来源：Multiscale engineering of enzyme monomerization and chassis morphology for surface-displayed nucleoside phosphorylase biocatalysts（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
寡聚酶的表面展示常受限于其天然四级结构与分泌、胞外组装过程的不兼容性。本研究通过稳定铰链区并重塑二聚化界面，将同源二聚体嘧啶核苷磷酸化酶（PyNP）重编程为稳定且具有催化活性的单体，并借助枯草芽孢杆菌TasA淀粉样蛋白机器实现胞外展示。进一步通过调控细胞分裂重塑底盘形态，结合海藻酸钙微珠包埋与底物保护策略，构建了连续流反应器，其体积催化活性达到展示天然二聚体酶菌株的4.1倍，5-氟尿苷合成转化率达87.6%，时空产率达9.2 g/L/h。
研究背景
生物催化在精细化学品和功能分子制造中具有重要应用。表面展示生物催化作为提高工艺兼容性和工业适用性的有效策略，近年来受到广泛关注。工程化活材料为表面展示生物催化提供了新途径——与传统酶固定化载体不同，这类系统利用活细胞的分泌和自组装能力，在生长过程中形成用于酶展示的胞外结构，从而实现催化剂固定、持续更新和连续催化。枯草芽孢杆菌因其GRAS（一般认为安全）地位、强蛋白质分泌能力和对复杂环境的耐受性，被认为是构建此类系统的理想底盘。其天然分泌的淀粉样蛋白TasA可自组装成有序胞外纤维，为胞外蛋白锚定和展示提供合适支架。然而，表面展示与天然复杂酶（尤其是寡聚酶）的兼容性仍受限，大多数天然酶的四级结构与其在分泌途径中的易位和胞外组装不相容，这是本研究所要解决的核心问题。
研究方法
2.1 基于LigandMPNN的序列设计与PPI位点鉴定
ProteinMPNN是一种蛋白质逆折叠模型，可根据提供的结构坐标计算每个位置上20种标准氨基酸的概率分布。在ProteinMPNN基础上，LigandMPNN引入了两个额外的蛋白质配体编码器层以捕捉蛋白质-配体相互作用，从而促进配体结合口袋的优化设计。
将PyNP的晶体结构及其分离的闭合亚基分别独立提交至LigandMPNN进行评分。使用默认蛋白质骨架模型ligandmpnn_v_32_010_25.pt，参数use_sequence和single_aa_score均设为1，表示利用序列和结构数据而不进行自回归氨基酸评分。对于每个目标位点，LigandMPNN生成跨越20种标准氨基酸的概率分数，建立20维序列偏好向量。通过对单体和二聚体构象分别执行这些计算，在每个位置获得两组对应的序列偏好向量，随后组装成分别针对单体和二聚体的不同位置特异性评分矩阵（PSSM）。
为量化单体和二聚体状态下相同位置序列偏好的差异，采用皮尔逊相关系数比较各自的PSSM。对于给定位置，定义单体构象的LigandMPNN评分向量为m = (m1, m2, …, m20)，二聚体构象的评分向量为d = (d1, d2, …, d20)，其中mi和di表示第i个氨基酸的预测分数，m̄和d̄分别代表各向量的均值。该位点单体和二聚体之间序列偏好的相似性通过皮尔逊相关系数量化，公式如下：
(1) P = [Σ(i=1→20)(di−d̄)(mi−m̄)] / [√(Σ(i=1→20)(di−d̄)²) · √(Σ(i=1→20)(mi−m̄)²)]
该系数反映特定位置在单体和二聚体状态下对不同氨基酸类型相对偏好的一致性。鉴于界面残基在单体和二聚体构象中经历不同的局部结构环境和相互作用约束，其序列偏好通常在这两种状态间表现出显著差异。本研究将相关系数低于设定阈值0.8的残基鉴定为对寡聚状态高度敏感的位点，并选为候选蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）位点供下游分析。
【数据】模型：LigandMPNN（ligandmpnn_v_32_010_25.pt）；参数：use_sequence=1，single_aa_score=1；阈值：Pearson相关系数<0.8；数据库：原文未详述
2.2 通过arDCA鉴定保守功能位点
