8000 rpm、10 min、4°C），并用磷酸盐缓冲液（PB，50 mM，pH 7.4）洗涤两次。随后将细胞重悬于相同缓冲液中至终密度12.5 g/L（湿细胞重）。10 mL反应体系含20 mM L-组氨酸、20 mM β-丙氨酸、5 mM MgSO₄和5 g/L葡萄糖（用于ATP再生）。反应在37°C、220 rpm振荡条件下进行。6 h后取300 µL反应液，与等体积（300 µL）乙腈混合以终止反应并沉淀蛋白。样品12,000 rpm离心10 min，上清经0.22 µm滤膜过滤后进行HPLC分析。
【数据】离心：8000 rpm、10 min、4°C；缓冲液：50 mM PB、pH 7.4；细胞密度：12.5 g/L湿重；反应体系：20 mM L-组氨酸 + 20 mM β-丙氨酸 + 5 mM MgSO₄ + 5 g/L葡萄糖；反应条件：37°C、220 rpm、6 h；终止：等体积乙腈；离心：12,000 rpm、10 min；过滤：0.22 µm滤膜
2.7 分析方法
细胞生长通过分光光度计测定OD₆₀₀监测。干细胞重（DCW）根据OD₆₀₀值换算，换算系数为1 OD₆₀₀ = 0.33 g/L DCW。肌肽、L-组氨酸和β-丙氨酸的浓度依据前期报道的氨基酸分析方法测定（Zhao et al., 2024）。分析前使用分析级标准品对方法进行验证。肌肽、L-组氨酸和β-丙氨酸的保留时间和峰面积使用标准溶液校准，校准曲线呈现良好线性关系。
【数据】DCW换算：1 OD₆₀₀ = 0.33 g/L；分析方法：HPLC（依据Zhao et al., 2024方法）
研究结果
3.1 大肠杆菌Nissle 1917中肌肽生物合成途径的构建
为构建适合异源质粒稳定表达的微生物底盘，已有研究报道大肠杆菌Nissle 1917中内源质粒Pmut1和Pmut2的存在可能与外源质粒的复制子不兼容，导致后续发酵过程中质粒丢失或拷贝数不稳定（Lin et al., 2024）。虽然前期研究尚未阐明这两个质粒的具体功能，但有报道指出敲除它们不会显著影响菌株生长（Kan et al., 2021; Zainuddin et al., 2019; Zhang et al., 2019）。另有研究表明，在Pmut2不同位点插入基因会产生不同的表达效果（Dong et al., 2023）。因此，本研究利用CRISPR编辑系统敲除内源质粒Pmut1和Pmut2，随后构建了初始底盘菌株WYT00。该菌株为后续代谢途径的引入提供了稳定且无干扰的遗传环境。
肌肽作为二肽分子，极易被大肠杆菌内源肽酶水解降解（Dai et al., 2003; Henrich et al., 1990）。这种降解为细胞生长提供碳源或氮源，是实现肌肽高水平积累的重大障碍（Zhu et al., 2025）。基于文献调研和生物信息学分析，在大肠杆菌中鉴定到一个可能的肽酶基因簇pepABDEQ（Henrich et al., 1990; Yagasaki & Hashimoto, 2008），其中pepD编码降解肌肽的肽酶（Liu et al., 2023b）。为确认pepABDEQ基因簇中各基因在WYT00中对肌肽降解的个体功能，分别敲除WYT00中的pepA、pepB、pepD、pepE、pepQ基因，构建了突变菌株WYT01、WYT02、WYT03、WYT04、WYT05（图2A）。五个突变体与对照WYT00一同在LB培养基中培养。将等量菌体转移至含初始肌肽浓度10 mM的磷酸盐缓冲液中共培养24 h。如图2A所示，仅WYT03样品不能降解肌肽，而其他4个突变体细胞与对照一样能降解肌肽。这表明pepD编码的酶能够降解肌肽。因此，选择突变体WYT03用于构建产肌肽菌株。
