来源：Whole cell bioconversion of ornithine to putrescine using a hyper tolerant mutant of a genetically engineered Corynebacterium glutamicum（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
腐胺是聚酰胺工业的重要单体，传统化学合成路线面临环境压力，微生物合成因其可再生原料和绿色工艺受到关注。本研究以基因工程改造的谷氨酸棒杆菌PUT Xyl为出发菌株，通过EMS随机诱变获得高耐受突变株M6，其鸟氨酸脱羧酶活性提升1.8倍，speC基因表达上调2.5倍。以静息细胞为催化剂，在50 g/L鸟氨酸底物下10小时内积累腐胺27.05 g/L，摩尔产率达81%，三次循环使用后仍保持82%以上活性。该工作展示了耐受性工程在克服产物抑制中的关键作用，为腐胺的可持续生物制造提供了新平台。
研究背景
腐胺（1,4-二氨基丁烷）是化工行业尤其是聚酰胺工业的重要单体。传统上通过化学路线生产，但微生物生物合成因可再生原料和环境友好优势而备受关注。腐胺可通过鸟氨酸脱羧酶（ODC）途径使L-鸟氨酸脱羧，或通过精氨酸脱羧酶（ADC）途径由精氨酸转化而来。全细胞生物催化因省去昂贵的酶纯化步骤、通过调控代谢网络实现高效催化而具有广泛工业应用价值。在此类体内系统中，宿主选择、遗传稳定性、基因表达调控以及细胞耐受产物毒性的能力共同决定整体性能。谷氨酸棒杆菌虽广泛用于发酵生产，但其作为全细胞生物催化剂的应用仍未充分开发。本研究旨在通过EMS诱变提升工程菌株的腐胺耐受性，进而优化其全细胞催化效率。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
以谷氨酸棒杆菌PUT Xyl为诱变和生物转化的出发菌株。菌株在添加四环素（5 µg/mL）和卡那霉素（25 µg/mL）的BHI琼脂平板上维持，并以甘油储备液形式保存于–80°C。预培养时，挑取单菌落接种至BHI肉汤中，于30°C、180 rpm振荡培养至对数中期。除非另有说明，菌株在含40 g/L葡萄糖作为碳源的合成培养基（CGXII）中培养。所有培养均在250 mL摇瓶中进行，工作体积50 mL，30°C、180 rpm振荡培养。
【数据】菌株：C. glutamicum PUT Xyl；抗生素：四环素5 µg/mL + 卡那霉素25 µg/mL；温度：30°C；转速：180 rpm；碳源：40 g/L葡萄糖；培养基：BHI/CGXII；工作体积：50 mL（250 mL摇瓶）
2.2 谷氨酸棒杆菌PUT Xyl的腐胺耐受性
将对数中期培养物（OD600 ∼ 0.1）接种至含25、50和100 mM腐胺的BHI培养基中，监测48小时内的生长（OD600）。平板实验中，将系列稀释液（10⁻²至10⁻⁵）各取10 µL点样于含相应腐胺浓度的BHI琼脂上，30°C培养。接种后每12小时间隔通过菌落计数（CFU/mL）测定细胞活力。
【数据】接种OD600：∼0.1；腐胺浓度：25/50/100 mM；培养时间：48h；点样量：10 µL；稀释梯度：10⁻²至10⁻⁵；计数间隔：12h；温度：30°C
2.3 EMS诱变与耐受性筛选
将指数生长期的谷氨酸棒杆菌PUT Xyl培养物（OD600 ∼ 1.0）以5000 rpm离心10分钟收集，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，50 mM，pH 7.0）洗涤两次，重悬于新鲜BHI培养基中。使用乙基甲烷磺酸盐（EMS）按标准程序进行诱变。为评估EMS的致死效应，细胞分别用不同浓度（0.5、1.0、5.0、10和20 mg/mL）的EMS处理。培养物于30°C、120 rpm振荡培养至48小时。每6小时间隔取样（至48小时），加入6%（w/v）硫代硫酸钠孵育5分钟以淬灭EMS活性。处理后的细胞用PBS冲洗两次，系列稀释后涂布于BHI琼脂，30°C培养48小时。通过菌落计数评估细胞活力，以相对于未处理对照的百分比表示。
