来源：Engineering Pichia pastoris for methanol-driven efficient synthesis of plant meroterpenoid bakuchiol（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
补骨脂酚（BAK）是源自传统药用植物补骨脂的间苯二酚萜类化合物，因兼具类视黄醇的抗衰老功效且刺激性更低，成为护肤领域的热门替代成分。然而，植物提取法受限于原料供应与纯化成本，化学合成法则面临工艺复杂和环境负担。本研究以产对香豆酸（p-CA）的毕赤酵母底盘菌株为起点，通过异源表达BAK合酶、强化甲羟戊酸（MVA）途径以增加前体牻牛儿基焦磷酸（GPP）供应，并缓解甲醇诱导的氧化应激，最终在摇瓶水平达到180.68 mg/L、5-L生物反应器中实现2.31 g/L的补骨脂酚产量，创下微生物合成该化合物的最高纪录。
研究背景
补骨脂酚（BAK）是从传统药用植物补骨脂中分离的间苯二酚萜类化合物，具有抗癌、抗菌和抗氧化等多种生物活性。近年来，BAK作为护肤成分维A醇的替代品备受关注——它具备相近的抗衰老和皮肤修复功效，却较少引起光敏性、红斑和皮肤刺激等副作用。尽管商业价值巨大，当前BAK生产仍依赖植物提取或化学合成。植物提取受限于补骨脂的季节性供应和繁琐工艺，干燥种子中BAK的最高提取率仅18.8%（纯度>99.1%），且需多步色谱去除毒性香豆素类物质，进一步降低回收率并推高成本。化学合成则涉及复杂步骤、苛刻条件（如高温高压）和危险试剂。微生物细胞工厂因此成为一种颇具前景的替代路线。与仅依赖甲羟戊酸或MEP途径的典型萜类不同，BAK的生物合成需要苯丙烷途径与甲羟戊酸途径的协同通量——对香豆酸（p-CA）与牻牛儿基焦磷酸（GPP）作为两个关键前体缺一不可。这种双途径依赖性为代谢平衡与途径优化增添了额外复杂性。
研究方法
2.1 质粒构建
大肠杆菌TOP10菌株用于质粒繁殖与构建。所有异源基因（包括编码补骨脂酚合酶PcPT07、MmACL等）均针对毕赤酵母进行密码子优化，由北京擎科生物科技有限公司或GENEWIZ（中国苏州）合成。质粒构建时，目的DNA片段使用高保真KOD聚合酶（TOYOBO，上海，批号：5305002）扩增，并通过Gib-XKL Fast Seamless Cloning Kit（新开莱，广州，批号：XKL0613）[33]插入双酶切载体。重组菌落随后通过聚合酶链式反应（PCR）（ZOMANBIO，北京，批号：ZT213）和测序验证。以构建PcPT07基因组整合质粒为例：全长PcPT07序列用引物PcPT07-F/R扩增，插入双酶切的pSNI-10载体，获得pSNI-10-PcPT07。融合酶基因组整合质粒的构建中，ScERG20 WWG与截短PcPT07Δ85的编码序列通过编码柔性连接肽（GSG、GGGS或GGGGS）的合成DNA片段实现框内融合，所得融合基因克隆至pSNI-4载体，生成pSNI-4-GSG-Fusion、pSNI-4-GGGS-Fusion和pSNI-4-GGGGS-Fusion。质粒构建详细信息（含引物序列与基因来源）汇总于补充表S1-S6。
【数据】宿主菌：E. coli TOP10；聚合酶：KOD（TOYOBO）；克隆试剂盒：Gib-XKL Fast Seamless Cloning Kit（Xinkailai）；连接肽：GSG/GGGS/GGGGS；载体：pSNI-10、pSNI-4
2.2 毕赤酵母菌株构建
本研究所用底盘菌株与工程酵母菌株列于补充表S4。亲本底盘菌株CA15可产2.49 g/L p-CA [36]，由本实验室前期构建并保存，CA15基因型见表S4。在此基础上，通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑[3]对目标基因进行迭代整合或删除。各表达盒的详细整合位点及靶向sgRNA信息见补充表S2和S3。简言之，携带Cas9表达盒和sgRNA的质粒与供体DNA通过电转化法（BioRad，Micropulser，1 mol山梨醇，0.1 cm电击杯，2000 V，4–6 s）共转化至毕赤酵母感受态细胞。