来源：Engineering Saccharomyces cerevisiae for α-terpineol production from corn stover hydrolysate via UV mutagenesis and PCL1-mediated tolerance enhancement（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质纤维素水解物中的多种抑制物常严重阻碍微生物转化效率。本研究通过优化木糖代谢途径并结合紫外诱变，获得对玉米秸秆水解物（CSH）耐受性显著增强的酿酒酵母菌株T1。转录组分析揭示细胞周期调控基因PCL1的上调是耐受性提升的关键。研究进一步以T1为底盘菌株，通过强化前体供应、优化关键酶拷贝数及动态调控麦角固醇合成，最终获得能直接从CSH合成α-松油醇的工程菌株D22，摇瓶产量达13.6 mg/L。这是首次实现直接从CSH生物合成α-松油醇的报道。
研究背景
日益严峻的环境与能源挑战推动了生物质可再生能源的研究热潮。玉米秸秆作为最丰富的农业废弃物之一，年产量约2.16亿吨。预处理和水解可释放大量可发酵糖，经微生物细胞工厂转化为高值产品或生物燃料。α-松油醇是一种高价值植物源单萜，具有抗炎、抗肿瘤等药用价值，并具备生物燃料潜力。酿酒酵母因安全性好、遗传操作便利且拥有内源甲羟戊酸（MVA）途径可为单萜合成提供前体，被认为是理想底盘。然而，多数研究以葡萄糖为碳源，易引发Crabtree效应导致乙醇积累、降低单萜合成碳通量。玉米秸秆水解物富含葡萄糖和木糖，是经济可持续的替代碳源，葡萄糖与木糖的共利用可缓解Crabtree效应并增强萜类产量。
研究方法
2.1 培养基与培养条件
酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培养基含20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨和10 g/L酵母提取物。葡萄糖-木糖混合糖培养基YPDX在YPD基础上配制，含10 g/L葡萄糖、10 g/L木糖、20 g/L蛋白胨和10 g/L酵母提取物。酵母筛选使用合成葡萄糖最低培养基（SD培养基），含20 g/L葡萄糖、6.7 g/L酵母氮碱和0.6 g/L dropout氨基酸混合粉。根据筛选标记的营养缺陷型需求，以标准化浓度添加营养补充物：20 mg/L组氨酸、60 mg/L亮氨酸、40 mg/L色氨酸和20 mg/L尿嘧啶。用于克隆和接种的大肠杆菌DH5α在含1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和1% NaCl的LB培养基中培养，37°C孵育12 h。筛选阳性克隆时添加氨苄青霉素（100 mg/L）。摇瓶发酵时，酵母细胞先在250 mL锥形瓶中的20 mL YPD培养基内于30°C、220 rpm震荡预培养18 h。随后，在250 mL锥形瓶中的30 mL培养基中接入5%（v/v）种子培养液进行分批发酵。
【数据】YPD培养基：20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物；YPDX培养基：10 g/L葡萄糖、10 g/L木糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物；SD培养基：20 g/L葡萄糖、6.7 g/L酵母氮碱、0.6 g/L dropout粉；营养补充：20 mg/L组氨酸、60 mg/L亮氨酸、40 mg/L色氨酸、20 mg/L尿嘧啶；LB培养基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl；大肠杆菌培养：37°C、12 h；氨苄青霉素：100 mg/L；预培养：20 mL YPD、250 mL锥形瓶、30°C、220 rpm、18 h；接种量：5%（v/v）
