来源：Phosphatase-mediated mitigation of rare earth element toxicity to Pseudomonas putida（Ecotoxicology and Environmental Safety）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
稀土元素（REE）正随着人类活动不断进入环境，其对土壤微生物的毒性效应尚缺乏系统认知。本研究以恶臭假单胞菌KT2440为对象，系统评估了16种REE的毒性，发现该菌对轻稀土高度敏感（IC50低至0.31 µM）。通过适应性实验室进化，研究者分离出耐受菌株并锁定碱性磷酸酶基因uxpB的单点突变。实验证实，增强的磷酸酶活性通过释放有机磷中的磷酸根，介导REE的络合固定，从而降低其生物可利用性。
研究背景
稀土元素包括15种镧系元素（Z=57-71）以及钪（Z=21）和钇（Z=39），依据原子质量和地球化学行为分为轻稀土（La至Eu）和重稀土（Gd至Lu）。它们因共同的三价氧化态和相近的离子半径而具有相似的化学性质。镧系收缩效应——随原子序数增加离子半径递减——导致各REE间存在微妙但显著的化学行为差异。REE凭借独特的电子构型，在现代技术中不可或缺，从风力发电机和电动机的永磁体到催化剂和医学成像均有用武之地。尽管名为"稀土"，它们在地壳中并不稀缺，常以磷酸盐、碳酸盐或硅酸盐矿物形式共生，天然浓度与Zn、Cu、Ni等生物必需微量元素相当。轻稀土的地壳丰度显著高于重稀土。随着人为活动加剧REE向环境 compartments 的输入，其生态毒理效应日益引发关注，而针对细菌的REE毒性研究仍十分有限。
研究方法
5.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用菌株和质粒列于表S2。表型实验采用改良MOPS培养基（Neidhardt等，1974）培养恶臭假单胞菌KT2440及其衍生菌株，培养基组成为：MOPS 40 mM、NH4Cl 9.52 mM、MgCl2 1 mM、K2SO4 276 µM、FeSO4 10 µM、CaCl2 50 µM、NaCl 50 mM、Tricine 4 mM、丁二酸钠二碱式六水合物25 mM、rac-甘油-1-磷酸钠1 mM（Sigma）。如需要，添加庆大霉素30 µg·mL⁻¹和L-阿拉伯糖（Sigma）0.1% w/v或0.0125%。除非另有说明，过夜培养使用与相应实验相同的培养基。培养条件为28°C、180 rpm，初始OD600为0.05。所有REE均以氯化物形式购自Sigma。REE溶液用双蒸水配制并经微孔过滤灭菌。质粒和突变株构建时，恶臭假单胞菌和大肠杆菌在溶菌肉汤（LB，Sigma）或M9培养基（Miller，1972）中培养。如需要，添加卡那霉素50 µg/mL、庆大霉素30 µg·mL⁻¹或5-氟尿嘧啶20 µg·mL⁻¹。固体培养基添加琼脂15 g·L⁻¹。
【数据】培养基：改良MOPS；温度：28°C；转速：180 rpm；初始OD600：0.05；抗生素：庆大霉素30 µg·mL⁻¹、卡那霉素50 µg/mL、5-氟尿嘧啶20 µg·mL⁻¹；碳源：丁二酸钠25 mM；磷源：rac-甘油-1-磷酸钠1 mM
5.2 剂量-反应生长抑制实验
菌株在96孔板中培养，添加各金属的浓度梯度（9.7 nM至10 µM），通过系列稀释制备。培养24小时后测定最终OD600值，以无REE培养物的吸光度作为100%值进行归一化。半数生长抑制浓度（IC50）使用四参数非线性回归计算（Prism 10.4.2版）。若数据不足以计算95%置信区间，则在假设IC50以上浓度补充生长抑制实验，直至获得置信区间。剂量-反应曲线间的统计学差异采用额外平方和F检验评估（Prism 10.4.2版）。
【数据】REE浓度范围：9.7 nM–10 µM；培养时间：24 h；统计方法：四参数非线性回归、额外平方和F检验
5.3 REE分析
