来源：Metabolic pathway engineering and substrate channeling for enhancing N-acetylneuraminic acid biosynthesis in Escherichia coli（Process Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）作为唾液酸家族的主要成员，在抗病毒、抗氧化及免疫调节等方面具有多重生理功能。本研究以大肠杆菌为底盘，通过RIDD-RIAD自组装肽对介导多酶复合物的构建与优化，结合UDP-GlcNAc前体供给强化，最终在5-L生物反应器中实现74.116 g/L的Neu5Ac产量。该工作展示了合成多酶复合物作为代谢途径空间组织策略的实用价值。
研究背景
Neu5Ac广泛存在于人类、哺乳动物及部分脊椎动物细胞表面的糖脂和糖蛋白中，介导细胞间通讯与识别，并调节免疫和炎症反应。其已被美国FDA、欧洲食品安全局及中国政府批准作为新型食品添加剂。传统Neu5Ac获取方式包括天然提取（如燕窝、酪蛋白）及化学/酶法合成，但天然提取受制于原料成本高、来源有限。因此，建立绿色、高效、低成本的Neu5Ac生物合成路线具有重要应用价值。本研究基于代谢工程与合成生物学手段，以大肠杆菌为宿主，通过构建人工多酶复合物实现途径酶的邻近效应，以期提升Neu5Ac的合成效率。
研究方法
2.1 试剂、菌株与质粒
用于细菌培养基配制的胰蛋白胨和酵母提取物购自美国密歇根州底特律的Difco Laboratories公司。异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）、抗生素及其他分析级化学品购自上海生工生物工程有限公司。Neu5Ac标准品购自上海慧诚生物科技有限公司。化学信息详见补充材料表S1。本研究所用菌株、质粒及引物分别详列于表1、表S2和表S3。大肠杆菌JM109用作质粒克隆和扩增宿主；工程菌株大肠杆菌B5Q——由大肠杆菌BL21(DE3)敲除lacZ、nanA、nanK、nanT和nagB所得——作为异源途径表达和发酵研究的底盘菌株。商业表达载体pCDFDuet−1、pACYCDuet−1、pETDuet−1和pRSFDuet−1购自Novagen公司（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。携带前体途径基因的重组质粒（pAC-MUS、pET-MUS和pRSF-MUS*）分别以pCDFDuet−1（CDF13复制子）、pACYCDuet−1（p15A复制子）、pETDuet−1（pMBR322复制子）和pRSFDuet−1（RSF复制子）为骨架构建。质粒详细规格及合成寡核苷酸引物序列见补充材料表S2和表S3。
【数据】菌株：E. coli JM109、E. coli B5Q（BL21(DE3)ΔlacZΔnanAΔnanKΔnanTΔnagB）；质粒骨架：pCDFDuet−1、pACYCDuet−1、pETDuet−1、pRSFDuet−1；试剂来源：Difco、Sangon Biotech、HuicH Biotech、Novagen
2.2 培养基与培养条件
基因改造菌株的培养过程涉及多阶段种子培养和产物流加培养，使用特定营养培养基和生长条件。菌株首先接种于4 mL含适量抗生素的Lysogeny Broth（LB）液体培养基中——根据质粒标记添加氨苄青霉素（100 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）、氯霉素（34 μg/mL）或壮观霉素（50 μg/mL）以维持质粒稳定性——于37°C、200 rpm恒温振荡培养约12小时，直至600 nm光密度（OD600）达到1.0–1.2。随后，将2%（v/v）种子培养液转接至25 mL含相同工作浓度筛选抗生素的限定葡萄糖培养基（DM）中，于37°C、200 rpm振荡培养至OD600达到1.0–1.2。随后加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mM诱导基因表达，温度降至25°C继续发酵72小时。LB和DM培养基的完整组成（含微量元素组成）详见补充材料表S1。
【数据】培养基：LB、DM；抗生素浓度：氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氯霉素34 μg/mL、壮观霉素50 μg/mL；温度：37°C（培养）/25°C（诱导发酵）；转速：200 rpm；时间：约12 h（种子）/72 h（发酵）；IPTG浓度：0.5 mM；接种量：2%（v/v）；OD600：1.0–1.2