解决了产物降解问题后，肌肽的从头合成途径主要涉及两种前体β-丙氨酸和L-组氨酸的供给（Drozak et al., 2010），以及负责二者缩合的二肽连接酶。β-丙氨酸合成的关键酶是天冬氨酸α-脱羧酶。将来自三种细菌的编码天冬氨酸α-脱羧酶的panD基因导入WYT03后，含枯草芽孢杆菌panD的WYT03/pWT-BsD获得0.93 g/L β-丙氨酸，而WYT03/pWT-EcD和WYT03/pWT-CgD仅获得不到0.3 g/L β-丙氨酸，表明枯草芽孢杆菌PanD在三种来源中于大肠杆菌内活性最高（图2B）。
关于L-组氨酸合成，前期研究依赖于受限的HisG酶，该酶受L-组氨酸合成产物反馈抑制（Malykh et al., 2018）。这是限制L-组氨酸在细胞内大规模积累的关键问题。因此，筛选合成能力强的HisG酶对肌肽合成至关重要。除使用实验室保存的大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌和恶臭假单胞菌菌株外，还使用厌氧菌多形拟杆菌进行最优hisG基因的筛选。从厌氧生物中筛选hisG是合理策略，因为来自不同生态位的酶通常表现出不同的调控特性，对反馈抑制的敏感性也各异（Dufour & Donohue, 2012）。将来自上述五种细菌的hisG及来自恶臭假单胞菌的hisZ分别导入WYT03，获得菌株WYT03/pWT-CgG、WYT03/pWT-BsG、WYT03/pWT-EcG、WYT03/pWT-BtG、WYT03/pWT-PpG和WYT03/pWT-PpZ。发酵48 h后测定这六株菌的L-组氨酸产量。含多形拟杆菌hisG的WYT03/pWT-BtG表现出最高的L-组氨酸产量0.33 g/L，而其他五株菌的L-组氨酸产量均低于0.15 g/L（图2C），表明BtHisG能有效改善大肠杆菌中L-组氨酸的合成。
二肽连接酶BacD是ATP依赖型酶（Shomura et al., 2012），其活性决定肌肽合成效率。BacD^N108E/H378K^突变体来源于枯草芽孢杆菌，能够合成肌酸（Kino et al., 2023）。本研究将BsBacD^N108E/H378K^、BspanD和BthisG导入WYT03进行肌肽生物合成，获得菌株WYT03/pWT-Y2DG。如预期，WYT03/pWT-Y2DG产生了59 mg/L肌肽，同时检测到958 mg/L β-丙氨酸和144 mg/L L-组氨酸（图2D）。L-组氨酸与β-丙氨酸合成之间的显著不平衡可能是影响WYT03/pWT-Y2DG中肌肽产量的因素。外源补充L-组氨酸的实验证实了这一点。向培养基中添加1 g/L L-组氨酸后，WYT03/pWT-Y2DG的肌肽产量从59 mg/L增加至132 mg/L（图2D）。然而，尽管产量提高，发酵结束时培养基中L-组氨酸和β-丙氨酸的浓度仍然较高。内源性L-组氨酸供给不足和肌肽合成酶催化效率低是限制当前大肠杆菌肌肽合成效率的两个主要瓶颈。因此，后续研究聚焦于这两个关键限制因素以改善大肠杆菌中的肌肽生物合成。
【数据】底盘菌株：WYT00（敲除Pmut1/Pmut2）；肌肽降解鉴定：10 mM肌肽、PBS、24 h共培养；β-丙氨酸产量：WYT03/pWT-BsD为0.93 g/L，EcD和CgD来源<0.3 g/L；L-组氨酸产量：WYT03/pWT-BtG为0.33 g/L，其余<0.15 g/L；WYT03/pWT-Y2DG：59 mg/L肌肽、958 mg/L β-丙氨酸、144 mg/L L-组氨酸；添加1 g/L L-组氨酸后肌肽：132 mg/L