初筛聚焦腐胺耐受性。EMS处理后存活的菌落划线接种至添加高浓度（200 mM）腐胺的BHI琼脂平板，30°C培养48小时。在该BHI琼脂上表现出持续生长的分离株保留进行二次筛选。将腐胺耐受突变株在含40 g/L葡萄糖的CGXII极限培养基中于30°C、120 rpm振荡培养。每24小时取样，离心（Eppendorf，10,000 rpm，15分钟），通过HPLC分析胞外腐胺产量。为验证一致性，对最有潜力的突变株进行三次独立生产实验以确定腐胺产率。经验证的高产菌株以甘油储备液（20%，v/v）保存于–80°C长期储存。随后，在含20 g/L葡萄糖和20 g/L木糖的CGXII培养基中检验突变株是否保留亲本糖共利用特性。
【数据】诱变剂：EMS（Merck）；EMS浓度梯度：0.5/1.0/5.0/10/20 mg/mL；处理时间：48h（每6h取样）；淬灭剂：6%硫代硫酸钠；PBS：50 mM pH 7.0；离心：5000 rpm 10min；筛选浓度：200 mM腐胺；培养条件：30°C、120 rpm；HPLC取样间隔：24h；离心：10,000 rpm 15min；甘油储备液：20%（v/v）；糖共利用验证：20 g/L葡萄糖+20 g/L木糖
2.4 鸟氨酸脱羧酶（ODC）酶活测定
通过超声破碎细胞，粗细胞提取物按先前报道的方法分析ODC活性。总蛋白浓度通过Bradford法测定。ODC测定中，900 μL反应体系包含总蛋白（30–90 µg）、L-鸟氨酸（30 mM）、PLP（40 µM）、EDTA（1.5 mM，pH 7.0）、β-巯基乙醇（5 mM）和酚红（40 μM）。使用微孔板读数器在559 nm处检测鸟氨酸脱羧引起的吸光度变化。
【数据】底物：L-鸟氨酸 30 mM；辅因子：PLP 40 µM；EDTA：1.5 mM pH 7.0；β-巯基乙醇：5 mM；酚红：40 μM；总蛋白：30–90 µg；检测波长：559 nm；仪器：MULTISKAN Sky-high微孔板读数器
2.5 鸟氨酸脱羧酶的转录与蛋白水平分析
为阐明突变株M6全细胞生物转化增强的分子基础，对鸟氨酸脱羧酶进行了转录和蛋白水平分析。使用RNeasy Mini-kit从指数生长期的PUT Xyl M6和M10突变株细胞中提取总RNA。随后，RNA样品经DNase-I（无RNase）处理，按照Revert Aid First Strand cDNA Synthesis kit流程进行cDNA合成。以cDNA为模板，在QuantStudio™ 5实时PCR系统中使用针对目标基因设计的引物进行RT-qPCR。编码鸟氨酸脱羧酶的speC基因（扩增子大小：96 bp）使用引物对5′-CGCCAGTTGTGTCAGGAGAT−3′（正向）和5′-CACTGACGGGAAACTCTGCT−3′（反向）进行定量。管家基因gyrB（编码DNA旋转酶B亚基，扩增子大小：104 bp）作为内参用于归一化，引物为5′-CAAGGAATCCGTCCACACC−3′（正向）和5′-CGTAGCGGTTCATCAGGGA−3′（反向）。相对表达量以倍数变化（2^-ΔΔct）表示，>1视为上调，<1视为下调。
SDS-PAGE分析中，在生物转化期间收集催化细胞，使用探头超声仪（20 kHz）在冰浴条件下以10秒脉冲/10秒暂停循环、40%振幅超声破碎15分钟，离心去除细胞碎片。蛋白浓度以牛血清白蛋白为标准品通过Bradford法测定。上清液经SDS变性后，在12%聚丙烯酰胺凝胶上分离，考马斯亮蓝染色。使用蛋白标记物（245 kDa梯）估算分子量。
