来源：A dual-dimensional CRISPR toolkit enables one-step high-efficiency multiplex genome editing in Komagataella phaffii（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
甲醇利用型毕赤酵母（Komagataella phaffii）是绿色生物制造中极具潜力的C1底盘微生物，但其复杂的多基因编辑与长片段精准整合长期受限于低效率与繁琐流程。本研究从底盘细胞DNA修复机制重塑与载体骨架优化两个独立维度入手，构建了高效多基因编辑系统EMGES 3.0——通过五重修复模块工程化改造获得高重组菌株Y09，同时以panARS替换cenARS并优化gRNA启动子，使双基因敲除阳性率最高达100%，中长片段（>4.5 kb）整合效率达93.3%，实现了多重基因敲除与一步法大片段整合的协同编辑。
研究背景
在全球碳减排与工业生物制造转型的驱动下，毕赤酵母凭借其天然同化甲醇的能力脱颖而出，兼具甲醇底物的环境友好性、碳固定与减排效应以及低成本原料供应等优势。作为一种典型的Crabtree阴性酵母，毕赤酵母在发酵过程中几乎不积累乙醇等副产物，代谢稳定性强。然而，其基因组编辑受内源DNA修复机制制约——NHEJ通路主导DNA修复过程，HR效率相对较低。与酿酒酵母等模式酵母相比，毕赤酵母遗传背景注释不足、HR机制尚未阐明，现有编辑系统优化多局限于单一代谢通路或单一载体元件，难以满足多维高通量基因组编辑与迭代工程化的需求。针对多基因编辑与长片段精准整合过程中效率低、操作繁琐的技术瓶颈，亟需从底盘与载体双维度进行系统性协同优化。
研究方法
4.1 菌株、质粒与试剂
BbsI-HF（10U）、T4 DNA连接酶（40U）、CutSmart缓冲液（10X）、ATP（10 mM）及Phusion™高保真DNA聚合酶购自NEB公司。PrimeSTAR® HS DNA聚合酶、PrimeSTAR® 5×Buffer、PrimeSTAR® Max DNA聚合酶及Premix Taq™（Ex Taq™ Version 2.0 plus dye）购自Takara公司。2×CE Mix V3与Phanta® Max Master Mix（2X）购自南京Vazyme公司。FastPure凝胶DNA提取试剂盒与8 min FastPure质粒小提试剂盒购自Vazyme公司。HiPure琼脂糖、TBE DNA电泳缓冲液及Hipure Next Ⅲ Gelred购自Mei5bio公司。DL5000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker及10×DNA Loading Buffer购自Vazyme公司。D-山梨醇、DL-二硫苏糖醇（DTT）、乙二醇及二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma-Aldrich公司。潮霉素购自上海Yeasen公司。细菌琼脂粉、酵母提取物、LB肉汤（无糖）、蛋白胨及葡萄糖购自上海Sangon公司。本研究所用全部质粒列于补充表2，所用全部菌株列于补充表3。
【数据】试剂来源：NEB/Takara/Vazyme/Mei5bio/Sigma-Aldrich/Yeasen/Sangon；质粒清单：补充表2；菌株清单：补充表3
4.2 菌株培养
质粒构建使用大肠杆菌DH5α菌株。质粒构建与扩增时，大肠杆菌在添加100 μg/mL潮霉素的Luria–Bertani（LB）培养基（酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L）中培养，37°C、200 rpm摇床过夜。所有质粒经Sangon测序验证。酵母转化前，基础菌株在2 mL YPD培养基（20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物）中过夜培养，随后细胞转接至含15 mL YPD培养基的100 mL摇瓶中，培养至OD600为0.6-0.8用于制备感受态细胞。感受态细胞制备与DNA转化参照课题组前期论文（Chen et al., 2025）进行。快速电转化基于BEDS溶液完成。为去除gRNA质粒，将验证后的菌株在1 mL YPD培养基中培养约24 h，然后在YPD平板上划线培养。至少传代3次后，在含潮霉素的YPD平板上验证质粒是否去除——若已去除则无菌落生长。摇瓶发酵实验中，以极限盐培养基（Delft）为基础培养基，含7.5 g/L硫酸铵（NH4）2SO4、14.4 g/L磷酸二氢钾（KH2PO4）、0.5 g/L七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）、微量元素及维生素溶液。培养基中添加10 mg/L组氨酸供细胞生长（Yu et al., 2017; Verduyn et al., 1992）。甲醇、甘油或葡萄糖作为摇瓶发酵的唯一碳源。细胞密度使用Ultrospec 10细胞密度计（Biochrom，美国）测定。每个菌株设置三个独立生物学重复。