2.3 补料分批发酵
菌株B5Q−15的发酵在5-L生物反应器（T&J Bioengineering，上海）中进行，含2 L DM培养基，初始葡萄糖浓度为20 g/L。种子培养物以5%浓度接种。当OD600达到约25时，温度从37°C降至25°C以优化重组蛋白表达并减少错误折叠和聚集。此时加入0.500 mM IPTG诱导目标基因表达。发酵过程中，通过自动添加28%（w/v）氨水维持pH在6.800，溶氧含量维持在20%至40%之间以确保充足的氧气供应。含600 g/L葡萄糖、20 g/L MgSO4·7H2O和0.200 g/L硫胺素的营养液也被补入发酵液中，为细胞生长和代谢提供能量和辅因子。
【数据】反应器：5-L生物反应器；初始葡萄糖：20 g/L；接种量：5%；诱导OD600：约25；温度：37°C→25°C；IPTG：0.500 mM；pH：6.800（28% w/v氨水自动调节）；溶氧：20%–40%；补料成分：600 g/L葡萄糖、20 g/L MgSO4·7H2O、0.200 g/L硫胺素
2.4 分析方法
为将细胞组分与胞外培养基分离，发酵液于12,000 rpm、4°C离心10分钟。所得上清液经滤膜过滤去除残余颗粒。胞外Neu5Ac浓度通过高效液相色谱（HPLC）测定，使用Zorbax NH2色谱柱（Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉）配合示差折光检测器。葡萄糖浓度使用1200系列HPLC系统测定。细胞生长通过分光光度计（METASH，上海）测量600 nm光密度监测。所有摇瓶和发酵罐实验均进行至少三次独立生物学重复（n ≥ 3），结果以平均值±标准差（SD）表示。各实验组间差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计。p < 0.05（）、p < 0.01（）、p < 0.001（）和p < 0.0001（****）被认为具有统计学显著性。所有统计分析和图表制作均使用GraphPad Prism软件完成。
【数据】离心条件：12,000 rpm、4°C、10 min；检测方法：HPLC（Zorbax NH2柱+示差折光检测器）；统计方法：one-way ANOVA；显著性阈值：p < 0.05（）、p < 0.01（）、p < 0.001（）、p < 0.0001（****）；生物学重复：n ≥ 3
研究结果
3.1 大肠杆菌Neu5Ac从头合成途径的构建及关键途径酶筛选
大肠杆菌BL21(DE3)被选作Neu5Ac生物合成的宿主底盘。在Zhao等人[15]的前期研究中，一株基因改造大肠杆菌以甘油为唯一碳源实现了Neu5Ac的生产。为将碳通量导向目标产物，本研究敲除了多个参与副产物生成及中间产物/终产物降解的内源基因，包括nanA（Neu5Ac醛缩酶，将Neu5Ac水解为丙酮酸和ManNAc）、nanK（ManNAc激酶，将ManNAc转化为ManNAc−6-P）、nagB（葡萄糖胺−6-P脱氨酶，将葡萄糖胺−6-P转化为果糖−6-P）和nanT（唾液酸转运蛋白，促进Neu5Ac摄取）。本研究直接使用该工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔnanAΔnanKΔnanTΔnagB（简称B5Q）作为亲本菌株。
如图1所示，Neu5Ac的合成涉及两个关键途径酶NeuC和NeuB，它们将前体UDP-GlcNAc转化为Neu5Ac。多项研究表明，筛选具有更高活性和效率的途径酶对改善Neu5Ac生物合成至关重要。为此，本研究考察了来自脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，简称Nm）和空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni，简称Cj）的NeuB和NeuC。此外，多顺反子操纵子或质粒多克隆位点（MCS）中多个目标基因的顺序和相对位置可显著影响其表达水平，进而影响终产物合成。因此，本研究将neuB和neuC插入表达载体pCDFDuet−1的不同克隆盒中考察基因顺序。具体而言，构建了重组质粒pCD-CjneuB-CjneuC、pCD-CjneuC-CjneuB、pCD-NmneuB-NmneuC和pCD-NmneuC-NmneuB，并分别转化至菌株B5Q中，获得菌株B5Q−1至B5Q−4。摇瓶发酵结果（图2）显示，菌株B5Q−2产生0.828 g/L Neu5Ac，而菌株B5Q−1、B5Q−3和B5Q−4分别积累0.690、0.754和0.627 g/L。这些结果表明，将源自空肠弯曲杆菌的neuC和neuB分别插入pCDFDuet−1质粒的第一个和第二个多克隆位点可获得最高的Neu5Ac产量。
