来源：Genome-scale overexpression screening identifies product tolerance and efflux transport as key determinants of high-level L-tryptophan production in Escherichia coli（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-色氨酸是食品、饲料和制药行业广泛使用的高价值芳香族氨基酸，但微生物大规模生产长期受制于前体供应不足和菌株对高浓度产物的耐受性差。本研究通过模块化代谢工程强化莽草酸、丝氨酸和谷氨酰胺等关键前体供应，获得效价提升34.6%的菌株TRPJ-13；继而构建靛蓝报告系统耦合基因组规模过表达文库筛选，鉴定出soxS和yicL两个关键靶点——前者通过上调lpxC增强脂多糖合成以加固膜完整性，后者被证实为参与L-色氨酸外排的新型跨膜蛋白。最终工程菌株TRPJ-28在5-L生物反应器中产L-色氨酸74.3 g/L，在1000-L中试规模达到70.4 g/L。
研究背景
L-色氨酸是人类和动物必需的芳香族氨基酸，在制药、食品和饲料行业应用广泛，具有显著经济价值。随着其医药和食品相关应用被日益认可，市场需求持续增长，迫切需要能够高效工业化生产L-色氨酸的微生物细胞工厂。然而，L-色氨酸生物合成受复杂代谢调控网络制约，高产菌株构建面临多重挑战：一是生物合成途径中关键限速酶受严格的反馈抑制——邻氨基苯甲酸合酶被L-色氨酸反馈抑制，DAHP合酶被芳香族氨基酸反馈抑制；二是L-色氨酸生物合成受trpR介导的转录抑制和trpL介导的转录衰减等多层调控限制；三是其生物合成依赖PEP、E4P、丝氨酸和谷氨酰胺等多种前体，细胞生长与产物合成之间存在碳源和能量竞争。
研究方法
2.1 菌株与引物
本研究所用菌株、质粒及引物列于附表S1和S3。以实验室前期构建并保存的大肠杆菌菌株TRPJ-0作为L-色氨酸生产宿主菌株，以E. coli DH5α作为质粒构建的克隆宿主。采用CRISPR-Cas9系统对工程大肠杆菌基因组进行高效操作。DNA操作所用大肠杆菌培养采用LB培养基。根据需要添加氨苄青霉素（100 mg/L）、卡那霉素（50 mg/L）或壮观霉素（30 mg/L）。
【数据】氨苄青霉素：100 mg/L；卡那霉素：50 mg/L；壮观霉素：30 mg/L
2.2 细胞活力测定
为评估不同浓度L-色氨酸的细胞毒性，从生物反应器中收集细胞，4°C下5000 rpm离心5 min。收获细胞用PBS洗涤两次，重悬至OD600为0.2–0.4。随后向每份样品加入3 μL碘化丙啶（PI），4°C避光孵育20 min。使用流式细胞仪PE-Cy5-A红色通道（695/40 nm检测滤光片）检测死细胞。数据用FlowJo软件（v10.8.1）分析。
【数据】离心：5000 rpm，5 min，4°C；OD600：0.2–0.4；PI用量：3 μL；孵育：4°C，20 min，避光；检测通道：PE-Cy5-A，695/40 nm
2.3 ASKA质粒文库制备
ASKA文库包含4,123株大肠杆菌菌株，每株携带一个含有单一ORF的pCA24N过表达质粒（Kitagawa et al., 2005）。将全部4,123株菌分别过夜培养，然后取等体积培养物混合。从混合培养物中提取质粒，作为后续转化的ASKA质粒文库。
【数据】ASKA文库菌株数：4,123；质粒载体：pCA24N
2.4 基因组规模文库筛选
基因组规模文库筛选流程如图1B所示。首先将菌株TRPJ在LB培养基中培养至OD600达到0.8。随后将细胞在冰上孵育20 min，用10%甘油洗涤两次，最终重悬于600 μL 10%甘油中制备感受态细胞。随后，将100 μL感受态TRPJ细胞与600 ng ASKA质粒文库混合，转入预冷的电转杯中。使用电转仪（Bio-Rad，美国）在2.0 kV条件下进行电转化。电转后立即向转化细胞中加入1 mL无抗生素LB培养基，37°C、200 rpm复苏1 h。将转化细胞涂布于含氯霉素的平板上获得单菌落，挑取单菌落于96孔板中进行发酵。发酵结束后，向每孔加入1 mL二甲基亚砜（DMSO）以充分溶解发酵过程中产生的靛蓝。96孔板离心后收集上清进行分析。使用酶标仪测定上清在620 nm处的吸光度（OD620）来表征靛蓝信号。基于靛蓝信号与L-色氨酸产量之间的线性相关性，以OD620评估不同菌株的L-色氨酸生物合成能力。