转化子在含200–250 μg/mL G418（遗传霉素）的酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基（YPD：10 g/L酵母提取物、20 g/L胰蛋白胨、20 g/L葡萄糖、20 g/L琼脂）或最低葡萄糖培养基（MD：13.4 g/L酵母氮碱、20 g/L葡萄糖、20 g/L琼脂）平板上筛选，30°C培养2–3天。以验证PcPT07整合为例：采用菌落PCR确认阳性菌株是否正确整合或删除。酵母细胞裂解液（细胞在裂解缓冲液（Takara Microbial Direct PCR Lysis Buffer，批号：Aof0248A）中80°C处理50 min制备）作为PCR鉴定模板。使用引物JD-I-10-F/R和PcPT07-F/R，其中JD-I-10-F/R设计为侧翼同源臂（整合位点上下游100–200 bp），以确保目标基因的精确基因组整合。确认的转化子随后在5 mL YPD培养基中过夜培养以丢失抗性标记，丢失抗性的菌株在无选择平板上进一步确认。无标记重组菌株随后用于发酵和BAK生产实验。
【数据】底盘菌株：CA15（p-CA产量2.49 g/L）；电转化：2000 V，4–6 s，1 mol山梨醇；筛选：200–250 μg/mL G418；培养：YPD/MD培养基，30°C，2–3天；裂解：80°C，50 min
2.3 毕赤酵母摇瓶培养与胞内ROS测定
摇瓶发酵时，确认的重组菌株先在含10 mL BMGY（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、13.4 g/L酵母氮碱、10 g/L甘油、10% PBS，pH = 6.0）的50 mL锥形瓶中于30°C、250 rpm振荡过夜预培养。随后以初始OD600为1.0接种至含25 mL BMMY（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、13.4 g/L酵母氮碱、1.5%甲醇、10% PBS，pH = 6.0）的250 mL锥形瓶中，30°C、250 rpm培养3–5天，每24小时添加1%或1.5%（v/v）甲醇，确保菌株在以甲醇为唯一碳源的条件下生长代谢。胞内ROS水平测定采用活性氧（ROS）检测试剂盒（DCFH-DA荧光法，R42218-100 T，源叶生物科技有限公司（上海）），以H2O2为标准品。培养细胞收获后调整OD600至1.0，1200 rpm离心弃上清。细胞沉淀按说明书与DCFH-DA探针重悬孵育。洗涤后在激发波长488 nm、发射波长525 nm处测量荧光强度。胞内ROS水平基于H2O2标准曲线计算，以μM·OD⁻¹表示。
【数据】预培养：BMGY，10 mL/50 mL瓶，30°C，250 rpm，过夜；主培养：BMMY，25 mL/250 mL瓶，初始OD600=1.0，30°C，250 rpm，3–5天；甲醇添加：每24 h补加1%或1.5%（v/v）；ROS检测：DCFH-DA探针，激发488 nm/发射525 nm
2.4 产物与代谢物提取分析
p-CA定量时，取1 mL发酵液12,000 rpm离心2 min，上清经0.22 μm针头滤器过滤后在308 nm波长下HPLC分析。BAK提取与分析时，同一样品的细胞沉淀用0.5 mL饱和NaCl重悬，加入1.0 g硅胶研磨珠（Biospec，Cat. No. 11079101z），在低温珠磨仪（JXFSTPRP-CLN，上海净信实业发展有限公司）中4°C破碎两个循环：每次120 s、65 Hz。随后加入0.5 mL乙酸乙酯振荡15 min提取BAK，12,000 rpm离心2 min，乙酸乙酯层在真空浓缩仪（Eppendorf AG，5305XG308260，德国）中浓缩至约20 μL [20]。最后加入200 μL无水乙醇，经0.22 μm针头滤器过滤后在246 nm波长下HPLC分析。HPLC分析在Shimadzu Essentia SPD-16系统上进行，配备C18色谱柱（Phenomenex，Synergi™ 4 μm Hydro-RP 80 Å，250 × 4.6 mm，No. 00G-4375-E0），柱温25°C。BAK检测流动相为0.1%（v/v）甲酸水溶液与甲醇，比例15:85（v/v）[30]，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。