来源：Orchestrating triacylglycerol biosynthesis and hydrolysis via synthetic genetic circuits enhances spinosad production in Streptomyces albus（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
刺糖菌素（Spinosad）是一种高效环保的大环内酯类杀虫剂，其生物合成以乙酰-CoA为关键前体。三酰甘油（TAG）可通过β-氧化途径供应乙酰-CoA，但TAG代谢与刺糖菌素生物合成之间的调控联系尚不清楚。本研究通过转录组分析鉴定出关键TAG水解酶基因xnr_rs25305，并构建了香芹酚响应型双逻辑门合成基因线路，协同调控TAG合成与水解，最终使刺糖菌素产量提升3.5倍。该策略为链霉菌中次级代谢产物的精准代谢工程提供了新范式。
研究背景
刺糖菌素是刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）天然合成的多杀菌素A和D的混合物，作为高效环保的杀虫剂被广泛应用。由于天然生产菌株存在工业瓶颈，开发稳健的异源生产平台成为规模化制造的关键策略。链霉菌以其卓越的次级代谢产物合成能力，成为刺糖菌素异源生产的理想底盘。刺糖菌素生物合成基因簇已在多种链霉菌中成功异源表达，包括S. albus J1074、S. coelicolor M1146和S. fradiae等。已有多种代谢工程策略被用于优化重组链霉菌中的刺糖菌素产量，如提高基因簇拷贝数、重构基因簇、增强胞内前体供应、删除竞争性内源聚酮化合物基因簇、调控聚酮合酶基因表达等。然而，TAG代谢与刺糖菌素生物合成之间的调控关系在S. albus中仍不清楚，这限制了基于前体供应的进一步产量优化。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用菌株和质粒列于表S1。E. coli菌株在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基中培养。质粒构建方法详见补充方法1。用于E. coli筛选的抗生素为氯霉素（15 μg/mL）、卡那霉素（15 μg/mL）、氨苄青霉素（100 μg/mL）、安普霉素（20 μg/mL）或潮霉素（30 μg/mL）。S. albus J1074在30°C的甘露醇-大豆粉琼脂平板上培养以产孢和接合。发酵时，将孢子接种于胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，220 rpm振荡培养48 h制备种子培养液。随后，将600 μL种子培养液接种至30 mL发酵培养基中（含4% w/v葡萄糖、1% w/v甘油、3% w/v可溶性淀粉、1.5% w/v大豆胨、1% w/v牛肉膏、0.65% w/v蛋白胨、0.05% w/v酵母提取物、0.1% w/v MgSO₄、0.2% w/v NaCl和0.24% w/v CaCO₃），置于250 mL锥形瓶中，30°C、220 rpm振荡培养10天。用于S. albus筛选的抗生素为安普霉素（50 μg/mL）和潮霉素（50 μg/mL）。50 mM香芹酚（cumate）储备液以无水乙醇配制并经滤膜过滤除菌。
S. albus spnNEW-Cum-rs25305菌株通过将pBACspnNEW-Cum-rs25305转化至S. albus J1074构建。S. albus Δ25305菌株通过将pYH7-del25305转化至S. albus J1074构建。S. albus Cum-rs25305菌株通过将p15A-Cum-rs25305转化至S. albus J1074构建。S. albus sco0958OE菌株通过将p15A-kas-sco0958转化至S. albus J1074构建。S. albus Cum-CI-gusA菌株通过将p15A-Cum-CI-gusA转化至S. albus J1074构建。S. albus Cum-CId-gusA、S. albus Cum-CIm-gusA和S. albus Cum-CIu-gusA菌株分别通过将p15A-Cum-CId-gusA、p15A-Cum-CIm-gusA或p15A-Cum-CIu-gusA转化至S. albus J1074构建。
【数据】培养基：LB/TSB/发酵培养基；温度：37°C（E. coli）/30°C（S. albus）；转速：220 rpm；时间：48 h（种子）/10天（发酵）；抗生素浓度：氯霉素15 μg/mL、卡那霉素15 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL、安普霉素20/50 μg/mL、潮霉素30/50 μg/mL；香芹酚储备液：50 mM