【数据】培养至OD600：0.8；冰浴：20 min；感受态细胞重悬体积：600 μL 10%甘油；电转化体系：100 μL感受态细胞 + 600 ng质粒文库；电转电压：2.0 kV；复苏：37°C，200 rpm，1 h；DMSO用量：1 mL/孔；检测波长：620 nm
2.5 外膜通透性评估
外膜通透性采用1-N-苯基萘胺（NPN）摄取实验评估。从生物反应器中收集细胞，4°C下5000 rpm离心5 min，PBS洗涤两次，重悬至OD600为1.0。随后加入NPN至终浓度40 μM，室温孵育10 min。使用酶标仪在96孔黑色板中测定荧光，激发波长和发射波长分别设为350 nm和450 nm。为消除背景干扰，从所有读数中减去含NPN但不含细胞的PBS的荧光强度。比较分析时，将对照菌株TRPJ-13的荧光强度归一化为1.0，计算各工程菌株的相对荧光强度。
【数据】离心：5000 rpm，5 min，4°C；OD600：1.0；NPN终浓度：40 μM；孵育：室温，10 min；激发/发射波长：350/450 nm
2.6 肽摄取与氨基酸外排实验
为测定肽摄取和氨基酸外排，将E. coli MG1655、yicL敲除菌株和yicL过表达菌株接种于摇瓶种子培养基，36°C、220 rpm培养6–8 h。细胞经5000 rpm离心10 min收集，重悬于添加6 mM Ala-Trp二肽的种子培养基中，初始OD660为10。细胞继续在36°C、220 rpm条件下孵育，每20 min取样一次。胞内和胞外L-色氨酸浓度通过HPLC定量。
【数据】培养：36°C，220 rpm，6–8 h；离心：5000 rpm，10 min；Ala-Trp浓度：6 mM；初始OD660：10；取样间隔：20 min
2.7 培养基配方
LB培养基（5.0 g/L酵母提取物、10.0 g/L胰蛋白胨、10.0 g/L NaCl）用于大肠杆菌培养。固体发酵培养基（10.0 g/L胰蛋白胨、5.0 g/L酵母提取物、5.0 g/L NaCl、0.5 g/L MgSO₄、10.0 g/L牛肉膏、1.0 g/L KH₂PO₄、18.0 g/L琼脂、20.0 mg/L维生素B1）用于发酵菌株培养。种子培养基（24.0 g/L K₂HPO₄、9.6 g/L KH₂PO₄、15.0 g/L酵母提取物、5.0 g/L (NH₄)₂SO₄、1.0 g/L MgSO₄、30.0 g/L葡萄糖）用于菌株活化。发酵培养基（7.5 g/L葡萄糖、3.0 g/L酵母提取物、1.6 g/L (NH₄)₂SO₄、2.0 g/L柠檬酸、5.6 g/L KH₂PO₄、2.0 g/L MgSO₄、75.6 mg/L FeSO₄·7H₂O、4.0 mg/L CoCl₂·6H₂O、0.6 mg/L CuSO₄·5H₂O、6.4 mg/L ZnSO₄·7H₂O、20.0 mg/L Na₂SO₄、4.5 mg/L MnSO₄·H₂O）用于L-色氨酸生产。所有培养基在121°C灭菌15 min。
【数据】LB培养基：5.0 g/L酵母提取物、10.0 g/L胰蛋白胨、10.0 g/L NaCl；灭菌：121°C，15 min
2.8 5-L生物反应器补料分批发酵
5-L生物反应器补料分批发酵流程如下：首先将单菌落接种于斜面培养基，36°C培养14–16 h。随后用10 mL无菌生理盐水洗下菌苔并充分混匀。取1 mL菌悬液接种于含50 mL种子培养基的500 mL摇瓶中，在旋转摇床中36°C、200 rpm培养6–8 h。当OD660达到4.0–6.0时，视为菌株活化完成。随后将200 mL种子培养液接种至含2.0 L发酵培养基的5-L生物反应器（T&J Bioengineering，上海，中国）中。通过添加NH₄OH维持发酵pH为7.0，温度恒定为36°C。为维持溶解氧（DO）水平在40%，搅拌速度从400 rpm逐步提高至1000 rpm。通气量设为2–4 L/min时，反应器压力控制在0.02–0.05 MPa。初始葡萄糖浓度控制在7.5 g/L。当残余葡萄糖浓度降至1.0 g/L以下时开始补糖。流加葡萄糖溶液（800 g/L）以维持残余葡萄糖浓度在0.1–1.0 g/L。必要时添加适量消泡剂DF-103（陶氏化学公司）控制泡沫。