【数据】LB培养基：酵母提取物5 g/L+胰蛋白胨10 g/L+氯化钠10 g/L；潮霉素：100 μg/mL；培养条件：37°C、200 rpm、过夜；YPD培养基：葡萄糖20 g/L+蛋白胨20 g/L+酵母提取物10 g/L；感受态OD600：0.6-0.8；质粒去除培养：1 mL YPD、约24 h、至少传代3次；Delft培养基：硫酸铵7.5 g/L+KH2PO4 14.4 g/L+MgSO4·7H2O 0.5 g/L；组氨酸：10 mg/L；生物学重复：3次
4.3 通过优化ARS序列与gRNA启动子进行载体重构
在基础质粒（pBB3cH_pGAP_23_cenARS_pLAT1_Cas9）中，将自主复制序列（ARS）替换为PARS1（164 bp）（Weninger et al., 2016）或panARS（452 bp）（Camattari et al., 2016）。简言之，设计引物使其位于骨架ARS位点两侧，从基础质粒中扩增不含ARS序列的骨架区域。PCR总体系为50 μL，含25 μL PrimeSTAR® Max DNA聚合酶、1 μg BbsI消化的cenARS骨架（9.3 kb）、各2.5 μL引物，余量以无核酸酶水补足。PARS1与panARS片段参照课题组前期论文（Chen et al., 2025）扩增。PCR扩增后，目标片段经凝胶回收纯化，随后通过Gibson组装将纯化片段装配至骨架中。Gibson组装在20 μL反应体系中进行，含100 ng线性化pBB3cH骨架、各500 ng纯化插入片段及10 μL 2×CE Mix V3，50°C孵育1 h。最终构建ARS优化质粒pWD1（含PARS1元件）与pWD2（含panARS元件），并经Sangon测序验证。将gRNA启动子（PGAP）替换为质粒骨架Nov_pGAP_panARS_pLAT1_Cas9（pWD2）中的PTEF1（423 bp）、PGPM1（408 bp）（Cai et al., 2021）及PHTB1（469 bp）（Zhang et al., 2022）。不含启动子区域的骨架片段从Nov_pGAP_panARS_pLAT1_Cas9（pWD2）质粒扩增，扩增方案同上。启动子片段从菌株gsy002基因组DNA扩增。PCR总体系50 μL，含25 μL PrimeSTAR® Max DNA聚合酶、2 μL gsy002基因组DNA、各2.5 μL引物，余量以ddH2O补足。Gibson组装采用与上述相同程序，将启动子片段与源自Nov_pGAP_panARS_pLAT1_Cas9（pWD2）的骨架进行装配。最终构建并验证三个质粒：含PTEF1的pPR1、含PGPM1的pPR2及含PHTB1的pPR3。本研究所用引物列于补充表4，所有密码子优化基因序列列于补充表5，由GenScript与Sangon Biotech（上海）合成。
【数据】PARS1：164 bp；panARS：452 bp；PCR体系：50 μL（PrimeSTAR® Max 25 μL+cenARS骨架1 μg+各引物2.5 μL）；Gibson体系：20 μL（骨架100 ng+各插入片段500 ng+2×CE Mix V3 10 μL）；Gibson孵育：50°C、1 h；PTEF1：423 bp；PGPM1：408 bp；PHTB1：469 bp
4.4 工程化底盘细胞以增强HR效率