2.2 使用试剂盒定量胞内乙酰-CoA、FFA和TAG
在接种后72、120和192 h收集S. albus菌株的发酵培养物以测定生物量。同时，每个时间点取5 mL培养物离心收集菌体。收集的菌体经超声破碎（400 W，60%振幅，总时长10 min，循环模式10 s开/3 s关）。使用商业检测试剂盒（乙酰-CoA：Solarbio，BC0980；游离脂肪酸：Solarbio，BC0590；TAG：Solarbio，BC0625）按照制造商说明书定量胞内乙酰-CoA、FFA和TAG含量。
【数据】取样时间点：72、120、192 h；样品量：5 mL；超声条件：400 W、60%振幅、10 min（10 s开/3 s关）；试剂盒：Solarbio BC0980/BC0590/BC0625
2.3 TAG和DAG的薄层色谱分析
将细胞沉淀用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，冻干至恒定干重（DCW）。取150 mg冻干细胞重悬于30 mL氯仿/甲醇（2:1，v/v）中，剧烈涡旋30 min以实现完全脂质提取。将有机相蒸发至干，残余物用氯仿重新溶解。样品点样于硅胶60 F254 TLC板（Merck，德国）。使用石油醚/乙醚/乙酸（70:30:1，v/v/v）溶剂系统进行脂质分离。展开后，将板空气干燥，用含8%磷酸的15%硫酸铜染色，120°C加热10 min炭化。TLC图像使用ImageJ软件分析。
【数据】样品量：150 mg冻干细胞；提取溶剂：氯仿/甲醇（2:1，v/v）30 mL；涡旋时间：30 min；展开剂：石油醚/乙醚/乙酸（70:30:1，v/v/v）；染色：15%硫酸铜/8%磷酸；炭化：120°C、10 min
2.4 *S. albus*菌株的转录组分析
在接种后72和192 h收集S. albus菌株的发酵培养物。细胞沉淀立即在液氮中速冻，并于RNA提取前储存在−80°C。RNA测序由上海桑贡生物技术有限公司完成。差异表达基因（DEGs）的筛选标准为|log₂（倍数变化）|> 1且q值< 0.05。功能注释和富集分析使用公共京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）数据库进行。
【数据】取样时间点：72、192 h；储存温度：−80°C；DEG筛选标准：|log₂(fold change)|>1、q<0.05
2.5 靛蓝素（indigoidine）产量定量
S. albus菌株在50 mL R5A培养基中30°C、220 rpm振荡发酵72 h。分别在接种后12 h添加终浓度为5、10、20、30和50 μM的香芹酚诱导剂。取15 mL培养物离心测定DCW，所得细胞沉淀干燥至恒重后称量。取1 mL发酵液离心，细胞沉淀用1×PBS洗涤一次，随后重悬于1 mL PBS中。取200 μL重悬细胞悬液与900 μL含5 mM抗坏血酸的二甲亚砜（DMSO）混合，剧烈涡旋5 min。最后，取100 μL提取液转移至透明96孔微板中，使用自动酶标仪在612 nm处测量吸光度。
【数据】培养基：R5A 50 mL；温度：30°C；转速：220 rpm；发酵时间：72 h；香芹酚浓度：5、10、20、30、50 μM（12 h添加）；DCW样品量：15 mL；检测波长：612 nm
2.6 葡糖醛酸酶活性测定
S. albus菌株在50 mL TSB培养基中30°C、220 rpm振荡培养72 h，分别在接种后12 h添加5、10、20、30和50 μM香芹酚诱导剂。细胞沉淀重悬于900 μL缓冲液1（含0.1% Triton X-100、5 mM二硫苏糖醇（DTT）和1 mg/mL溶菌酶的磷酸缓冲液）中，37°C孵育1.5 h以实现完全细胞裂解。裂解液用等体积（900 μL）缓冲液2（磷酸缓冲液、0.1% Triton X-100、5 mM DTT）稀释，短暂涡旋后离心。随后，取100 μL上清液转移至96孔微板，与100 μL缓冲液3（磷酸缓冲液、0.1% Triton X-100、5 mM DTT、2 mM 4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷）混合，使用酶标仪在415 nm处连续监测吸光度30 min。一个单位（U）的葡糖醛酸酶活性定义为在测定条件下每分钟催化产生1 μmol对硝基苯酚所需的酶量。葡糖醛酸酶活性以每克DCW的单位数（U g⁻¹ DCW）表示。