为避免破坏对单体酶功能可能重要的残基，使用arDCA基于同源序列信息鉴定保守功能位点。arDCA是一种基于多序列比对（MSA）的位点特异性突变预测和序列生成方法。以PyNP序列（UniProt ID: P77836）作为查询序列进行同源搜索。使用HHblits针对UniRef30_2020_06和bfd_metaclust_clu_complete_id30_c90_final_seq.sorted_opt数据库执行多轮同源序列搜索。搜索在严格条件下进行，覆盖度阈值为0.35（−mact 0.35），E值截断值为1×10⁻¹⁰，以获得高质量同源序列。
检索到的序列进一步使用HHsuite包中的hhfilter进行过滤，保留最大序列同一性为99%（−−id 99）且最小查询覆盖度为75%（−−cov 75）的序列。该过滤过程获得17,056条同源序列。最终序列集使用MAFFT以FFT-NS-2算法和最大retree值3（−−retree 3）进行比对。所得MSA作为arDCA的输入。对于突变效应预测，使用相对较大的正则化参数，λJ = 10⁻²和λH = 10⁻⁴，以提高模型的泛化能力。随后计算每个位置所有20种氨基酸的突变概率，生成arDCA衍生的位置特异性评分矩阵。每个残基位置的保守性通过信息熵量化，如式(2)所定义。熵值较低的位点被认为更保守，因此可能对维持酶功能更重要。
(2) H(X) = −Σ(i=1→20) P(xi) loge P(xi)
【数据】查询序列：PyNP（UniProt ID: P77836）；数据库：UniRef30_2020_06、bfd_metaclust_clu_complete_id30_c90_final_seq.sorted_opt；覆盖度阈值：0.35；E值：1×10⁻¹⁰；序列同一性：99%；查询覆盖度：75%；同源序列数：17,056；比对算法：MAFFT FFT-NS-2，retree=3；正则化参数：λJ=10⁻²，λH=10⁻⁴
2.3 模型构建与分子动力学（MD）模拟
PyNP晶体结构（PDB ID: 1BRW）作为起始模型，通过PyMOL进行诱变或比对生成突变体和底物复合物结构。对于二聚体系统，采用两个活性位点均含磷酸且闭合亚基结合尿苷的构象；对于单体系统，选择同时结合磷酸和尿苷的闭合亚基。所有模型的质子化状态使用H++服务器确定并分配。标准氨基酸残基的力场参数来自本课题组开发的RSFF2C力场。磷酸配体的参数使用GAFF2力场分配，尿苷底物使用标准OL3 RNA力场参数描述。磷酸配体的部分电荷使用RESP2方法精修，在Gaussian 16中经几何优化（B3LYP-D3(BJ)/def2-SVP）和单点能量计算（B3LYP-D3(BJ)/def2-TZVP）后，通过Multiwfn计算。每个系统使用TIP3P水模型在截断八面体盒子中溶剂化。
为研究野生型（WT）与突变体在稳定性和活性方面的差异，采用高温分子动力学模拟作为增强采样策略以促进构象探索。具体而言，每个系统在350 K下执行三次独立的1 μs MD模拟，每个系统累计模拟时间为3 μs。
【数据】起始结构：PDB ID 1BRW；力场：RSFF2C（氨基酸）、GAFF2（磷酸）、OL3（尿苷）；电荷方法：RESP2；量化计算：B3LYP-D3(BJ)/def2-SVP（优化）、B3LYP-D3(BJ)/def2-TZVP（单点）；水模型：TIP3P；模拟温度：350 K；模拟次数：3次独立×1 μs；累计时间：3 μs/系统
2.4 模拟结果分析
为探索WT与突变体之间的动态差异，使用晶体结构1BRW及其PyMOL生成的突变体模型作为参考构象，计算界面区域（残基M1-A50）、磷酸、尿苷以及两种底物4 Å半径内残基（K81-G86, T92, K109, S110, R112, L114, T117, G118, T120, Y165, R168, L179-A181, S183, I184, K187）的均方根偏差（RMSD）。
【数据】分析区域：界面残基M1-A50、磷酸、尿苷、底物4 Å半径内残基（K81-G86, T92, K109, S110, R112, L114, T117, G118, T120, Y165, R168, L179-A181, S183, I184, K187）；参考结构：1BRW
2.5 微生物、质粒、培养条件与化学试剂