2.2 工程菌株的构建
本研究所用质粒、菌株和引物详细信息见补充材料。所有遗传修饰（包括基因整合与敲除）均通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑系统在酿酒酵母BY4742中完成。构建菌株时，由启动子、目标基因和终止子组成、两端侧翼为60 bp同源臂的表达盒，通过CRISPR/Cas9引导的同源重组整合到特定基因组位点。采用基于gRNA–tRNA阵列的CRISPR多重基因组编辑系统实现高效编辑，详细方法见前期报道（Zhang et al., 2019b; Zhang et al., 2024）。简言之，使用在线gRNA设计工具（https://crispr.dbcls.jp/）设计靶向目标基因的引导RNA（gRNA）。将gRNA序列组装成gRNA–tRNA阵列，通过Golden Gate Assembly克隆到携带Cas9表达盒和筛选标记的质粒中。用于同源重组的修复模板（供体DNA）通过寡核苷酸引物PCR扩增获得，通常含60 bp同源臂侧翼靶位点。这些供体DNA可实现精确的基因整合或删除。酵母转化时，细胞培养至对数中期（OD600 = 1.6–2.0），收集后用冰冷山梨醇溶液洗涤。将CRISPR/Cas9质粒和供体DNA片段通过电穿孔共转化至酵母细胞。转化子在相应选择培养基上筛选，阳性克隆经菌落PCR和DNA测序验证。
【数据】同源臂长度：60 bp；转化时细胞OD600：1.6–2.0；电穿孔转化CRISPR/Cas9质粒与供体DNA；验证方法：菌落PCR与DNA测序；编辑系统：CRISPR/Cas9 + gRNA–tRNA阵列
2.3 紫外诱变筛选CSH耐受菌株
紫外诱变使用20 W紫外灯，预热20 min。将酿酒酵母细胞培养至对数期，取100 μL菌悬液涂布于无菌培养皿。样品在30 cm距离处照射10–70 s。照射后立即将细胞梯度稀释至10⁻⁴并涂布于YPD琼脂平板，以未照射细胞为对照。致死率计算公式为：致死率 =（对照组菌落数 − 照射组菌落数）/对照组菌落数 × 100%。选择致死率达70–80%的紫外照射时间用于大规模诱变。处理后的细胞涂布于CSH固体培养基，生长改善的菌落进一步在YPD和CSH液体培养基中培养。与起始菌株相比生长更优的菌株被选作后续研究。
【数据】紫外灯功率：20 W；预热时间：20 min；照射距离：30 cm；照射时间：10–70 s；稀释倍数：10⁻⁴；目标致死率：70–80%
2.4 玉米秸秆水解物的制备与生物转化
玉米秸秆采自中国江苏省连云港市。样品干燥后粉碎至100目。玉米秸秆粉末以1:5固液比浸泡在1%（w/w）硫酸中，室温处理24 h。混合物随后在121°C灭菌30 min，8000×g离心10 min分离半纤维素水解液与纤维素残渣。残渣经洗涤、50°C干燥后，以1:10（w/v）比例重悬于0.05 mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 4.8）中，加入纤维素酶（20 FPU/g）于50°C进行酶解糖化。所得酶解液与半纤维素水解液合并后，10000×g离心20 min去除残余固体。最终水解液在121°C灭菌15 min，用氢氧化钠调至pH 7，即得用于发酵的CSH。成分分析显示CSH含约15 g/L葡萄糖、9 g/L木糖、1.5 g/L乙酸酯、0.27 g/L糠醛、0.13 g/L 5-羟甲基糠醛（HMF）和1.8 g/L总酚类物质。为测试酿酒酵母在木质纤维素水解物上的发酵性能，以CSH为原料。酵母在YPDX培养基中培养制备发酵种子。以5%接种量接入30 mL含5 g/L酵母提取物、5 g/L蛋白胨和3 mL十二烷的CSH中，于30°C、200 rpm摇瓶培养。发酵结束后收集有机相分析α-松油醇产量。