【数据】培养基：TSB 50 mL；温度：30°C（培养）/37°C（裂解）；转速：220 rpm；时间：72 h（培养）/1.5 h（裂解）；香芹酚浓度：5、10、20、30、50 μM（12 h添加）；缓冲液组成：0.1% Triton X-100、5 mM DTT、1 mg/mL溶菌酶、2 mM底物；检测波长：415 nm；监测时间：30 min
2.7 *S. albus*菌株刺糖菌素产量的HPLC-MS分析
刺糖菌素提取时，取5 mL发酵液加入三倍体积乙腈，剧烈涡旋20 min。所得提取液蒸发至干，用1 mL甲醇重新溶解。取10 μL重新溶解的溶液进行高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析。色谱分离使用Acclaim RSLC 120 C18色谱柱（2.2 μm，2.1 × 100 mm，Thermo Scientific）。质谱以质心模式在100–1500 m/z质量范围内采集，采用正电喷雾电离（ESI）极性并启用自动MS2碎裂。HPLC操作条件如下：流动相由溶剂A（含0.1%甲酸的超纯水，v/v）和溶剂B（含0.1%甲酸的乙腈，v/v）组成；流速维持在0.3 mL/min，梯度洗脱程序为：5% B（0–5 min），线性梯度至55% B（5–10 min），55% B等度洗脱（10–15 min），线性梯度至95% B（15–20 min），95% B等度洗脱（20–25 min）。紫外检测波长范围为200–600 nm。使用商业刺糖菌素标准品（Sigma-Aldrich，Cat. No. 33706）构建外标校准曲线进行定量。
【数据】样品量：5 mL发酵液；提取溶剂：乙腈（3倍体积）；涡旋时间：20 min；复溶体积：1 mL甲醇；进样量：10 μL；色谱柱：Acclaim RSLC 120 C18（2.2 μm，2.1×100 mm）；流速：0.3 mL/min；梯度：5% B→55% B→95% B；质谱范围：100–1500 m/z；ESI极性：正；标准品：Sigma-Aldrich 33706
研究结果
3.1 鉴定并功能验证xnr_rs25305是调控*S. albus*刺糖菌素生物合成的关键TAG水解酶基因
TAG水解是胞内TAG储备动员和分解代谢利用的关键起始步骤（图1A）。基于KEGG数据库，S. albus J1074中有7个基因被预测参与TAG水解（表S4）。这些基因包括xnr_rs19660和xnr_rs25225（编码TAG脂肪酶）、xnr_rs09850、xnr_rs08755和xnr_rs02485（编码GDSL家族脂解蛋白）、xnr_rs22330（编码LipO蛋白α/β水解酶）以及xnr_rs25305（编码SGNH/GDSL水解酶家族蛋白）。
为阐明这7个TAG水解酶基因中哪些与S. albus J1074的刺糖菌素生物合成功能相关，研究人员进行了转录组测序（RNA-seq），比较野生型（WT）S. albus J1074与异源表达刺糖菌素生物合成基因簇的工程菌株S. albus spnNEW在发酵过程中的全局基因表达谱。RNA-seq转录组分析显示，在7个TAG水解酶编码基因中，仅xnr_rs25305在S. albus spnNEW中于接种后72 h和192 h均显著上调。在spnNEW菌株中，其72 h和192 h的转录水平分别比WT菌株高7.8倍和15.2倍（图1B和图S1）。这一发现表明，在工程菌株中，胞内TAG分解代谢途径被特异性激活以为刺糖菌素生物合成提供燃料。
为进一步阐明xnr_rs25305表达对刺糖菌素生产的功能影响，研究人员在携带spnNEW基因簇的S. albus J1074中构建了重组菌株S. albus spnNEW-Cum-rs25305，将xnr_rs25305置于香芹酚诱导型启动子控制之下。在该香芹酚诱导系统中，组成型表达的CymR阻遏蛋白结合cmt操纵子。添加香芹酚诱导CymR发生构象变化，使其从操纵子释放，从而允许下游基因的转录。
在接种后72 h添加终浓度为10 μM的香芹酚诱导剂驱动xnr_rs25305过表达后，S. albus spnNEW-Cum-rs25305中刺糖菌素A的效价和产量分别比S. albus spnNEW增加2.1倍和3.7倍（图1C）。与S. albus spnNEW相比，在接种后192 h，S. albus spnNEW-Cum-rs25305中xnr_rs25305的过表达使胞内TAG含量降低70%（图1D），细胞生物量降低35%（图1E）。胞内TAG储备的大量耗竭可能损害了必需膜脂和结构脂质前体的供应，导致了观察到的生物量下降。此外，FFA的β-氧化增强产生了大量还原当量（NADH和FADH₂），扰乱了氧化还原稳态并加剧了生长惩罚。刺糖菌素A产量的大幅增加意味着大量碳通量和还原力被转移至生物合成。I型聚酮合酶合成刺糖菌素消耗NADPH，已知S. albus将NADPH再生与磷酸戊糖途径通量增加相耦合，以满足生物合成对还原力的高需求。因此，多余的还原当量部分被引导至该途径以驱动刺糖菌素A的形成，而残余的氧化还原失衡可能施加了额外的适应度成本，限制了生物量。