p-CA检测使用相同流动相组成，流速0.5 mL/min，进样量2 μL。BAK通过超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）鉴定。液相条件：C18色谱柱（250 × 4.6 mm），流动相为（A）0.1%（v/v）甲酸水溶液和（B）甲醇，梯度洗脱程序：0–25 min，100% B；25–30 min，100% B；30–35 min，10% B。质谱条件：负离子模式，干燥气：5 mL/min，干燥温度：180°C，质量范围：70–1500 m/z。残留甲醇检测时，取1 mL发酵液12,000 rpm离心2 min，上清经0.22 μm针头滤器过滤后用RID示差折光检测器分析（Shimadzu Essentia RID-20系统，配备carbomix H-NP 18:8%色谱柱（Sepax technologies，7.8 × 300 mm，10 μm Non-Porous，PN：261008–7830）），柱温55°C。流动相为5 mM稀硫酸水溶液，流速0.6 mL/min，进样量10 μL。比甲醇消耗速率（q甲醇）按下式计算[16]：q甲醇（mmol/g DCW/h）= (nt0 − nt1) / (X × (t1 − t0))，其中nt0和nt1分别为t0和t1采样时间点的甲醇摩尔量（mmol），X为相应时间间隔内发酵液中的生物量浓度（通常以干细胞重DCW表示，单位g），t1−t0为两个连续采样时间点之间的时间间隔。
【数据】p-CA检测：HPLC 308 nm，流速0.5 mL/min，进样2 μL；BAK提取：饱和NaCl 0.5 mL + 硅胶珠1.0 g，4°C珠磨2×120 s（65 Hz），乙酸乙酯0.5 mL振荡15 min；BAK检测：HPLC 246 nm，流速1.0 mL/min，进样10 μL；色谱柱：C18（250 × 4.6 mm），25°C；流动相：0.1%甲酸水:甲醇=15:85；甲醇检测：RID，55°C，5 mM H2SO4，流速0.6 mL/min，进样10 μL
2.5 补料分批发酵
挑取单菌落接种至含10 mL YPD培养基的50 mL摇瓶中，30°C、250 rpm培养24 h。随后……
（原文此处节选中断，后续发酵参数原文未详述）
【数据】预培养：YPD 10 mL/50 mL瓶，30°C，250 rpm，24 h；后续参数：原文未详述
研究结果
3.1 BAK生产平台菌株的构建与评价
Zheng等人近期研究表明，补骨脂酚（BAK）可在酿酒酵母中通过牻牛儿基焦磷酸（GPP）与对香豆酸（p-CA）缩合合成，该反应由来自补骨脂的补骨脂酚合酶（PcPT07）催化[40]。在毕赤酵母中，GPP通过内源甲羟戊酸（MVA）途径天然产生，而p-CA因缺乏关键生物合成酶而无法合成。为供给该前体，本研究使用前期构建的p-CA高产菌株CA15作为起始底盘。简言之，CA15通过引入两条异源p-CA生物合成途径（酪氨酸途径和苯丙氨酸途径）并系统重构中心碳代谢而构建，p-CA产量达2.49 g/L（CA15基因型见补充材料表S4）[36]。高浓度p-CA为高效BAK合成提供了充足前体，消除了该生产途径中的潜在瓶颈。来自补骨脂的两种BAK合酶版本——全长PcPT07和叶绿体定位信号肽截短变体PcPTΔ85——被整合至CA15基因组以启动BAK生产，分别生成菌株BAK01和BAK02（图1A）。HPLC和UPLC-MS分析确认两种菌株均成功合成BAK，且BAK合酶的引入对细胞生长无显著影响（图1B、C；补充图S1）。工程菌株BAK02的胞内BAK产量为2.74 mg/L，比BAK01（1.43 mg/L）高92%（图1D）。这可能是因为植物来源蛋白PcPT07的叶绿体定位信号肽在植物中主要负责引导蛋白靶向叶绿体，但在毕赤酵母异源表达系统中，该信号肽可能干扰蛋白可溶性表达或导致蛋白错误定位。因此，截短其N端定位信号肽显著提高了蛋白在毕赤酵母中的可溶性表达，从而促进BAK合成。值得注意的是，最终提取的BAK样品中未检测到甲醇（补充图S2）。培养上清中未检测到BAK，这与之前在酿酒酵母中的观察结果一致[40]。为考察CA15中高水平p-CA合成（2.49 g/L）是否与内源GPP生物合成产生碳通量竞争，本研究设计了两种p-CA产量较低的毕赤酵母底盘菌株——GF菌株（p-CA产量0.25 g/L）和SF菌株（p-CA产量0.37 g/L）（补充表S4和图S3）。