【数据】speC扩增子：96 bp；gyrB扩增子：104 bp；超声破碎：20 kHz、10s脉冲/10s暂停、40%振幅、15min、冰浴；SDS-PAGE：12%凝胶；蛋白标准：245 kDa梯；定量方法：2^-ΔΔct
2.6 PUT Xyl与突变株M6的对比全细胞生物转化实验
以性能最佳的突变株M6进行全细胞生物转化实验，并与亲本PUT Xyl菌株比较。细胞首先在CGXII极限培养基中培养至OD600 ∼ 10。随后离心收集细胞（8000 × g，10分钟，4°C），用无菌磷酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.0）洗涤两次，最终重悬于相同缓冲液中，加入1 mM IPTG诱导。通过向细胞悬液中添加终浓度为10 g/L的L-鸟氨酸启动生物转化反应。反应混合物（2 mL）于30°C、200 rpm恒温振荡。在设定时间点（0、6、12、18、24、30、36、42和48小时）取样，10,000 × g离心10分钟，取反应上清液用于鸟氨酸和腐胺的定量检测。
【数据】细胞浓度：OD600 ∼ 10；离心：8000 × g 10min 4°C；缓冲液：磷酸盐缓冲液 50 mM pH 7.0；诱导剂：IPTG 1 mM；底物：L-鸟氨酸 10 g/L；反应体积：2 mL；温度：30°C；转速：200 rpm；取样时间点：0–48h（每6h）；离心：10,000 × g 10min
2.7 生物催化反应优化与生物催化剂可重复使用性
采用单因素轮换法优化工艺参数，即固定其他条件不变，逐一改变单一变量。生物转化反应在L-鸟氨酸浓度1至100 g/L范围内进行以确定最佳底物负载。腐胺摩尔产率基于鸟氨酸脱羧酶催化的反应化学计量学，按L-鸟氨酸转化为腐胺的摩尔转化率计算。产率定义为产生的腐胺摩尔数与初始供给的L-鸟氨酸摩尔数之比。pH效应使用磷酸盐缓冲液（pH 4–9）测试。细胞干重通过重量法测定：将已知体积的培养液经预称重膜过滤器过滤，用蒸馏水洗涤，80°C干燥至恒重，计算g CDW/L。测试不同生物量负载以确定其对生物转化的影响。
【数据】底物浓度范围：1–100 g/L L-鸟氨酸；pH范围：4–9（磷酸盐缓冲液）；CDW测定：80°C干燥至恒重；优化方法：单因素轮换法（OFAT）
研究结果
3.1 谷氨酸棒杆菌PUT Xyl的腐胺耐受性
在递增浓度（25–100 mM）腐胺存在下评估谷氨酸棒杆菌PUT Xyl的生长，并与未处理对照比较。观察到明显的浓度依赖性生长抑制。无腐胺条件下，BHI肉汤中细胞保持高活力，36小时后达到2.2 × 10⁸ CFU/mL。相比之下，添加25 mM腐胺使细胞活力降至9 × 10⁷ CFU/mL，50 mM腐胺时进一步降至2.5 × 10⁷ CFU/mL。100 mM腐胺条件下，48小时后出现近乎完全的生长抑制，未检测到菌落形成（图1a–c）。
尽管谷氨酸棒杆菌作为工业平台生物被广泛使用，但其对腐胺的耐受性研究仍不充分。以往研究主要关注有机酸、芳香代谢物及其他终产物的抑制作用，对多胺毒性的关注相对较少。虽然谷氨酸棒杆菌能够耐受腐胺，但在高浓度腐胺（750 mM）和尸胺（300 mM）下观察到生长减缓。类似地，在钝齿棒杆菌、大肠杆菌和酿酒酵母中，胞外腐胺含量升高均导致生长减少。本工作使用的亲本菌株PUT Xyl对升高至100 mM的腐胺也表现出显著敏感性。
通过OD600监测的生长动力学与活力数据趋势一致（图1d）。对照培养物在36小时后达到最大OD600 1.74，而添加腐胺的培养物生物量积累逐渐减少。在25 mM和100 mM腐胺存在下，最终OD600值分别降至1.35和1.04。尽管高腐胺浓度下的初始生长抑制通过CFU计数得到确认，但后期时间点的OD600值在各条件下似乎相当。这可能反映了部分生理适应和/或不可存活或不分裂细胞的积累——OD测量无法区分活细胞与死细胞。这些结果表明腐胺耐受性是主要的生理瓶颈，这一限制需要以耐受为导向的菌株改良来实现谷氨酸棒杆菌PUT Xyl的稳健全细胞生物催化。