样品中REE定量采用电感耦合等离子体质谱法（Thermo iCap TQ ICP-MS，Thermo Fisher）。ICP-MS仪器每日针对氧化物和双电荷离子进行调谐，并检查质量校准精度。采用SQ-KED（单四极杆-动能歧视）或TQ-O2质量转移模式（三重四极杆氧反应）以限制潜在的多原子或同量异位素干扰。使用添加2% HNO₃（v/v）（NORMATOM，VWR）的合成多元素标准溶液（AccuStandard）进行外标校准。校准准确性使用认证参考地表水（SPS-SW1，Spectrapure Standards）验证。仪器漂移通过每10–20个样品运行SPS-SW1并向样品中添加Rh和Ir作为内标进行监测。每个溶液测量三次并取平均值。培养基中REE形态计算使用Visual MINTEQ 3.1软件及默认数据库。REE配体络合物的相关稳定常数和REE磷酸盐矿物相的溶度积取自Spahiu和Bruno（2026）筛选的数据。各组分输入浓度由MOPS培养基组成计算得出。
【数据】校准酸度：2% HNO₃；内标：Rh和Ir；测量次数：3次/溶液；软件：Visual MINTEQ 3.1；ICP-MS模式：SQ-KED或TQ-O2
5.4 REE胁迫耐受变体的分离
恶臭假单胞菌KT2440 WT*菌株在96孔板中、含不同NdCl₃浓度（250 nM至2 µM）的条件下培养24小时。将最高Nd浓度下出现细菌生长的孔用于在相同条件下重启生长周期。重复此过程直至获得稳定的Nd耐受表型。随后将这些培养物的稀释液涂布于非选择性LB平板，单个克隆进一步在LB平板上划线，之后通过IC50测定评估其抗性表型。选择对Nd抗性最高的进化菌株，通过其基因组的Oxford Nanopore测序（PlasmidSaurus，Louisville，KY，USA）和变异检出鉴定致病变变。序列使用BWA-MEM比对至恶臭假单胞菌KT2440参考基因组（登录号：AE015451.2），单核苷酸多态性（SNP）检出使用FreeBayes和BCFtools，通过BV-BRC网站（Olson等，2023）获取。
【数据】NdCl₃浓度：250 nM–2 µM；培养时间：24 h/周期；测序平台：Oxford Nanopore；参考基因组：AE015451.2
5.5 通用分子生物学操作
高保真聚合酶链式反应（PCR）使用Fidelio Hot Start DNA聚合酶（Ozyme）进行。对照PCR使用Phire Hot Start PCR预混液（Thermo Scientific）进行。本研究所用引物列于补充表3。限制性内切酶按制造商说明书使用（Thermo Scientific）。基因组DNA提取和纯化使用Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega）。质粒提取和PCR产物纯化分别使用Nucleospin Plasmid kit和Nucleospin Gel and PCR Clean-up kit（Macherey Nagel）。Gibson组装使用NEBuilder Hifi DNA Assembly Master Mix（New England Biolabs）。所有试剂盒均按制造商说明书使用。
【数据】PCR聚合酶：Fidelio Hot Start、Phire Hot Start；DNA提取试剂盒：Wizard Genomic DNA Purification Kit；组装试剂盒：NEBuilder Hifi DNA Assembly Master Mix
5.6 质粒构建
构建缺失质粒pJOE-uxpB和pJOE-xcpRST时，分别以KT2440基因组DNA为模板，使用引物对Up_uxpB_fwd/Up_uxpB_rev和Down_uxpB_fwd/Down_uxpB_rev、Up_xcpR_fwd/Up_xcpR_rev和Down_xcpT_fwd/Down_xcpT_rev，PCR扩增uxpB和xcpRST基因上下游各约800–1000 bp的区域。随后将上下游扩增子与BamH1消化的pJOE6261.2经Gibson组装连接，转化至大肠杆菌DH5α。此前构建的质粒pJOE-tatC1（Wehrmann等，2019）用于tatC1基因的缺失。构建表达质粒pJN105:uxpB时，使用uxpB_fwd/uxpB_rev引物对扩增野生型uxpB基因。pJN105载体经XbaI消化，与扩增子经Gibson组装连接，使uxpB表达受L-阿拉伯糖诱导型启动子控制（Newman和Fuqua，1999）。