【数据】斜面培养：36°C，14–16 h；种子培养：36°C，200 rpm，6–8 h；活化标准：OD660 4.0–6.0；接种量：200 mL/2.0 L；pH：7.0（NH₄OH维持）；温度：36°C；DO：40%；搅拌：400–1000 rpm；通气：2–4 L/min；压力：0.02–0.05 MPa；初始葡萄糖：7.5 g/L；补糖浓度：800 g/L；残余葡萄糖控制：0.1–1.0 g/L
2.9 分析方法
使用分光光度计（Shimadzu，日本）在660 nm处测定OD。残余葡萄糖使用M-100生物传感器分析仪（深圳西尔曼科技有限公司，中国）定量。L-色氨酸浓度通过配备Agilent C18色谱柱（250 × 4.6 mm）的高效液相色谱（HPLC）测定。流动相为0.3 g/L KH₂PO₄水溶液与甲醇按体积比90:10混合，流速设为1.0 mL/min。检测波长和柱温分别设为278 nm和39°C。乙酸浓度使用Aminex HPX-87H色谱柱（7.8 × 300 mm）通过HPLC测定。流动相为5 mM H₂SO₄，流速设为0.6 mL/min。检测波长和柱温分别设为210 nm和52°C。
【数据】OD检测波长：660 nm；L-色氨酸HPLC：C18柱（250 × 4.6 mm），流动相0.3 g/L KH₂PO₄:甲醇=90:10，流速1.0 mL/min，检测波长278 nm，柱温39°C；乙酸HPLC：Aminex HPX-87H柱（7.8 × 300 mm），流动相5 mM H₂SO₄，流速0.6 mL/min，检测波长210 nm，柱温52°C
研究结果
3.1 通过模块化代谢工程提高L-色氨酸生物合成效率
以实验室保藏菌株TRPJ-0为起始底盘构建高性能L-色氨酸生产菌株。在5-L生物反应器中发酵60 h后，菌株TRPJ-0产L-色氨酸43.9 g/L，得率为0.16 g/g，生产强度为0.73 g/L/h。乙酸是主要发酵副产物，浓度为0.22 g/L。这一相对较低的浓度表明乙酸积累并非限制L-色氨酸生产的主要因素（图2C）。
为评估前体供应是否限制L-色氨酸生物合成，在菌株TRPJ-0进入稳定期的第16 h分别单独添加莽草酸（10 g/L）、柠檬酸（10 g/L）、谷氨酰胺（10 g/L）和丝氨酸（10 g/L）。如图S1所示：（1）添加莽草酸、谷氨酰胺和丝氨酸后，L-色氨酸效价分别提高至49.6、47.1和47.4 g/L。与未添加对照（43.9 g/L）相比，L-色氨酸效价分别提高了13.0%、7.3%和8.0%。（2）相比之下，柠檬酸添加对L-色氨酸效价和得率均无显著影响。上述结果表明，莽草酸、丝氨酸和谷氨酰胺等关键前体供应不足限制了L-色氨酸的生物合成效率。
为提升L-色氨酸生物合成效率，对莽草酸、丝氨酸和谷氨酰胺前体模块进行了合理的模块化改造。（1）强化PEP和E4P生物合成以增强莽草酸供应。为增加PEP可用性，将编码磷酸烯醇式丙酮酸合酶（ppsA）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（pck）的基因分别整合至TRPJ-0的ylbE位点过表达，获得菌株TRPJ-1和TRPJ-2。其中TRPJ-1（ppsA+）产L-色氨酸45.9 g/L（图2A）。为增强E4P供应，将来源于青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）的磷酸酮醇酶（xfpK）以及大肠杆菌编码转酮醇酶（tktA和tktB）、转醛醇酶（talB）和核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶（rpe）的基因分别整合至TRPJ-1的yghX位点过表达，获得菌株TRPJ-3至TRPJ-7。其中TRPJ-4（tktA+）和TRPJ-6（talB+）分别产L-色氨酸49.6和48.5 g/L。随后将有益基因tktA和talB整合至TRPJ-1的yghX和ycgH位点构建菌株TRPJ-8，产L-色氨酸51.2 g/L，得率为0.18 g/g，生产强度为0.85 g/L/h。与TRPJ-1相比，TRPJ-8的效价、得率和生产强度分别提高了11.5%、8.2%和10.8%（图2A）。