【数据】菌株B5Q−2 Neu5Ac产量：0.828 g/L；菌株B5Q−1：0.690 g/L；菌株B5Q−3：0.754 g/L；菌株B5Q−4：0.627 g/L；敲除基因：lacZ、nanA、nanK、nanT、nagB；来源菌种：N. meningitidis、C. jejuni
3.2 基于相互作用基序的多酶复合物构建以提升Neu5Ac产量
越来越多的证据表明，工程化多酶复合物可有效提高代谢途径效率并改善目标化合物的生产指标（即产量和生产率）。为减少中间步骤的扩散损失并提高代谢途径的整体通量，本研究利用自组织肽系统RIDD-RIAD构建了合成多酶复合物。构建多酶复合物已采用多种技术策略，包括工程化蛋白或核酸支架、无支架自组装以及合成亚细胞区室（无膜细胞器或细菌微区室）[26–32]。其中，基于相互作用的蛋白/肽对组装方法因其简单性、高效率和广泛适用性而备受青睐，已被广泛用于强化代谢通量和促进目标化学品的合成。本研究利用一对相互作用肽RIDD–RIAD驱动两个途径关键酶NeuC和NeuB的空间组织以实现Neu5Ac生物合成。该基序对具有构建合成代谢区室所必需的三个特性：相对较低的分子量、高结合亲和力（KD∼1.2 nM）以及明确的组装架构（RIDD二聚体特异性结合RIAD单体）[22,33,34]。这些独特特征共同使该相互作用对成为构建定制酶复合物的稳健且可编程平台。
RIDD-RIAD组装增强级联效率的原理已在文献中得到充分证实。多项独立研究表明该肽对通过底物通道提高催化转换率和代谢通量，包括中间产物减少和通量增强的定量测定[22,34,35]。本研究在此既有知识基础上将该系统应用于新的生物合成途径。具体而言，通过C末端融合构建了两个质粒：pCD−neuCRA−neuBRD（NeuC−RIAD/NeuB−RIDD）和pCD−neuCRD−neuBRA（NeuC−RIDD/NeuB−RIAD）。这些质粒随后分别转化至菌株B5Q中，生成菌株B5Q−9和B5Q−10。摇瓶发酵显示B5Q−10产生1.117 g/L Neu5Ac，较B5Q−2增加约35.3%（图3）。相比之下，菌株B5Q−9仅达到0.477 g/L Neu5Ac的产量。推测B5Q−10的更好表现源于最佳标签定位及NeuC−RIDD/NeuB−RIAD形成的酶组装空间构象。为系统评估肽标签对酶活性和Neu5Ac生产的影响，通过C末端融合构建了单标签菌株B5Q−5（NeuC−RIAD/NeuB）、B5Q−6（NeuC/NeuB−RIDD）、B5Q−7（NeuC−RIDD/NeuB）和B5Q−8（NeuC/NeuB−RIAD）。比较发酵分析显示不同的催化结果：RIAD与NeuC或NeuB的C末端融合（菌株B5Q−5和B5Q−8）分别产生0.901 g/L和0.877 g/L的Neu5Ac滴度，均略高于B5Q−2。相反，RIDD与任一酶的融合导致Neu5Ac产量略有降低。推测将RIAD标签融合至途径酶C末端可能增强NeuC和NeuB的功能表达，从而改善Neu5Ac生物合成。将相互作用基序RIDD融合至NeuC（而非NeuB）的C末端对酶催化活性和Neu5Ac生物合成产生较小的负面影响（图3）。综合这些结果表明，RIDD−RIAD相互作用介导的酶组装能够增强催化级联，有效提升Neu5Ac产量。
【数据】B5Q−10产量：1.117 g/L（较B5Q−2提高约35.3%）；B5Q−9产量：0.477 g/L；B5Q−5：0.901 g/L；B5Q−8：0.877 g/L；结合亲和力：KD∼1.2 nM
3.3 多酶复合物组分优化以提升Neu5Ac生物合成
进一步研究了调节酶复合物的空间排布和化学计量比是否可提高级联效率并促进Neu5Ac生物合成。值得注意的是，通过将多个相互作用标签连接至途径酶上，可构建结构可调、组成可编程的多酶复合物。具体而言，构建了包含两个拷贝RIDD连接至NeuC和两个拷贝RIAD连接至NeuB的质粒pCD−neuCRDRD−neuBRA和pCD−neuCRD−neuBRARA，并分别导入菌株B5Q中，生成菌株B5Q−11和B5Q−13。发酵结果显示B5Q−11产生1.496 g/L Neu5Ac，较B5Q−10提高34%。此外，菌株B5Q−13的Neu5Ac滴度达2.384 g/L，较B5Q−10提高113%（图4）。与B5Q−11（两个拷贝RIDD串联连接至NeuC的C末端）不同，菌株B5Q−13中两个RIAD标签串联融合至NeuB的C末端，产生了完全不同的酶组装框架。与菌株B5Q−10（NeuCRD和NeuBRA）相比，菌株B5Q−11（NeuCRDRD和NeuBRA）和B5Q−13（NeuCRD和NeuBRARA）中形成的胞内多酶复合物含有更高比例的NeuC。前期研究也表明NeuB相对低于NeuC的表达水平更有利于Neu5Ac的合成。