【数据】同源臂长度：800–1000 bp；限制酶：BamH1、XbaI；组装方法：Gibson assembly；表达调控：L-阿拉伯糖诱导型启动子
5.7 缺失菌株构建
染色体基因的框内缺失采用Graf和Altenbuchner（2011）建立的方案。简言之，电转化（Choi等，2006）缺失质粒后，筛选卡那霉素（Kan）抗性且对5-氟尿嘧啶（5-FU）敏感的克隆。将一个克隆在液体LB培养基中于30°C、180 rpm振摇培养24小时。随后在M9基本培养基平板上筛选5-FU抗性且Kan敏感的克隆，通过菌落PCR鉴定携带目标基因缺失的克隆。
【数据】培养温度：30°C；转速：180 rpm；时间：24 h；筛选标记：Kan抗性、5-FU敏感性
5.8 磷酸酶活性测定
磷酸酶活性通过监测对硝基苯基磷酸酯（pNPP）降解为对硝基苯酚（PNP）来测定。测定使用经无菌生长培养基洗涤一次的细胞或离心（7000×g，2 min）后收集的上清液进行。480 µL细胞或上清液补充20 µL 100 mM pNPP溶液（Sigma；终浓度4 mM），混合物在室温孵育1小时。随后加入50 µL 1 M NaOH溶液，室温孵育10分钟。离心（8000×g，2 min）后收集上清液，测定405 nm光密度（OD）。产生的PNP量使用0至100 µg·mL⁻¹纯化PNP（Sigma）的标准曲线确定。结果以每小时合成的PNP微克数表示，并以各培养物的OD600归一化。
【数据】底物：pNPP，终浓度4 mM；孵育：室温1 h；终止：1 M NaOH 50 µL，10 min；检测波长：405 nm；标准曲线：0–100 µg·mL⁻¹ PNP；离心：7000×g 2 min、8000×g 2 min
研究结果
2.1 稀土元素对恶臭假单胞菌KT2440的毒性
在低金属络合培养基中培养24小时后，通过计算IC50值进行剂量-反应生长抑制实验，以确定恶臭假单胞菌对16种REE的敏感性。结果显示，在此条件下轻稀土（La至Eu）比重稀土（Gd至Lu，不含Sc和Y）毒性更强，前者的IC50值范围为0.31 µM至0.69 µM，后者为0.96 µM至1.59 µM（表1和图S1）。离子半径与IC50值之间的Pearson相关系数为0.93，表明两参数间存在强关联。相比之下，Sc和Y不符合此趋势，IC50值分别为10.05 µM和0.61 µM，将离子半径与IC50的相关性降至0.77。由于测试培养基中REE暴露浓度可能随时间下降（Vignati等，2024），我们比较了代表性REE在MOPS培养基中刚添加后和孵育24 h后的有效浓度。测得浓度与标称值相当，且无论何种金属，孵育后均保持不变（图S2）。因此，各REE对恶臭假单胞菌的不同毒性不太可能源于其生物可利用性的非生物改变。为便于比较，还进行了Cd、Zn和Ni的生长抑制测试。毒性最高的是Cd，其次是Ni和Zn（表2和图S3）。这三种金属的IC50值比REE高约两到三个数量级，证实恶臭假单胞菌对REE的高度敏感性。
【数据】LREE IC50：0.31–0.69 µM；HREE IC50：0.96–1.59 µM；Sc IC50：10.05 µM；Y IC50：0.61 µM；Pearson相关系数：0.93（含Sc/Y后为0.77）；培养时间：24 h
2.2 赋予REE耐受性改善的适应性突变鉴定
为探索恶臭假单胞菌KT2440对REE的适应性反应，进行了NdCl₃浓度从25 nM递增至2 µM的系列传代培养（图1A），随后从终点耐受群体中分离单菌落。两个进化菌株EvoNd5和EvoNd6表现出对高金属浓度的稳定耐受，其IC50值分别比WT*菌株提高了10.7倍和7.7倍（图1B，图S4，表S1）。这两个菌株的全基因组测序显示，编码PhoX家族碱性磷酸酶的uxpB基因（PP_1043；图1C）存在单点突变（Putker等，2013）。EvoNd5和EvoNd6菌株的突变分别导致UxpB肽前导区中的G5S和G47S替换（图1C）。UxpB同一区域出现两个独立突变，提示该酶可能在REE适应性反应中充当关键介质。