【数据】玉米秸秆粒度：100目；硫酸浓度：1%（w/w）；固液比：1:5；酸处理：室温24 h；灭菌：121°C、30 min；离心：8000×g、10 min；干燥温度：50°C；柠檬酸钠缓冲液：0.05 mol/L、pH 4.8；酶解固液比：1:10（w/v）；纤维素酶添加量：20 FPU/g；酶解温度：50°C；合并后离心：10000×g、20 min；水解液灭菌：121°C、15 min；CSH成分：15 g/L葡萄糖、9 g/L木糖、1.5 g/L乙酸酯、0.27 g/L糠醛、0.13 g/L HMF、1.8 g/L总酚；发酵体系：30 mL CSH + 5 g/L酵母提取物 + 5 g/L蛋白胨 + 3 mL十二烷；发酵条件：30°C、200 rpm
2.5 反转录定量PCR（RT-qPCR）与转录组分析
酿酒酵母细胞培养至对数期后，于4°C、5000×g离心2 min收集。使用酵母RNA试剂盒（Omega Bio-Tek，美国）提取总RNA，随后用PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒（6210A；TaKaRa Bio）进行cDNA合成。mRNA水平定量使用SYBR Premix Ex Taq（RR420A；TaKaRa Bio），以ACT1 rRNA作为内参进行基因表达归一化。所有实验设三次重复以确保可重复性。转录组测序时，菌株D12和T1在YPDX和CSH培养条件下生长至对数期。收集后，细胞样品在−80°C冷冻，送北京亿基因康生物技术有限公司进行RNA提取和转录组分析。
【数据】细胞收集：4°C、5000×g、2 min；RNA提取试剂盒：酵母RNA Kit（Omega Bio-Tek）；cDNA合成：PrimeScript II试剂盒（6210A；TaKaRa Bio）；qPCR：SYBR Premix Ex Taq（RR420A；TaKaRa Bio）；内参基因：ACT1；实验重复：三次；样品保存：−80°C
2.6 生长与存活分析
细胞生长通过UVmini-1240分光光度计测定600 nm处光密度（OD600）评估。细胞活力测定时，CSH直接用作培养基并补充5 g/L酵母提取物和5 g/L蛋白胨。需要评估更高胁迫水平时，使用旋转蒸发仪（R-300，Büchi，瑞士）浓缩CSH以获得不同浓度水平（如1×或2×原始浓度）。酵母细胞先在250 mL摇瓶中的20 mL YPD培养基中于30°C、220 rpm预培养18 h。随后以5%（v/v）接种量接入250 mL摇瓶中的30 mL CSH培养基，于30°C、200 rpm培养5天。培养结束后离心收集细胞，无菌水洗涤两次，测定最终生物量的OD600值。数据以各菌株相对于YPDX条件下生长细胞的百分比表示，半数抑制浓度（IC50）通过将数据拟合至Hill型模型确定。斑点试验时，酿酒酵母细胞培养至对数期后稀释至OD600 = 1.0。取3 μL等分样品进行10倍梯度稀释，将稀释样品点样于相应培养条件的琼脂平板上。平板在30°C培养，每日评估细胞生长。
【数据】OD600测定仪器：UVmini-1240分光光度计；CSH培养基补充：5 g/L酵母提取物、5 g/L蛋白胨；CSH浓缩倍数：1×、2×；预培养：20 mL YPD、250 mL摇瓶、30°C、220 rpm、18 h；发酵：30 mL CSH、250 mL摇瓶、5%（v/v）接种量、30°C、200 rpm、5天；IC50拟合模型：Hill型模型；斑点试验稀释起始OD600：1.0；点样量：3 μL；稀释倍数：10倍梯度
研究结果
3.1 酿酒酵母木糖代谢途径的构建与强化