这些菌株用于表达PcPTΔ85以生成BAK工程菌株GFB和SFB（补充表S4）。发酵分析显示，与BAK02相比，这两种菌株的BAK产量显著降低，表明高浓度p-CA供给并未与GPP生物合成途径严重竞争碳通量，因此未限制GPP的可利用性。此外，耐甲醇工程菌株S12比野生型GS115衍生菌株表现出更优的BAK生产能力，进一步证明了使用CA15（高效p-CA生产底盘菌株S12）作为BAK合成底盘的优势（补充图S3）。然而，BAK02培养物中残留的2.43 g/L p-CA进一步证实p-CA相对于GPP是过量供给的（图1D）。因此，提高胞内GPP可利用性是改善BAK生物合成的关键瓶颈。
【数据】BAK02胞内BAK产量：2.74 mg/L；BAK01：1.43 mg/L（提高92%）；CA15 p-CA产量：2.49 g/L；GF菌株p-CA：0.25 g/L；SF菌株p-CA：0.37 g/L；BAK02残留p-CA：2.43 g/L；上清中BAK：未检出；甲醇残留：未检出
3.2 通过强化MVA途径增加GPP前体供给
为在平台菌株BAK02中进一步提高BAK产量，本研究尝试通过分步代谢工程强化MVA途径来增加GPP可利用性。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）和异戊烯基焦磷酸异构酶（IDI）被认为是MVA途径中的关键限速酶。IDI在平衡异戊烯基焦磷酸（IPP）与二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）比例方面发挥关键作用，从而缓解DMAPP相关的细胞毒性（图2A）[38,39]。本研究因此在BAK02中过表达HMGR（PAS_chr2-2_0230）和IDI（PAS_chr1-4_0429），生成菌株BAK03，BAK产量达4.02 mg/L（图2B）。为确保BAK合成有充足的碳供给，研究优化了菌株的甲醇补加策略，检测了0–120 h发酵过程中BAK和p-CA积累、生长动态及比甲醇消耗速率（q甲醇）的变化（补充图S4）。时间过程数据分析显示，BAK最大积累出现在48–60 h窗口内。在测试条件中，1.5%初始甲醇浓度既支持最佳细胞生长，也获得最高BAK产量（5.58 mg/L），伴随相对较高的q甲醇（图2B）。这些结果表明，1.5%条件下BAK产量提高主要归因于细胞对甲醇的高效同化。值得注意的是，所有实验组的BAK产量在60 h后均趋于平台期，暗示发酵后期存在潜在瓶颈约束，如前体限制或产物反馈抑制。综合动力学特征，1.5%甲醇浓度被确定为平衡细胞生长与异源BAK生物合成的最佳补加浓度。接下来，研究在BAK03中过表达另一个关键酶——甲羟戊酸激酶（ERG12，PAS_chr1-3_0187），生成菌株BAK04。然而，该修饰并未进一步提高BAK产量。这一结果表明，过表达ERG12的益处可能被BAK合成的下游瓶颈所掩盖。为验证这一可能性，研究在BAK04中引入额外拷贝的PcPTΔ85，生成菌株BAK05，BAK产量提高至9.1 mg/L（图2C）。在MVA途径中，法尼基焦磷酸合酶（ERG20）是一种双功能酶，既催化IPP生成GPP，又催化IPP与GPP缩合产生法尼基焦磷酸（FPP）。后一反应消耗GPP并将碳通量从BAK生物合成中分流。Bernard等人报道了一种工程化酿酒酵母ERG20变体（ScERG20 WWG（K197G、F96W、N127W），具体突变位点信息见补充表S4），该变体优先合成GPP而非FPP[2]。此外，前期研究表明，原养型毕赤酵母菌株（His⁺）可表现出改善的代谢物产量[4]。基于这些发现，研究将ScERG20 WWG引入BAK05并恢复His4原养型，生成菌株BAK06。该菌株生长提高35%，BAK产量达26.0 mg/L（图2C；补充图S5）。这凸显了增强GPP供给库和改善菌株生长对BAK合成的重要性；因此，系统改造GPP合成途径是必要的。前期工作已证明，大肠杆菌乙酰乙酰辅酶A硫解酶（EcAtoB）比天然酵母乙酰乙酰辅酶A硫解酶（ERG10）具有更高活性[1]。研究因此在BAK06中异源表达EcAtoB，同时过表达羟甲基戊二酰辅酶A合酶（HMGS，PAS_chr2-1_0191），生成菌株BAK08，BAK产量进一步提升至44.7 mg/L（图2C）。在BAK08中进一步过表达其他MVA途径酶，包括磷酸甲羟戊酸激酶（ERG8，PAS_chr2-2_0318）和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶（ERG19，PAS_chr1-4_0003），BAK10的产量仅小幅增加（46.7 mg/L）。相比之下，过表达酵母天然ERG10（PAS_chr1-4_0304）……