（2）强化丝氨酸生物合成并减弱丝氨酸降解以增强丝氨酸供应。SerA催化L-丝氨酸生物合成的第一个限速步骤，并受L-丝氨酸反馈抑制。前期研究表明，H344A/N364A双点突变可破坏L-丝氨酸与SerA的ACT调控结构域结合，从而解除反馈抑制（Al-Rabiee et al., 1996; Grant et al., 1996）。据此，将serA H344A/N364A突变体整合至TRPJ-8的quuQ位点过表达，并敲除丝氨酸降解基因sdaA，获得菌株TRPJ-10。TRPJ-10的L-色氨酸效价、得率和生产强度分别达到54.2 g/L、0.20 g/g和0.90 g/L/h。与TRPJ-8相比，TRPJ-10的效价、得率和生产强度分别提高了5.9%、6.9%和6.3%（图2B）。
（3）谷氨酰胺模块优化。在大肠杆菌中，谷氨酰胺合成酶GlnA的活性受可逆腺苷酰化严格调控，而枯草芽孢杆菌GlnA主要受谷氨酰胺反馈抑制。前期研究表明，E304A点突变可显著提高枯草芽孢杆菌GlnA对谷氨酰胺介导的反馈抑制的抗性（Wray Lewis and Fisher Susan, 2010）。因此，将BSglnA E304A突变体整合至TRPJ-10的ygaY位点过表达，获得菌株TRPJ-11，产L-色氨酸56.7 g/L（图2B）。随后，为增强谷氨酸（谷氨酰胺的前体）供应并减少谷氨酰胺经GOGAT途径的消耗，将谷氨酸转运蛋白基因gltS整合至TRPJ-11的lfhA位点过表达，并敲除谷氨酸合酶基因gltBD，获得菌株TRPJ-13。TRPJ-13的L-色氨酸效价、得率和生产强度分别达到59.1 g/L、0.21 g/g和0.99 g/L/h。与TRPJ-10相比，TRPJ-13的效价、得率和生产强度分别提高了9.0%、7.2%和9.4%（图2B）。
为评估菌株改造后单位细胞密度的L-色氨酸产量，将L-色氨酸效价对OD660进行归一化。TRPJ-13实现了1.33 g/L/OD660的细胞密度归一化效价，较TRPJ-0（0.87 g/L/OD660）提高了52.9%（图S2）。上述结果表明模块化代谢工程显著提高了单位细胞密度的L-色氨酸产量。
在菌株TRPJ-13发酵过程中观察到以下现象：（1）随着L-色氨酸积累，菌株TRPJ-13的生产强度逐渐下降。48–60 h期间的生产强度为0.45 g/L/h，较12–24 h期间（1.67 g/L/h）下降了73.0%（图2D）。（2）60 h时的细胞生物量较24 h时低37.2%（图2D）。（3）细胞死亡率从36 h开始上升（26.7%），在48 h和60 h分别达到46.8%和70.1%（图2E）。扫描电子显微镜进一步揭示了细胞形态从表面光滑的完整细胞转变为出现皱缩、塌陷和破裂的受损细胞（图2F）。上述结果表明，发酵液中高浓度的L-色氨酸诱导了细胞死亡。
进一步评估了不同L-色氨酸浓度（0、5、10、15、20和30 g/L）对细胞活力的影响（图2G）。在L-色氨酸胁迫下，将L-色氨酸浓度从0提高至30 g/L使菌株TRPJ-13的最大生物量从13.8降至1.8，降幅达87.0%。最大生长速率也从2.55降至0.20，降幅达92.2%。半数抑制浓度（IC50）测定为11.5 g/L（图S3）。上述结果表明高浓度L-色氨酸损害了细胞生长。
【数据】TRPJ-0：43.9 g/L，0.16 g/g，0.73 g/L/h，乙酸0.22 g/L；前体添加（10 g/L）：莽草酸49.6 g/L（+13.0%）、谷氨酰胺47.1 g/L（+7.3%）、丝氨酸47.4 g/L（+8.0%）；TRPJ-1（ppsA+）：45.9 g/L；TRPJ-4（tktA+）：49.6 g/L；TRPJ-6（talB+）：48.5 g/L；TRPJ-8：51.2 g/L，0.18 g/g，0.85 g/L/h（较TRPJ-1：+11.5%、+8.2%、+10.8%）；TRPJ-10：54.2 g/L，0.20 g/g，0.90 g/L/h（较TRPJ-8：+5.9%、+6.9%、+6.3%）；TRPJ-11：56.7 g/L；TRPJ-13：59.1 g/L，0.21 g/g，0.99 g/L/h（较TRPJ-10：+9.0%、+7.2%、+9.4%）；单位细胞密度效价：TRPJ-13为1.33 g/L/OD660（+52.9% vs TRPJ-0的0.87）；48–60 h生产强度0.45 g/L/h（较12–24 h的1.67下降73.0%）；60 h生物量较24 h低37.2%；死亡率：36 h为26.7%，48 h为46.8%，60 h为70.1%；IC50：11.5 g/L；最大生物量：13.8→1.8（−87.0%）；最大生长速率：2.55→0.20（−92.2%）