高效木糖利用是酿酒酵母将CSH转化为高值化学品的关键。野生型酿酒酵母缺乏直接代谢木糖的能力，必须引入异源途径才能实现其利用（图1A）。为此，将Piromyces sp. E2来源的木糖异构酶（XI）和Pichia stipitis来源的木糖激酶（XK）引入酿酒酵母BY4742（命名为菌株D0），构建XI途径获得菌株D1。如图1B所示，在YPDX培养条件下，菌株D1的最终OD600值达9.5，较菌株D0提高20.8%。这可能归因于木糖代谢途径的引入使木糖碳流进入细胞生长代谢。值得注意的是，发酵过程中糖浓度的时程分析表明菌株D1能够利用木糖。然而，木糖消耗仅在48 h葡萄糖完全耗尽后才启动，随后逐步进行（图1C）。酿酒酵母中木糖主要通过GAL2和HXT7等非特异性己糖转运蛋白运输，这些转运蛋白对木糖的亲和力远低于葡萄糖。此外，葡萄糖竞争性抑制木糖运输，进一步限制其摄取效率，导致整体木糖消耗速率偏低（Farwick et al., 2014）。为促进葡萄糖与木糖共利用，将高亲和力木糖转运蛋白HXT7m（F79S）引入菌株D1，获得菌株D2（Apel et al., 2016）。在YPDX培养基培养后，菌株D2的OD600值显著改善，较菌株D0和D1分别提高37.3%和13.7%（图1B）。糖消耗分析显示菌株D2的木糖利用效率提高，并具备葡萄糖与木糖同步共消耗能力（图1C）。这表明增强木糖转运效率可促进酿酒酵母在木糖基培养条件下的生长。此外，菌株D1和D2的葡萄糖消耗能力相当，葡萄糖在发酵早期即被快速耗尽。伴随葡萄糖利用，乙醇积累并在约24 h达到最大值。24至48 h之间观察到明显的乙醇再同化阶段，表明葡萄糖在此区间已完全耗尽，细胞代谢从发酵型转向呼吸型利用非发酵碳源。需要指出的是，这些观察结果是在营养丰富的YPDX条件下获得的，该条件可能促进细胞快速生长并改变碳通量分布。因此，观察到的木糖利用行为（包括糖消耗和乙醇再同化）可能反映了优化后的生理状态，在营养限制或工业相关条件下可能有所不同。
此外，非氧化性磷酸戊糖途径（PPP）对于将木糖代谢的碳通量导向酿酒酵母糖酵解至关重要。然而，由于酵母偏好葡萄糖发酵，其效率受限（Qi et al., 2015）。为进一步改善木糖代谢，在菌株D2中分别过表达非氧化性PPP相关基因RPE1、RKI1、TKL1和TAL1，构建菌株D3、D4、D5和D6。如图1D所示，发酵结果显示四个重组菌株较菌株D2的生物量分别增加13.9%（D3）、12.4%（D4）、14.2%（D5）和13.0%（D6）。四个基因在菌株D7中的共表达进一步使OD600提高23.2%。这些结果表明过表达非氧化性PPP基因显著增强了酿酒酵母在YPDX条件下的生长能力。
将XI途径引入酿酒酵母后，木糖代谢效率仍然较低，主要原因是XI催化活性低。此外，酵母内源木糖还原酶将木糖转化为木糖醇，造成碳通量损失并降低目标化合物产量。更重要的是，木糖醇积累可抑制木糖异构酶活性，进一步降低木糖代谢效率（Tanino et al., 2010）。基于文献报道，本研究选择四个内源木糖还原酶基因（GRE3、YPR1、ADH6和SNF5）进行敲除，构建菌株D8、D9、D10和D11（Li et al., 2021; Träff et al., 2001）。如图1E所示，在YPDX培养条件下，菌株D8、D9、D10和D11的木糖醇浓度较菌株D7分别降低59.2%、62.1%、53.4%和47.6%。然而，与菌株D7相比，仅菌株D8和D9的OD600分别提高10.6%和9.8%，而菌株D10和D11分别降低33.3%和29.5%。ADH6编码NADPH依赖性醇脱氢酶，参与维持胞内NADPH稳态。其敲除可能破坏辅因子平衡，从而影响细胞生长（Larroy et al., 2002）。此外，SNF5编码对核小体重塑、葡萄糖代谢和胁迫响应至关重要的转录调控因子（Laurent et al., 1991）。因此其缺失可能导致代谢紊乱，抑制生长。基于上述结果，对GRE3和YPR1进行双敲除构建重组菌株D12。菌株D12的木糖醇产量为0.7 mM，较菌株D7降低93.1%，而OD600值提高16.0%。这表明减少木糖醇合成可有效改善酵母在木糖条件下的生长性能。据报道，减少木糖醇形成不仅能提高XI的催化效率，还能优化胞内辅因子可用性，从而为细胞生长提供潜在的代谢优势（Träff et al., 2001）。因此，在木糖利用过程中尽量减少木糖醇等副产物的形成至关重要。该策略有助于优化碳通量，确保最大程度分配至细胞生长和代谢需求。综上，这些结果表明增强酿酒酵母木糖利用需要系统性的协同优化策略。涉及转运增强、内部通量处理和副产物消除的多个代谢模块的协调，有助于构建能将碳高效重定向至目标途径的稳健代谢底盘。