【数据】对照CFU：2.2 × 10⁸ CFU/mL（36h）；25 mM腐胺CFU：9 × 10⁷ CFU/mL；50 mM腐胺CFU：2.5 × 10⁷ CFU/mL；100 mM腐胺：48h无可见菌落；对照最大OD600：1.74（36h）；25 mM腐胺最终OD600：1.35；100 mM腐胺最终OD600：1.04
3.2 基于存活动力学的EMS诱变优化
在暴露于不同浓度EMS后，通过分析含200 mM腐胺的BHI琼脂平板上的细胞活力确定最佳EMS剂量，以观察腐胺胁迫下的存活情况。突变筛选中采用更高浓度（200 mM）腐胺施加严格选择压力，确保只有高度耐受的变体存活（图2a）。
如图2b所示，细胞活力呈浓度和时间依赖性下降。在低至1 mg/mL的EMS浓度下，处理24小时后仍有超过68%的细胞存活，表明致死性相对温和。5 mg/mL EMS处理24小时维持54%的细胞活力。但在更高EMS浓度（10和20 mg/mL）下，存活率快速下降，24小时后活力降至10%以下，48小时后完全丧失。基于这些观察，使用5 mg/mL EMS处理24–30小时可获得约1–10%的存活窗口。这些结果表明，过度EMS暴露严重损害细胞存活，最可能的原因是超出细胞修复能力的不可逆DNA损伤。相反，过于温和的EMS处理虽保留活力但限制了引入有益突变的概率。
约1–10%的中间存活范围是随机诱变研究中常用的目标，因为它反映了突变频率与群体可恢复性之间的平衡。本研究中，该存活窗口通过5 mg/mL EMS处理24–30小时实现，在保留可恢复群体用于下游筛选的同时提供了足够的突变压力。
【数据】EMS浓度：0.5–20 mg/mL；1 mg/mL EMS 24h存活率：>68%；5 mg/mL EMS 24h存活率：54%；10/20 mg/mL EMS 24h存活率：<10%；10/20 mg/mL EMS 48h：完全丧失；最佳诱变条件：5 mg/mL EMS、24–30h、存活率1–10%
3.3 EMS衍生腐胺耐受突变株的初筛
腐胺耐受性是诱变后的首要筛选标准。EMS处理并在含200 mM腐胺的BHI琼脂上筛选后，48小时培养共获得33个存活菌落（图3a）。
这表明存活细胞与谷氨酸棒杆菌PUT Xyl相比具有耐受升高腐胺浓度的能力。这些菌落的回收证明EMS诱变成功产生了腐胺耐受性方面的表型多样性。重要的是，相对有限的存活菌落数反映了筛选条件的严格性，确保只有强耐受变体被保留，同时最大限度地减少了假阳性的传播。
【数据】筛选浓度：200 mM腐胺；存活菌落数：33个；培养时间：48h
3.4 通过发酵筛选突变株的生物合成能力
二次筛选中，比较了耐受分离株（200 mM腐胺）在CGXII极限培养基中120小时的腐胺产量（图3b）。其中，突变株M6和M10的产量超过PUT Xyl菌株，而M29表现出降低的滴度。值得注意的是，菌株M6在96小时发酵后产生9.35 ± 0.24 g/L腐胺，而亲本谷氨酸棒杆菌PUT Xyl为6.71 ± 0.26 g/L（图3c）。这些选定的突变株经过多轮重复发酵实验验证结果。
【数据】M6产量：9.35 ± 0.24 g/L（96h）；PUT Xyl产量：6.71 ± 0.26 g/L（96h）；发酵时间：120h；培养基：CGXII极限培养基
3.5 EMS衍生突变株保留葡萄糖–木糖共利用能力