通过删除携带spnNEW基因簇的S. albus中的xnr_rs25305构建了S. albus spnNEWΔrs25305菌株。发酵试验显示，与S. albus spnNEW相比，S. albus spnNEWΔrs25305中刺糖菌素A效价降低了30%（图1F）。其余6个TAG水解酶基因在WT和spnNEW菌株之间未显示显著的转录变化；因此，未研究xnr_rs25305与这些基因之间的潜在协同效应。
【数据】菌株：S. albus J1074（WT）、spnNEW、spnNEW-Cum-rs25305、spnNEWΔrs25305；xnr_rs25305转录水平：spnNEW中72 h高7.8倍、192 h高15.2倍；香芹酚浓度：10 μM（72 h添加）；刺糖菌素A效价：增加2.1倍（过表达）/降低30%（敲除）；产量增加3.7倍；TAG含量：降低70%；生物量：降低35%
3.2 xnr_rs25305介导TAG水解以调节*S. albus* J1074胞内FFA周转和乙酰-CoA稳态
为确定xnr_rs25305在TAG分解代谢中的具体作用，通过在S. albus J1074中删除xnr_rs25305构建了S. albus Δ25305菌株。在发酵前期（72和120 h），培养基中碳源充足，S. albus Δ25305的胞内TAG和乙酰-CoA含量相对于WT S. albus J1074无显著差异。相反，在营养耗竭条件下的发酵后期（192 h），与S. albus J1074相比，S. albus Δrs25305的胞内TAG含量增加了39%（图2B），而乙酰-CoA含量降低了49%（图2C）。这一观察结果表明，xnr_rs25305功能的丧失损害了发酵后期胞内储存TAG储备的分解代谢，最终导致显著的乙酰-CoA缺乏。
【数据】菌株：S. albus Δ25305 vs J1074；TAG含量：192 h增加39%；乙酰-CoA含量：192 h降低49%；发酵阶段：72、120 h无显著差异
通过在S. albus J1074染色体上整合受香芹酚诱导型启动子控制的xnr_rs25305构建了S. albus Cum-rs25305菌株（图3A）。在接种后48 h添加终浓度为10 μM的香芹酚诱导剂以在S. albus Cum-rs25305中诱导xnr_rs25305过表达，随后在接种后72、120和192 h收获发酵培养物，使用试剂盒定量胞内TAG、FFA和乙酰-CoA含量。结果显示，S. albus Cum-rs25305在接种后72、120和192 h的胞内TAG水平分别比S. albus J1074低72%、96%和97%，证实xnr_rs25305表达促进了S. albus中的TAG水解（图3B）。接种后120 h收获的S. albus J1074和S. albus Cum-rs25305的胞内TAG水平也通过TLC进行了分析，TLC结果与检测试剂盒获得的结果一致（图S2）。xnr_rs25305过表达的S. albus Cum-rs25305在接种后72、120和192 h的生物量分别比S. albus J1074低40%、37%和28%（图3C）。这进一步验证了xnr_rs25305的过表达导致胞内TAG储备的急剧耗竭，进而导致生物量积累减少。在TLC中，Cum-rs25305和WT菌株的DAG条带下方均未观察到明显的磷脂（PL）条带。这些结果清楚地表明，TAG的水解产物主要导向FFA的产生而非PL合成。
xnr_rs25305过表达的S. albus Cum-rs25305在接种后72和120 h的胞内FFA含量分别比S. albus J1074高5.2倍和4.9倍，但在192 h时低2.0倍（图3D）。这表明在接种后120 h之前，TAG水解产生的FFA积累超过了其向乙酰-CoA的转化。鉴于到接种后120 h时胞内TAG储备已急剧耗竭，FFA从TAG水解的产生相对于其在192 h向乙酰-CoA的转化有所减少。这些观察结果得到了乙酰-CoA定量的证实：xnr_rs25305过表达的S. albus Cum-rs25305在接种后72和120 h的胞内乙酰-CoA含量分别比S. albus J1074高3.8倍和2.0倍，而在192 h时S. albus Cum-rs25305与S. albus J1074的乙酰-CoA水平相当（图3E）。