（原文此处节选中断）
【数据】BAK03产量：4.02 mg/L；1.5%甲醇条件BAK产量：5.58 mg/L；BAK05产量：9.1 mg/L；BAK06产量：26.0 mg/L（生长提高35%）；BAK08产量：44.7 mg/L；BAK10产量：46.7 mg/L
3.3 通过乙酰-CoA供给与双酶底物通道增强BAK积累
（原文此节内容未完整提供，以下为已提供部分的忠实翻译）
甲醇代谢合成乙酰-CoA。ICIT，异柠檬酸；α-KG，2-酮戊二酸；GPP，牻牛儿基焦磷酸；p-CA，对香豆酸；DAHP，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸；Phe，苯丙氨酸……
（原文此节内容不完整，后续数据未提供）
【数据】原文此节未完整提供
3.4 通过抗氧化策略增强BAK积累
甲醇补加诱导的BAK在放大发酵（15-L生物反应器，5 L工作体积）中的不稳定性。胞外H₂O₂对BAK的影响。抗氧化剂BHT促进BAK积累。过氧化氢酶过表达……
（原文此节内容不完整，后续数据未提供）
【数据】反应器：15-L生物反应器（5 L工作体积）；其余原文未详述
3.5 菌株BAK18和BAK20的高密度补料分批发酵（5-L生物反应器，2 L工作体积）
（A）BAK18高密度发酵的详细趋势；（B）BAK20第一轮高密度发酵的详细趋势；（C）BAK20第二轮高密度发酵。……
（原文此节内容不完整，后续数据未提供）
【数据】反应器：5-L生物反应器（2 L工作体积）；原文未详述
讨论与解读
萜类化合物是由异戊二烯（C5）单元衍生而来的最大类天然产物之一，在制药、食品、化妆品和生物基产业中具有广泛用途。然而，其植物来源生产受限于低丰度、资源约束和低效提取，化学合成则受制于较差的立体选择性和环境负担。微生物细胞工厂因此为可规模化的萜类生物合成提供了可持续替代方案。与仅由甲羟戊酸或MEP途径衍生的典型萜类不同，补骨脂酚（BAK）的生物合成需要苯丙烷途径与甲羟戊酸途径之间的协调通量——对香豆酸和牻牛儿基焦磷酸（GPP）是关键前体。这种双途径依赖性在代谢平衡和途径优化中引入了额外复杂性。本研究设计了以甲醇为驱动力的毕赤酵母BAK生物合成平台。从高p-CA生产底盘出发，系统增强前体供给、优化代谢通量分布、提高途径效率；同时，研究识别出甲醇诱导的氧化应激是BAK稳定性的主要限制因素，并通过胞内解毒与过程级抗氧化控制的组合策略加以解决。这些策略使BAK在摇瓶中达到180.68 mg/L、在5-L补料分批发酵中达到2.31 g/L的产量。
编译者解读
这项工作的亮点在于将"双前体平衡"这一代谢工程经典难题放入了甲醇营养型毕赤酵母的背景下求解——p-CA过量而GPP不足的诊断清晰，后续每一步改造（截短信号肽、MVA途径强化、ERG20变体、抗氧化策略）都有明确的代谢依据，逻辑链条完整。2.31 g/L的补骨脂酚产量在植物源间苯二酚萜类的微生物合成中具有里程碑意义。从合成生物学应用角度看，甲醇作为廉价碳源与诱导剂的结合为工业化放大提供了成本优势；但胞内产物积累模式意味着产物提取需要细胞破碎步骤，下游工艺的经济性仍需评估。此外，氧化应激问题的发现提示，非常规酵母中甲醇代谢的活性氧副反应可能成为高密度发酵的共性瓶颈，该策略对其他甲醇驱动的萜类合成具有参考价值。
参考来源
Liu Yang, et al. Engineering Pichia pastoris for methanol-driven efficient synthesis of plant meroterpenoid bakuchiol. Chemical Engineering Journal, 2026.
DOI: 10.1016/j.cej.2026.181402
DOI: 10.1016/j.cej.2026.181402