过表达MRE11（Uniprot:C4R5R7）、PapRecT与PaSSB（Shan et al., 2025）以提高修复准确性并增强长片段整合能力。同时，敲除lig4（Uniprot:C4R5E5）、mph1（Uniprot:C4QYT1）与rad9（Uniprot:C4R4F6）以提升菌株修复准确性。质粒构建方面，Δlig4（pDP1）、Δmph1（pDP2）与Δrad9（pDP3）敲除质粒以BB3cH_pGAP_23*_pLAT1_Cas9为基础载体通过Golden gate组装构建，细节参照课题组前期论文（Chen et al., 2025）。ppMRE11过表达使用中性位点的Ⅱ-4质粒。所有20 bp gRNA序列列于补充表6。所有质粒经Sangon测序验证。为制备基因破坏用修复dsDNA（供体），从菌株gsy002扩增目标破坏基因的上游500 bp与下游500 bp片段。基因整合修复片段的构建涉及上游同源区、启动子、基因、终止子及下游同源区的表达盒组装。所有片段经凝胶回收纯化。修复片段构建采用50 μL总体系：0.5 μL Phusion™高保真DNA聚合酶、1 μL dNTP（10 mM）、各2.5 μL引物、10 μL 5×Buffer，余量以水补足。PCR程序同上。所有引物列于补充表4。菌株构建采用快速电转化（Lin-Cereghino et al., 2005），获得菌株Y01∼Y09。详细信息见补充表3。
【数据】同源臂：各500 bp；修复片段PCR体系：50 μL（Phusion™ 0.5 μL+dNTP 1 μL+各引物2.5 μL+5×Buffer 10 μL）；dNTP浓度：10 mM；敲除基因：lig4、mph1、rad9；过表达基因：MRE11、PapRecT、PaSSB；菌株范围：Y01∼Y09
4.5 多基因编辑效率验证与阳性率计算
为验证载体优化与底盘重塑的基因编辑效率，选择aox1（UniProt ID: P04842）与gut1（UniProt ID: C4R8X4）进行双基因敲除，包括Δaox1Δgut1与Δgut1Δaox1两种顺序。转化子阳性率由三个独立生物学重复（琼脂平板）计算。从含200 μg/mL潮霉素的YPD琼脂平板随机挑选10个菌落，通过PCR扩增验证aox1与gut1的破坏情况。菌株DP101∼901（Δaox1Δgut1）与DP102∼902（Δgut1Δaox1）用于验证底盘重塑效果。菌株WD101∼201（Δaox1Δgut1）与WD102∼202（Δgut1Δaox1）用于验证ARS优化效果。菌株PR101∼PR301（Δaox1Δgut1）与PR102∼PR302（Δgut1Δaox1）用于验证gRNA启动子优化效果。
【数据】筛选标记：潮霉素200 μg/mL；每平板随机挑选菌落数：10个；生物学重复：3次；验证基因：aox1、gut1
研究结果
2.1 重塑毕赤酵母DNA修复机制以增强底盘HR效率
在前期工作中，我们成功构建了HiEE-ReSM系统，包含HR增强平台菌株gsy002（Δku70::RAD52-RAD59）（Wang et al., 2023），并开发了基于CRISPR/Cas9的双位点基因编辑系统（dHgH结构），实现了一步法双基因破坏/整合（表1）（Chen et al., 2025）。然而，初步实验结果显示，现有底盘双功能基因敲除的最大阳性效率仅为约60%。当双基因同时敲除与两个2.3 kb外源片段整合偶联时，编辑效率降至约15%。在更复杂的编辑场景中——如双基因敲除与8 kb和8.5 kb超长片段共整合同时进行——无法获得阳性转化子。这些结果证实原始底盘菌株（gsy002）的HR活性不足以支持高复杂度基因组编辑，无法满足多基因同步编辑与超长DNA片段定点整合的需求。
为突破现有底盘的编辑瓶颈，在复杂代谢通路重构中实现多基因与长片段的同时精准编辑，本研究对前期构建的底盘菌株gsy002（Δku70::RAD52-RAD59）进行了系统性优化升级。基于酵母DNA双链断裂（DSB）修复的分子机制，DNA损伤修复主要由NHEJ与HR两条核心通路介导（图1）。（i）NHEJ末端连接：在NHEJ通路中，ku70-ku80复合物识别并结合断裂DNA末端，随后招募Lig4复合物直接介导断裂末端的随机连接（Ito et al., 2018）。尽管NHEJ修复动力学快，但其低保真性导致与HR通路对DNA修复底物存在固有竞争。（ii）HR通路：高保真HR通路经四个功能模块依次进行：DSB末端切除、DNA损伤检查点调控、重组中间体稳定化与连接。模块1，DSB末端切除：MRE11–RAD50–XRS2复合物（MRX）与SAE2协同作用，启动断裂DNA末端的核酸加工并完成DSB末端切除（Gao et al., 2022a）。模块2，DNA损伤检查点调控：作为DNA损伤反应的关键调控因子，RAD9在DSB位点形成物理屏障，不仅保护DNA末端免受过量降解，还阻碍RPA、RAD52与RAD51等核心重组因子的招募与组装，从而负向抑制HR进程（Ferrari et al., 2020; Ferrari et al., 2015）。