【数据】NdCl₃浓度范围：25 nM–2 µM；EvoNd5 IC50提高：10.7倍；EvoNd6 IC50提高：7.7倍；突变位点：G5S（EvoNd5）、G47S（EvoNd6）
2.3 UxpB碱性磷酸酶对REE胁迫耐受的贡献
uxpB的缺失导致菌株无法在以甘油-1-磷酸为磷源的MOPS培养基上生长（图2A），表明该磷酸酶是利用此磷源所必需的。但这妨碍了在我们条件下评估uxpB基因缺失对REE毒性的影响。为克服此限制，将携带野生型uxpB基因的pJN105质粒（受L-阿拉伯糖诱导型araBAD启动子控制）转化至缺失菌株（ΔuxpB+uxpB菌株）。即使在无L-阿拉伯糖的情况下，该构建体也部分恢复了ΔuxpB菌株的生长（图2A）。在此条件下，滞后期和平台期最大OD600（OD600max）均高于携带空pJN105质粒的对照菌株（WT+EV）。当培养基补充0.0125% L-阿拉伯糖（轻微诱导araBAD启动子；McMackin等，2021）时，ΔuxpB+uxpB菌株的滞后期与对照菌株相当，而其生长速率和OD600max略高。在0.1% L-阿拉伯糖的强诱导下，滞后期进一步缩短，生长速率和OD600max与0.0125% L-阿拉伯糖条件下观察到的相似（图2A）。L-阿拉伯糖对对照菌株的生长无 detectable 影响（数据未显示）。随后在相同条件下通过测定IC50值评估Nd对各菌株的毒性。对照菌株（WT+EV）的Nd IC50为0.68 µM。在未诱导uxpB的情况下，ΔuxpB+uxpB菌株对Nd更敏感，IC50较对照降低2.5倍（0.27 µM）。当uxpB表达被诱导时，Nd耐受性增加，0.0125% L-阿拉伯糖存在时IC50值较对照高1.4倍（0.96 µM），0.1% L-阿拉伯糖存在时高4倍（2.70 µM）（图2B，图S5，表S1）。这些结果表明uxpB表达以剂量依赖方式赋予增强的Nd耐受性。碱性磷酸酶活性测定显示，对照WT*+EV细胞在4 mM对硝基苯基磷酸酯溶液中每小时每OD600单位约产生10 µg对硝基苯酚（PNP）。相应上清液中检测到约3.8 µg PNP·h⁻¹·OD600⁻¹的活性（图2C、2D）。对于未用L-阿拉伯糖诱导的ΔuxpB+uxpB菌株，细胞相关活性与对照菌株相当，而上清液活性降至0.7 µg PNP·h⁻¹·OD600⁻¹——下降了5.4倍（图2C、2D）。添加0.0125% L-阿拉伯糖后，细胞相关磷酸酶活性较对照增加2.8倍（28 µg PNP·h⁻¹·OD600⁻¹），而上清液活性达1.5 µg PNP·h⁻¹·OD600⁻¹，比对照菌株低2.5倍（图2C、2D）。当添加0.1% L-阿拉伯糖时，细胞相关活性进一步升至38 µg PNP·h⁻¹·OD600⁻¹（增加3.8倍），而上清液活性与0.0125%诱导条件下观察到的相似（图2C、2D）。从这些数据我们得出结论：UxpB主要与细胞相关，其表达水平与总磷酸酶活性相关。
【数据】WT+EV Nd IC50：0.68 µM；ΔuxpB+uxpB未诱导IC50：0.27 µM（降低2.5倍）；0.0125%阿拉伯糖IC50：0.96 µM（1.4倍）；0.1%阿拉伯糖IC50：2.70 µM（4倍）；细胞相关磷酸酶活性：WT约10 µg PNP·h⁻¹·OD600⁻¹，0.0125%诱导28 µg（2.8倍），0.1%诱导38 µg（3.8倍）；上清活性：WT* 3.8 µg，未诱导0.7 µg（降低5.4倍），0.0125%诱导1.5 µg（低2.5倍）
2.4 UxpB单点突变改变其定位和活性
EvoNd5和EvoNd6的细胞相关磷酸酶活性分别比WT菌株增加3.9倍和3倍（图3A）。在上清液中，两个进化菌株的碱性磷酸酶活性均比WT菌株高约8倍（图3B）。当以甘油-1-磷酸为唯一磷源生长时，进化菌株的滞后期缩短3小时，而生长速率和OD600max几乎不变（图3C）。因此，UxpB前导肽中的点突变似乎同时提高了细胞相关和上清相关碱性磷酸酶活性。