3.2 通过基因组规模过表达文库筛选提高菌株耐受性
为提高菌株耐受性，开展了基因组规模过表达文库筛选以鉴定耐受性增强的遗传靶点。为提高筛选效率，构建了基于靛蓝的高通量报告系统。在该系统中，色氨酸酶基因tnaA和单加氧酶基因MaFMO被整合至染色体上，将L-色氨酸转化为靛蓝，从而实现基于颜色的筛选（图S4A）。光谱扫描显示靛蓝在620 nm处有最大吸收峰，且靛蓝含量与OD620呈线性相关（R² = 0.998）（图S4B和S4C）。在不同L-色氨酸生产能力的报告菌株中，靛蓝含量与L-色氨酸效价呈正相关（R² = 0.924）（图S4D），表明该报告系统适用于高通量文库筛选。将报告系统整合至菌株TRPJ-13中，获得菌株TRPJ-14。随后将含有4,123个大肠杆菌基因过表达质粒的ASKA质粒文库转化至TRPJ-14中，转化细胞涂布于含15 g/L L-色氨酸的琼脂平板上。挑选深色单菌落进行深孔板发酵，每块板设空载体对照。菌株……（原文节选此处截断）
【数据】靛蓝检测波长：620 nm；线性相关R²：0.998（靛蓝含量vs OD620）、0.924（靛蓝含量vs L-色氨酸效价）；筛选平板L-色氨酸浓度：15 g/L；ASKA文库：4,123个过表达质粒
讨论与解读
系统代谢工程是构建微生物细胞工厂的有效策略。本研究构建了靛蓝报告系统并耦合基因组规模过表达文库筛选，鉴定出soxS和yicL为提升L-色氨酸生产的关键靶点。机制分析表明，SoxS通过调控lpxC表达增强脂多糖（LPS）生物合成，从而降低外膜通透性并提高菌株对L-色氨酸的耐受性。此外，YicL被证实参与L-色氨酸转运，可进一步增强L-色氨酸生产。发酵优化后，菌株TRPJ-28在1000-L中试规模生物反应器中L-色氨酸效价、得率和生产强度分别达到70.4 g/L、0.25 g/g和1.17 g/L/h。本研究为开发适合工业化L-色氨酸生产的菌株提供了有价值的见解和策略。通过将靛蓝报告系统与基因组规模过表达文库筛选相结合，建立了高效鉴定L-色氨酸生产有益靶点的新平台。在微生物细胞工厂开发中，新靶点的发现长期是菌株性能突破的关键。目前已发展出多种靶点鉴定策略：（1）基于基因组规模代谢网络模型的预测（Ahn et al., ……原文节选此处截断）。
编译者解读
本研究展示了"前体工程—耐受性工程—转运工程"三阶递进的系统代谢工程范式。靛蓝报告系统与全基因组过表达文库的耦合是方法论亮点——以颜色信号替代繁琐的色谱检测，使4,123个ORF的筛选成为可能，这一策略对其它氨基酸生产菌株的靶点挖掘具有直接借鉴价值。SoxS通过lpxC重塑外膜通透性的机制发现，提示产物耐受未必需要单一转运蛋白，膜结构修饰同样可奏效。值得注意的是，YicL被鉴定为新型L-色氨酸外排蛋白，拓宽了对大肠杆菌芳香族氨基酸转运体系的认知。从产业视角看，TRPJ-28在1000-L规模达到70.4 g/L效价和1.17 g/L/h生产强度，已具备工业应用潜力。但原文未详述靛蓝筛选阳性克隆的假阳性率及文库覆盖度，这些参数对评估该筛选平台的可推广性至关重要。
参考来源
Jiang Y. Genome-scale overexpression screening identifies product tolerance and efflux transport as key determinants of high-level L-tryptophan production in Escherichia coli[J]. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102547
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102547