模块3，重组中间体稳定化：RPA首先结合并稳定暴露的单链DNA（ssDNA），防止其降解及二级结构形成。随后，RAD52-RAD59复合物移位至DSB位点置换RPA，促进RAD51核蛋白丝组装并启动DNA链入侵，进入重组中间体稳定化阶段（Piazza et al., 2019）。模块4，连接与HR完成：本研究中单链退火蛋白（SSAPs）与单链DNA结合蛋白（SSBs）的优化组合发挥多重功能，包括ssDNA保护、促进同源退火及中和内源负调控因子。SSAP结合宿主SSB的C末端尾部，解除SSB介导的单链退火抑制从而促进HR，而异源SSB可作为“桥梁”使SSAP在新宿主中发挥作用（Filsinger et al., 2021）。同时，MPH1作为特异性DNA解旋酶，拆解新形成的D-loop重组中间体并逆转链入侵，是限制单一基因组位点多片段整合的关键负调控因子。
我们同时靶向完整HR通路与竞争性NHEJ通路，以克服宿主天然修复系统的限制，大幅提升基因组编辑效率。在原始底盘gsy002中，我们通过敲除ku70降低NHEJ，并通过过表达RAD52与RAD59增强重组复合物稳定性。在五个关键功能节点实施了精准组合修饰：（i）敲除lig4消除NHEJ与HR之间的底物竞争（NHEJ末端连接）；（ii）过表达关键HR因子ppMRE11提高DSB末端切除效率，增强HR初始活性（DNA双链断裂末端切除）；（iii）敲除rad9解除rad9对ppMRE11的滞留效应及其对RAD52招募的抑制（DNA损伤检查点调控）；（iv）敲除mph1解除其因拆解D-loop而对多片段整合的抑制作用（同源重组链延伸的改善）；（v）过表达源自铜绿假单胞菌噬菌体的PapRecT-PaSSB，解除宿主SSB介导的退火抑制，稳定同源配对并促进DNA链延伸（重组中间体稳定化）。最终成功构建优化菌株Y09。通过协同调控多个靶点重塑HR与NHEJ之间的稳态平衡，我们预期这将提高同源配对效率，满足复杂代谢通路重构中多基因与长片段同步精准编辑的需求。
经过上述数轮靶向遗传修饰，成功构建了一系列底盘工程菌株Y01–Y09（补充图S2）。为系统评估各工程策略对HR效率的提升效果，我们通过双敲除功能基因醇氧化酶1（aox1）与甘油激酶1（gut1）来量化这些修饰菌株的HR能力，以初始底盘gsy002作为对照（control001: Δaox1Δgut1；control002: Δgut1Δaox1）（图2A和B）。每组实验均设对照组。共使用九个生物学重复作为统一基线以减小系统误差。结果表明，单基因修饰菌株Y01的HR效率未见明显提升（图2A和B；DP101: Y01Δaox1Δgut1，DP102: Y01Δgut1Δaox1）。与先前使用的Δku70菌株相比，Δlig4菌株表现出更高的同步基因破坏效率，尽管实验变异性略有增加。因此，后续多重基因组编辑实验选择Δlig4背景。值得注意的是，底盘Y03（Y01:: ppMRE11）表现出显著的HR性能提升，其双基因编辑效率达到60%（DP302: Y03Δgut1Δaox1）至80%（DP301: Y03Δaox1Δgut1），约为对照菌株control002的2倍。进一步解除内源HR抑制生成底盘Y08（Y07Δrad9），其HR编辑效率进一步提升至86%（DP802: Y08Δgut1Δaox1）∼90%（DP801: Y08Δaox1Δgut1）。此外，Y08的转化子数量较对照组control001（gsy002Δaox1Δgut1）与control002（gsy002Δgut1Δaox1）增加4.5–5.2倍（图2C和D）。这一观察与既往文献一致——rad9缺失被证明可在DSB胁迫下恢复细胞活力（Ferrari et al., 2015）。最终，工程化底盘Y09（Y08:: PapRecT-PaSSB）实现了进一步的效率提升。
【数据】原始底盘双基因敲除最大阳性率：约60%；双基因敲除+2×2.3 kb片段整合效率：约15%；8 kb+8.5 kb超长片段共整合：无阳性转化子；Y03双基因编辑效率：60%–80%（约为对照2倍）；Y08编辑效率：86%–90%；Y08转化子数量增加：4.5–5.2倍
2.2 载体骨架工程增强CRISPR/Cas9基因编辑效率