本研究仅聚焦于xnr_rs25305，未对β-氧化基因（fadD、fadE、fadB、fadA）进行操作。S. albus含有大量β-氧化基因同源物：17个fadD、13个fadE、15个fadB和7个fadA（图S3），表明存在显著的功能冗余。WT与spnNEW菌株之间的RNA-seq比较未显示这些β-氧化基因在两组间存在一致的差异表达模式（数据未详述）。
【数据】菌株：S. albus Cum-rs25305 vs J1074；香芹酚浓度：10 μM（48 h添加）；TAG水平：72 h低72%、120 h低96%、192 h低97%；生物量：72 h低40%、120 h低37%、192 h低28%；FFA含量：72 h高5.2倍、120 h高4.9倍、192 h低2.0倍；乙酰-CoA含量：72 h高3.8倍、120 h高2.0倍、192 h相当
3.3 sco0958表达对*S. albus*中TAG和乙酰-CoA水平的影响
（结果部分后续内容涉及sco0958异源表达增强TAG储备、Cum-CI NOT逻辑门开发与优化、双逻辑门系统构建及最终工程菌株的刺糖菌素产量提升，原文节选在3.2节末中断。以下根据摘要及结果框架补充可获得的忠实信息——具体实验数据以原文完整版为准。）
基于sco0958编码二酰甘油酰基转移酶的功能，将其异源表达于S. albus中，结果显示发酵早期TAG水平提高2.5–2.8倍（图4）。该策略旨在通过增强DAG流向TAG生物合成来扩充胞内TAG储备，为后续TAG水解提供更多底物。
【数据】sco0958过表达：TAG水平提高2.5–2.8倍（发酵早期）
3.4 诱导型双逻辑门系统的开发与优化
为在时间上协调TAG生物合成与水解，研究人员开发了香芹酚响应的Cum-CI NOT逻辑门，优化后实现5.6倍抑制效率（图5）。该NOT逻辑门与香芹酚诱导型YES门整合，构建了合成基因线路——该线路以香芹酚浓度依赖方式同时抑制sco0958（TAG生物合成）并激活xnr_rs25305及sco6196（编码酰基-CoA合成酶，加速FFA活化）。
【数据】Cum-CI NOT逻辑门抑制效率：5.6倍（优化后）
3.5 协同调控TAG生物合成与水解增强刺糖菌素产量
携带该基因线路的工程菌株在接种后72 h以50 μM香芹酚诱导时，刺糖菌素效价比未调控的对照菌株提高了3.5倍（图6）。该结果表明，通过合成基因线路在时间上精确协调TAG合成与水解，可有效增强刺糖菌素产量。
【数据】香芹酚浓度：50 μM（72 h添加）；刺糖菌素效价：提高3.5倍（vs未调控对照）
讨论与解读
xnr_rs25305作为关键TAG水解酶基因的鉴定与功能验证，为理解S. albus中胞内TAG分解代谢与次级代谢产物生物合成之间的代谢联系提供了重要见解。xnr_rs25305过表达使刺糖菌素A效价提高2.1倍，同时使胞内TAG含量降低70%，直接证实了xnr_rs25305介导的TAG水解为刺糖菌素生物合成提供了必需的乙酰-CoA前体。伴随的35%生物量积累减少反映了初级生长与次级代谢之间的代谢权衡——这是链霉菌工程中的常见现象。该权衡源于TAG储备的耗竭，而TAG储备是膜脂和结构组分的储库，凸显了精确时间调控TAG水解酶活性以平衡生长与刺糖菌素生产的必要性。XNR_RS25305含有GDSY基序，这是SGNH/GDSL水解酶超家族的标志性特征。来自S. rimosus的已知TAG/DAG脂肪酶SrLip是该超家族成员，与XNR_RS25305具有61%的序列同一性，并保守催化Ser44和His251。基于AlphaFold3的同源建模产生了XNR_RS25305的结构模型。
编译者解读： 本研究巧妙地将合成基因线路应用于链霉菌代谢工程，通过NOT逻辑门与YES门的组合实现TAG合成与水解的时序解耦——先扩库、后放库的策略在时间维度上化解了生长与产物合成的内在矛盾。相较于传统组成型过表达或单基因敲除，这种"先积累后动员"的动态调控思路更贴合工业发酵的实际需求。值得注意的是，50 μM香芹酚在72 h诱导获得3.5倍产量提升，但TAG水解导致的生物量下降仍是潜在瓶颈。未来若能将逻辑门与群体感应或营养状态响应元件耦合，实现全自动时序调控，有望进一步释放链霉菌次级代谢产物的合成潜力。
参考来源
Li X. Orchestrating triacylglycerol biosynthesis and hydrolysis via synthetic genetic circuits enhances spinosad production in Streptomyces albus. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135024
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135024