【数据】菌株D1最终OD600：9.5（较D0提高20.8%）；木糖消耗起始时间：48 h（葡萄糖耗尽后）；菌株D2 OD600较D0提高37.3%、较D1提高13.7%；乙醇最大积累时间：约24 h；乙醇再同化阶段：24–48 h；PPP基因过表达生物量增幅：D3为13.9%、D4为12.4%、D5为14.2%、D6为13.0%；D7共表达OD600提高23.2%；木糖醇降低幅度：D8为59.2%、D9为62.1%、D10为53.4%、D11为47.6%；OD600变化：D8提高10.6%、D9提高9.8%、D10降低33.3%、D11降低29.5%；菌株D12木糖醇产量：0.7 mM（较D7降低93.1%）；D12的OD600提高16.0%
3.2 紫外诱变获得木质纤维素水解物耐受突变株
尽管菌株D12能代谢CSH中的木糖，但其利用CSH的整体效率仍不确定。为评估菌株D12在CSH中的生长能力，将其在CSH中培养，最终OD600为8.9，较YPDX对照低41.3%（图2B）。这些结果表明CSH中的毒性成分抑制细胞生长，与前期报道一致（Sardi et al., 2016）。因此，增强D12对CSH中这些复杂抑制物的耐受性对于提高底物适应性和资源转化效率至关重要。鉴于这些抑制物组成多变，解析其毒性并实施针对性代谢工程将耗时费力。紫外诱变是产生胁迫耐受突变株的有效方法，当抑制物组成和浓度未知时，提高CSH浓度可增强选择压力以利于分离耐受菌株（Sridhar et al., 2002）。据此，对D12进行紫外诱变以获得能在CSH中稳定生长的菌株（图2A）。首先在不同CSH浓度的培养基中评估D12的生长。
【数据】菌株D12在CSH中最终OD600：8.9（较YPDX对照低41.3%）
3.3 工程菌株的木质纤维素水解物利用与代谢分析
（图3）
【数据】原文未详述
3.4 转录组分析筛选CSH耐受相关靶点
（图4）
【数据】原文未详述
3.5 CSH胁迫对细胞形态与出芽行为的影响
（图5）
【数据】原文未详述
3.6 工程菌株以CSH为底物合成α-松油醇
（图6）
【数据】原文未详述
（图7）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过多维代谢工程策略增强木糖代谢，结合紫外诱变获得对CSH耐受性提高的突变株T1。机制分析鉴定出细胞周期调控基因PCL1是赋予CSH耐受性的有效靶点。菌株T1通过增强细胞形态稳定性、维持细胞骨架完整性和提高出芽效率来抵抗CSH胁迫。在此基础上，通过强化前体供应、动态重定向碳通量和优化关键酶表达，进一步将菌株T1工程化为α-松油醇生物合成菌株。最终菌株D22以CSH为底物直接生产α-松油醇，产量达13.6 mg/L。本研究首次报道了以未脱毒CSH为原料高效生产α-松油醇，为可持续单萜生物制造提供了有前景的策略。
编译者解读
该研究展示了"耐受性优先"的底盘构建策略在木质纤维素生物转化中的价值。与直接优化目标产物合成通路的常规思路不同，作者先通过紫外诱变解决抑制物耐受这一上游瓶颈，再叠加产物合成模块，这种顺序性工程策略降低了多因素耦合的复杂度。PCL1作为细胞周期调控因子被鉴定为耐受性靶点，提示细胞周期稳定性与胁迫耐受之间可能存在普遍关联，值得在其他底盘菌株中验证。13.6 mg/L的α-松油醇产量虽绝对值不高，但考虑到底物为未脱毒的真实水解物且为首次报道，概念验证意义明显。后续若能在中试规模验证该策略的稳健性，或结合连续进化进一步提升耐受性，将推动木质纤维素单萜生物制造向产业化迈进。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135026