3.2 BacD蛋白工程改造实现肌肽高效生产
为进一步提高肌肽合成酶的催化效率，本研究采用基于结构模型的理性设计策略。首先使用AutoDock Vina（Eberhardt et al., 2021; Trott & Olson, 2010）将肌肽与双突变酶BacD^N108E H378K^进行分子对接（图3C），以鉴定活性口袋内对肌肽有响应的关键残基。以肌肽为中心，识别3Å半径内的氨基酸作为潜在关键位点。基于相关文献，另鉴定16个可能位点作为潜在关键位点，并对其进行饱和突变。由于酶的催化过程需要ATP，采用全细胞催化方法，通过添加葡萄糖供给ATP。
全细胞催化结果显示，W332F、W332L、W332Y以及S184L、S184G、S184N、S184C、S184E均表现出不同程度的肌肽合成能力提升（图3A）。高活性突变体（Asn、Gly、Cys）可能消除了野生型丝氨酸的刚性羟基，同时维持了结合口袋边缘的中性环境。此外，引入的N残基重塑了更灵活的氢键网络，从而促进底物结合。然而，将表现最佳的W332F（活性为对照的1.51倍）与S184上不同有益突变位点组合，未产生任何优势突变（图3B）。
三突变酶与肌肽的分子对接（图3D）显示，肌肽的构象发生旋转，332F突变使苯丙氨酸的芳香环与肌肽的咪唑环形成T型π-π相互作用。这可能有助于酶更好地吸引底物并催化反应。此外，W332F突变减小了底物通道内的空间位阻。如图3D所示，与野生型Trp相比，突变后的Phe侧链更短，为底物进入活性位点提供了更宽敞的通道。
【数据】突变策略：饱和突变；对接软件：AutoDock Vina；关键位点范围：3Å半径；W332F活性：对照的1.51倍；有益突变：W332F/L/Y、S184L/G/N/C/E；组合突变效果：无叠加优势
3.3 强化大肠杆菌WYT03中L-组氨酸生物合成
通过筛选获得的关键酶和突变体为肌肽合成提供了基础，但L-组氨酸的胞内供给仍不足以支撑高效生产。L-组氨酸在大肠杆菌中的生物合成受到严格调控。其合成途径中的第一个关键酶HisG受产物L-组氨酸的反馈抑制。此外，his操纵元的转录还受衰减子机制调控——前导肽hisL的翻译效率与胞内L-组氨酸水平偶联。
为强化L-组氨酸合成，本研究首先构建了启动子-RBS组合文库。以sfGFP为报告基因，筛选在目的基因位点具有最佳表达强度的启动子-RBS组合。通过比较不同组合的表达强度，筛选出最优组合Ptac-R2（图4A）。该组合被用于替换his操纵元的前导肽hisL，从而解除转录衰减调控。同时，利用Ptac-R2激活prs基因的表达，增强磷酸核糖焦磷酸（PRPP）的供给——PRPP是L-组氨酸合成的重要前体。
在此基础上，对L-组氨酸合成途径的代谢流进行进一步优化。敲除了edd基因（编码6-磷酸葡萄糖酸脱水酶，分流碳源进入ED途径）、amn基因（编码AMP核苷酶，消耗ATP）和purF基因（编码氨基磷酸核糖转移酶，分流PRPP进入嘌呤合成途径）。这些基因的删除使更多碳源和PRPP流向L-组氨酸合成。经上述改造获得菌株WYT10，其L-组氨酸产量显著高于WYT03。
进一步系统强化ATP供给。用Ptac-R2驱动的Cgppk2（谷氨酸棒杆菌多磷酸激酶2）替换purF位点，用Ptac-R2驱动的BsrocG（枯草芽孢杆菌梭菌蛋白酶G）替换ldhA位点，在yfcc基因上游插入Ptac-R2启动子，并敲除pitA基因（编码无机磷酸转运蛋白），最终获得菌株WYT17。