突变株M6在腐胺生成方面较PUT Xyl有显著提升。由于亲本菌株已被报道能高效共利用葡萄糖和木糖，在CGXII极限培养基中进行发酵实验以验证该工程性状在EMS诱变后是否保留。观察到M6能高效同时利用葡萄糖（20 g/L）和木糖（20 g/L），支持稳健的细胞生长，OD600达19，120小时后腐胺积累达9.5 ± 0.1 g/L，且糖完全利用。重要的是，如图3d的糖利用数据所示，葡萄糖和木糖的共代谢未因诱变过程而受损。
【数据】葡萄糖：20 g/L；木糖：20 g/L；OD600：19；腐胺产量：9.5 ± 0.1 g/L（120h）；糖利用：完全
3.6 性能提升的分子验证
发酵筛选表明突变株M6和M10较亲本PUT Xyl菌株腐胺积累增强。SDS-PAGE分析显示，在PUT Xyl、M6、M10和M29中，ODC酶预期分子量（∼72–75 kDa）处存在增强的蛋白条带，而作为对照的谷氨酸棒杆菌野生型（泳道2）中未观察到该条带（图4a）。
为检验所选突变株腐胺产量的提升是否与酶活性改变相关，定量了亲本菌株PUT Xyl和EMS衍生突变株的ODC活性。ODC活性测定显示，突变株M6的ODC活性较PUT Xyl增加188 ± 4.3%（1.8倍），M10显示147 ± 10%（1.48倍）的活性。腐胺产量较低的突变株M29仅保留亲本活性的32 ± 11%（图4b）。ODC催化L-鸟氨酸脱羧生成腐胺，被广泛认为是微生物多胺生物合成中的关键通量控制步骤。先前研究表明，ODC活性增加可显著提升腐胺生成，而活性降低则限制生产效率。我们还检测了PUT Xyl及突变株M6、M10和M29中鸟氨酸脱羧酶基因（speC）的表达。
【数据】ODC分子量：∼72–75 kDa；M6 ODC活性：188 ± 4.3%（1.8倍）；M10 ODC活性：147 ± 10%（1.48倍）；M29 ODC活性：32 ± 11%；SDS-PAGE：12%凝胶、考马斯亮蓝染色
讨论与解读
本研究通过随机诱变与生物转化优化的策略整合，成功开发了用于腐胺生产的稳健全细胞生物催化剂。结果凸显了耐受驱动型菌株改良在克服产物抑制——多胺生物加工中的主要瓶颈——方面的有效性。性能提升很可能由增强的酶表达与更广泛的细胞适应性共同驱动，而非单一遗传因素。该工作确立了谷氨酸棒杆菌PUT Xyl M6作为全细胞生物催化生产腐胺的可行平台，为将类似策略推广至其他工业相关生物转化提供了框架。作为全细胞催化剂，PUT Xyl M6高效转化L-鸟氨酸为腐胺，最高积累达27.05 ± 0.55 g/L。该系统还展示了操作稳健性，凸显其在重复批次生物转化过程中的实际应用价值。未来聚焦基因组水平表征、催化剂长期稳定化和过程强化的研究将进一步加强该系统的工业适用性。
【编译者解读】本研究以"耐受性工程"为核心策略，巧妙地将产物抑制这一常见瓶颈转化为筛选压力，通过EMS随机诱变获得性能显著提升的突变株。方法上采用静息细胞全细胞催化路线，规避了发酵过程中生长与产物积累的耦合限制，10小时内即达27 g/L产量，时空效率突出。值得注意的是，M6突变株的产量提升并非单一酶活增强所致，speC表达上调2.5倍与ODC活性1.8倍增幅的不完全对应暗示还存在其他适应性机制。局限在于随机诱变的遗传机制未完全解析，未来若能结合基因组重测序明确突变位点，将有助于理性设计下一代工业菌株。该策略对其它多胺类产物的生物制造具有直接借鉴意义。
参考来源
Sasikumar, K. Whole cell bioconversion of ornithine to putrescine using a hyper tolerant mutant of a genetically engineered Corynebacterium glutamicum. Biochemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.bej.2026.110279
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110279