【数据】EvoNd5细胞相关活性增加：3.9倍；EvoNd6细胞相关活性增加：3倍；上清活性增加：约8倍（两菌株）；滞后期缩短：3 h
2.5 UxpB细胞定位不影响REE胁迫抗性
为确定这两种增加的活性中哪一种对进化菌株Nd耐受性改善有贡献，构建了Tat-1系统（即ΔtatC1）和T2SS（即ΔxcpRST）的敲除突变体。Tat-1系统介导UxpB从细胞质转运至周质，而T2SS参与其从周质输出至外膜（图S6A）。WT对照菌株与两个突变体在生长、Nd耐受性或细胞相关碱性磷酸酶活性方面几乎未观察到差异（图4A、B、C；图S6B，表S1）。WT和ΔtatC1菌株的上清液中检测到微量磷酸酶活性，而ΔxcpRST菌株上清液中未检测到活性（图4D）。进化菌株中T2SS的失活导致滞后期比WT*菌株缩短3小时，生长曲线与其各自的亲本菌株EvoNd5和EvoNd6相似（图4A和3D）。EvoNd5ΔxcpRST和EvoNd6ΔxcpRST菌株的IC50值
【数据】EvoNd5ΔxcpRST和EvoNd6ΔxcpRST滞后期缩短：3 h（原文此处截断，其余数据原文未详述）
2.6 无机磷酸盐对钕毒性的影响
【数据】原文未详述（该节原文内容在提供的节选中不完整）
讨论与解读
REE正日益在土壤和水生环境中积累，引发对植物、动物和人类的生态毒理学关注。然而，针对REE对细菌毒性的研究仍然稀缺。本研究考察了REE对恶臭假单胞菌KT2440的毒性——该土壤细菌此前被证明在以醇类为底物生长时利用轻稀土作为PQQ-ADH的辅因子。为研究REE毒性效应，菌株在以丁二酸盐（恶臭假单胞菌的偏好碳源）为碳源的条件下培养，其代谢不依赖这些金属。培养条件确保了高金属生物可利用性和REE效应的准确评估。培养基以MOPS缓冲（通常认为非络合试剂），以甘油-1-磷酸替代无机磷酸盐以避免金属沉淀同时满足细胞的磷营养需求。在此条件下，恶臭假单胞菌对REE表现出高敏感性，IC50在1 µM左右，比Zn、Ni乃至强毒物Cd的IC50低数个数量级。
本研究的核心发现是碱性磷酸酶UxpB在REE耐受中的新角色。两个独立进化菌株均在uxpB前导肽区获得点突变，增强了酶活性——细胞相关活性提高约3–4倍，上清相关活性提高约8倍。这提示前导肽突变可能影响UxpB的加工或分泌效率。有趣的是，Tat系统或T2SS的敲除并未消除进化菌株的耐受优势，暗示细胞相关磷酸酶活性的增加本身足以介导耐受。机制上，增强的磷酸酶活性促进有机磷化合物释放磷酸根，磷酸根与REE形成不溶性络合物，降低其生物可利用性。这一"磷酸酶介导的REE固定"机制代表了细菌应对REE胁迫的一种此前未知的策略。
无机磷酸盐对Nd毒性的影响（图5）进一步支持了磷酸根络合在缓解REE毒性中的核心作用，为理解该机制的环境相关性提供了定量框架。
编译者解读
本研究从适应性进化出发，以"表型-基因型-生化机制"为主线，清晰揭示了碱性磷酸酶UxpB在REE耐受中的功能。方法上，低络合培养基设计巧妙——用甘油-1-磷酸替代无机磷酸盐既满足磷需求又避免REE沉淀，使毒性评估更为精准。从合成生物学应用角度，uxpB前导肽突变增强酶活性的发现具有工程价值——这提示可通过信号肽改造来强化微生物的REE耐受与固定能力，在生物修复和REE回收场景中潜力可观。值得注意的是，该机制的特异性仍待深究：UxpB介导的磷酸盐释放是否对16种REE均有效？在复杂环境基质中该策略的实际效率如何？这些问题的解答将决定其工程化应用前景。
参考来源
Dupont, C. A. (2026). Phosphatase-mediated mitigation of rare earth element toxicity to Pseudomonas putida. Ecotoxicology and Environmental Safety. DOI: 10.1016/j.ecoenv.2026.120746
DOI: 10.1016/j.ecoenv.2026.120746