【数据】B5Q−11产量：1.496 g/L（较B5Q−10提高34%）；B5Q−13产量：2.384 g/L（较B5Q−10提高113%）
3.4 UDP-GlcNAc供给强化对Neu5Ac合成的影响
UDP-GlcNAc是Neu5Ac生物合成的关键前体。为强化UDP-GlcNAc的内源合成途径，本研究对编码UDP-GlcNAc合成途径中相关酶的基因进行了过表达。具体包括将大肠杆菌来源的glmS（编码L-谷氨酰胺-D-果糖-6-磷酸酰胺转移酶）、glmM（编码磷酸葡萄糖胺变位酶）和glmU（编码UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶）等基因构建至表达载体中，并转化至已含多酶复合物相关质粒的菌株中。通过摇瓶发酵评估了UDP-GlcNAc供给强化对Neu5Ac产量的影响。结果显示，强化UDP-GlcNAc合成途径的菌株较未强化菌株展现出更高的Neu5Ac产量，表明前体供给的充足性是Neu5Ac高效合成的关键限制因素之一。
【数据】强化基因：glmS、glmM、glmU（来源：大肠杆菌）
3.5 5-L生物反应器放大发酵
在完成摇瓶水平的多酶复合物构建与优化以及UDP-GlcNAc供给强化后，最优菌株B5Q−15在5-L生物反应器中进行了补料分批发酵放大实验。发酵过程中，通过自动补加氨水维持pH在6.800，溶氧维持在20%–40%之间。当OD600达到约25时，温度从37°C降至25°C并加入IPTG至终浓度0.500 mM诱导蛋白表达。补料营养液含600 g/L葡萄糖、20 g/L MgSO4·7H2O和0.200 g/L硫胺素。最终，菌株B5Q−15在5-L生物反应器中实现了74.116 g/L的Neu5Ac产量和1.370 g/L/h的生产率（图6）。
【数据】Neu5Ac产量：74.116 g/L；生产率：1.370 g/L/h；反应器体积：5-L；pH：6.800；溶氧：20%–40%；IPTG：0.500 mM
讨论与解读
本研究通过代谢工程与合成生物学策略，在大肠杆菌中构建并优化了Neu5Ac的从头生物合成途径。核心策略包括：（1）敲除内源竞争及降解途径基因（nanA、nanK、nanT、nagB）以重定向碳通量；（2）从脑膜炎奈瑟菌和空肠弯曲杆菌中筛选高活性NeuB和NeuC酶，并优化基因排列顺序；（3）利用RIDD-RIAD自组装肽对构建多酶复合物，实现底物通道效应——最优组合（NeuC-RIDD/NeuB-RIAD，即B5Q-10）较游离酶版本提高35.3%；（4）通过调节酶复合物化学计量比（双拷贝RIAD融合至NeuB获得菌株B5Q-13）较B5Q-10进一步提高113%；（5）强化UDP-GlcNAc前体供给。最终在5-L反应器中实现74.116 g/L产量和1.370 g/L/h生产率。
编译者解读
该研究的技术亮点在于用RIDD-RIAD肽对实现途径酶的空间组织——以最小化的蛋白标签实现底物通道效应，避免了复杂的支架蛋白设计。B5Q-13较B5Q-10产量翻倍的实验结果提示，酶复合物的化学计量比（而非仅空间邻近）对级联效率具有决定性影响，这为多酶复合物的理性设计提供了重要参考。值得注意的是，虽然74.116 g/L的产量在微生物发酵生产Neu5Ac领域属于较高水平，但研究中UDP-GlcNAc供给强化部分的描述相对简略，原文未详述各强化菌株的具体产量数值。此外，该策略对其他需要多步级联催化的产物合成具有方法学借鉴意义，但RIDD-RIAD系统在工业发酵条件下的长期稳定性仍需考察。
参考来源
Liu Y. Metabolic pathway engineering and substrate channeling for enhancing N-acetylneuraminic acid biosynthesis in Escherichia coli. Process Biochemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.procbio.2026.08.006
DOI: 10.1016/j.procbio.2026.08.006