【数据】启动子-RBS筛选：Ptac-R2最优；基因删除：edd、amn、purF；基因替换：purF→Cgppk2（Ptac-R2驱动）、ldhA→BsrocG（Ptac-R2驱动）；启动子插入：yfcc上游；基因敲除：pitA；获得菌株：WYT10、WYT17
3.4 工程菌株中肌肽的发酵生产
为评估最终工程菌株的肌肽生产能力，将共过表达BsPanD、BtHisG和BsBacD^N108E H378K W332F^的质粒pWT-Y3DG导入WYT17，获得最终生产菌株WYT17/pWT-Y3DG。图5显示了用于大肠杆菌中肌肽生产的质粒pWT-Y2DG和pWT-Y3DG的图谱（图5A）。摇瓶发酵比较了WYT03/pWT-Y2DG与WYT17/pWT-Y3DG的细胞生长、肌肽产量、β-丙氨酸及L-组氨酸水平（图5B）。
结果表明，WYT17/pWT-Y3DG在摇瓶水平表现出显著优于WYT03/pWT-Y2DG的肌肽合成性能。为进一步评估规模化生产潜力，在5-L发酵罐中进行补料分批发酵。在整个发酵过程中，定期测定细胞生长、葡萄糖消耗、肌肽产量、L-组氨酸和β-丙氨酸水平（图6）。发酵结束时，WYT17/pWT-Y3DG的肌肽产量达到14.39 g/L，产率（以葡萄糖计）为0.145 g/g葡萄糖，生产率为0.133 g/(L·h)。据作者所知，这是迄今报道的微生物发酵法从头合成肌肽的最高产量。
【数据】最终菌株：WYT17/pWT-Y3DG；5-L补料分批发酵：肌肽14.39 g/L；产率：0.145 g/g葡萄糖；生产率：0.133 g/(L·h)
讨论与解读
本研究系统整合了表达系统优化、理性酶工程和系统性代谢工程策略来提升大肠杆菌Nissle 1917中的肌肽产量。通过启动子和RBS优化，鉴定出表达性能最佳的元件组合Ptac-R2。通过筛选并鉴定新型高效酶BtHisG，显著缓解了L-组氨酸前体供给瓶颈。经结构引导理性设计并获得分子动力学模拟验证的肌肽合成酶突变体W332F，进一步解决了催化效率限制。通过系统强化能量供给和重塑L-组氨酸代谢途径，结合5-L生物反应器中的高密度补料分批发酵，最终实现14.39 g/L的肌肽产量，产率为0.145 g/g葡萄糖，生产率为0.133 g/(L·h)。据作者所知，这是迄今微生物发酵法从头合成肌肽的最高产量。该研究为细菌中肌肽的从头生物合成提供了稳健高效的框架。
编译者解读
该研究提供了一个值得借鉴的多层次代谢工程范式——从底盘净化（敲除内源质粒和降解酶）、元件筛选（跨物种酶比较、启动子-RBS组合优化）到蛋白工程（结构指导的饱和突变）层层递进，逻辑严谨。尤其亮点在于：一是将厌氧菌来源的BtHisG引入大肠杆菌以规避反馈抑制，体现了跨生态位筛选酶的策略价值；二是W332F单点突变即提升产量51%，且分子对接揭示了T型π-π相互作用机制，展示了理性设计在二肽合成酶改造中的有效性。值得注意的是，最终摇瓶与5-L罐水平的数据差距提示放大过程中仍存在优化空间，且14.39 g/L的产量虽创纪录，距工业化要求仍有距离。后续研究可关注前体供给的进一步平衡及发酵工艺的精细化调控。
参考来源
Tang, Y. Metabolic engineering of Escherichia coli Nissle 1917 for efficient de novo biosynthesis of carnosine. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135801
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135801