在底盘工程之外，本研究还对游离型CRISPR载体骨架进行了系统优化，以进一步提升多重基因编辑效率。自主复制序列（ARS）与gRNA启动子是影响质粒稳定性与sgRNA表达水平的关键元件。我们将基础载体中的cenARS替换为PARS1或panARS，并将gRNA启动子PGAP替换为PTEF1、PGPM1或PHTB1，构建了一系列骨架优化载体。通过双基因敲除Δaox1Δgut1与Δgut1Δaox1验证各骨架变体的编辑性能。结果如图3所示，不同ARS元件与gRNA启动子组合对转化效率与编辑阳性率均有显著影响。panARS在维持质粒稳定性方面优于PARS1与cenARS，而不同gRNA启动子驱动的sgRNA表达水平差异也直接影响了编辑效率。经筛选，含panARS与PGAP启动子组合的载体Nov_pGAP_panARS_pLAT1_Cas9表现最佳。
【数据】ARS比较：cenARS vs PARS1 vs panARS；gRNA启动子比较：PGAP vs PTEF1 vs PGPM1 vs PHTB1；最优组合：panARS+PGAP
2.3 EMGES 3.0的综合验证——高效基因编辑底盘与优化载体骨架的协同
将高效基因编辑底盘Y09与优化载体Nov_pGAP_panARS_pLAT1_Cas9组合，构成完整EMGES 3.0系统。在EMGES 3.0条件下，双基因敲除Δaox1Δgut1与Δgut1Δaox1的阳性率及转化效率如图4所示。双敲除阳性率达到76.6%–100%，转化子数量较初始系统大幅提升。
【数据】EMGES 3.0双基因敲除阳性率：76.6%–100%
2.4 游离脂肪酸生产表型验证EMGES 3.0
为验证EMGES 3.0在复杂代谢通路重构中的实际应用能力，我们以游离脂肪酸（FFA）生产为报告表型进行验证。利用EMGES 3.0系统，在高效基因编辑底盘Y09中整合脂肪酸合成相关基因，构建了FFA生产菌株（图5A）。摇瓶发酵结果显示，工程菌株成功实现了FFA的一步法合成，产量数据如图5所示。
【数据】发酵产物：游离脂肪酸（FFA）；底盘菌株：Y09；碳源：甲醇/甘油/葡萄糖（原文未详述具体碳源）
2.5 白藜芦醇生物合成验证EMGES 3.0的多基因整合能力
通过白藜芦醇生物合成途径进一步验证EMGES 3.0的多基因整合能力。在白藜芦醇合成途径中，通过异源表达关键酶PAL、TAL、4CL与STS，在毕赤酵母中建立了白藜芦醇合成通路（图6A）。修复片段采用图6B所示策略进行设计。实验结果表明，EMGES 3.0成功实现了多基因的一步法整合与白藜芦醇的合成，验证了该系统在复杂多基因代谢途径重构中的高效性。
【数据】异源表达基因：PAL、TAL、4CL、STS；产物：白藜芦醇
讨论与解读
目前毕赤酵母基因编辑系统的优化研究大多局限于单一代谢通路或单一载体元件的改造，限制了对多维高通量基因组编辑的支撑能力，难以满足迭代工程化的多样化需求。本研究从底盘细胞重组工程与载体骨架重构两个独立维度进行理性设计与协同优化，同步提升了HR效率、载体稳定性与细胞修复机制。EMGES 3.0系统实现了基因组编辑性能的跨越式提升。FFA与白藜芦醇均通过EMGES 3.0成功实现了产物的一步法合成。在原始菌株gsy002中理性工程化DNA修复通路的五个核心调控节点，生成高效基因编辑底盘（菌株Y09），编辑阳性率达到90%∼100%。通过敲除lig4消除NHEJ与HR间的底物竞争、过表达关键HR因子ppMRE11增强DSB末端切除效率、敲除rad9解除其对HR起始的抑制、敲除mph1改善链延伸，以及引入异源SSAP-SSB对稳定重组中间体，重塑了HR与NHEJ之间的稳态平衡。
【编译者解读】该研究跳出"单点优化"的惯性思维，将底盘修复网络与载体元件视为一个耦合系统进行协同设计，这种双维度策略在合成生物学工具开发中具有方法论价值。五基因组合修饰的逻辑链清晰——从竞争通路抑制、末端切除增强、检查点解除、解旋酶去除到重组中间体稳定，几乎覆盖了HR的全流程瓶颈。值得关注的是，引入噬菌体来源的SSAP-SSB系统体现了跨界元件在真核底盘中的适配潜力。局限在于，当前验证仍以双基因敲除为主，更大规模的多位点同时编辑（如五基因以上）效率与稳定性有待进一步考察；此外，Y09底盘经多轮工程化后对菌株生长速率与蛋白表达产量的潜在影响，原文未详述，后续商业化应用需补充相关生理表征数据。
参考来源
Yu Z. A dual-dimensional CRISPR toolkit enables one-step high-efficiency multiplex genome editing in Komagataella phaffii. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102525
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102525