本研究所用微生物菌株、质粒和引物序列的详细信息见补充表S1-S4。大肠杆菌JM109（本实验室菌种库保存）用于质粒构建和繁殖。所有枯草芽孢杆菌菌株均源自亲本菌株B. subtilis JNA3–10（CCTCC M 209309；中国典型培养物保藏中心，武汉，中国）。工程化底盘B. subtilis JNA3–10ΔtasAΔsinRΔeps为本研究新构建，通过从亲本菌株B. subtilis JNA3–10中敲除tasA、sinR和eps基因获得。除非另有说明，微生物培养在37°C的LB液体培养基或LB琼脂平板上进行。根据质粒抗性标记向培养基中添加相应抗生素：氨苄青霉素（100 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）或博来霉素（30 μg/mL）。本研究所用所有化学品和生化试剂均采购自商业供应商（原文未详述具体供应商信息）。
【数据】菌株：E. coli JM100、B. subtilis JNA3–10（CCTCC M 209309）、JNA3–10ΔtasAΔsinRΔeps；培养温度：37°C；培养基：LB；抗生素：氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、博来霉素30 μg/mL
研究结果
3.1 通过闭合态铰链稳定化与二聚化界面重塑计算设计活性单体
将天然寡聚酶理性转化为具有催化活性的单体，需要精确识别并选择性弱化PPI界面，同时保持内在催化活性。尽管晶体结构有助于定位潜在界面残基，但考虑到酶活性对氨基酸替换的高度敏感性及上位效应，确定最佳突变数量、类型和组合仍是巨大挑战。
基于先前建立的计算设计策略，使用LigandMPNN模型比较PyNP在单体和二聚体结构中的相关性和差异。通过关联单体和二聚体结构衍生的PSSM，鉴定了两种状态间相关性较弱的界面残基，并将这些位置指定为界面位点（图1a）。这些位点在单体和二聚体结构之间表现出显著不同的残基偏好特征，提示它们在界面形成中发挥关键作用。
鉴于PyNP开放-闭合构象转变引起的显著结构不对称性，确定合适的单体结构作为LigandMPNN评分输入是先决条件。为将酶稳定在活性构象并确保底物在口袋内的稳健结合和催化，系统比较了闭合和开放构象状态的结构。分析揭示了四个不同铰链区（G113-T117、G152-P159、D169-I177、R365-V371）的显著构象差异。稳定与闭合构象相关的铰链区可使构象整体偏向具有催化能力的闭合状态。因此，以闭合亚基作为单体输入，应用LigandMPNN重新设计四个铰链区，诱导了17个突变（包括G113N、H116F、Q153I、T154G、G155N、D156G、L157I、D169A、A172G、V174T、N175G、I177E、R365K、A366K、K368I、E369D和V371K），从而生成稳定的铰链结构。这17个铰链区突变基于LigandMPNN评分选择，以稳定单体的闭合构象。
使用第2.1节所述的位点相关性分析，鉴定了14个皮尔逊相关系数低于0.8的界面位置作为潜在PPI相关位点。为在引入偏好单体的界面突变的同时保持单体酶功能，进一步检查LigandMPNN鉴定的界面位点是否与保守功能残基重叠。基于第2.2节所述arDCA衍生的保守性分析，4个熵值低于0.25的界面残基被鉴定为潜在重要功能位点。这些位点被排除在LigandMPNN衍生的突变之外，产生中间变体Mu5，其仅保留选定的偏好单体的界面突变，且在保守功能位点不含替换（表1）。值得注意的是，其余10个界面位点中有3个与先前鉴定的17个铰链残基重叠。因此，将偏好单体的突变与铰链区突变组合，生成最终变体Mu5_lp4，共包含24个突变。
为验证Mu5和Mu5_lp4的稳定性，对单体和二聚体结构进行了分子动力学模拟（图1b）。WT、Mu5和Mu5_lp4的单体和二聚体复合物结构均在含磷酸和尿苷的条件下模拟，结果表明Mu5_lp4单体（Mu5_lp4-Mo）表现出高界面稳定性并牢固保留两种配体，显示与野生型二聚体结构（WT-Di）相似的动态行为。相反，Mu5_lp4二聚体结构（Mu5_lp4-Di）和野生型单体结构（WT-Mo）中观察到的不稳定性表明，在模拟条件下Mu5_lp4优先采用稳定单体状态。相比之下，Mu5的单体结构（Mu5-Mo）在界面处保持结构稳定性并保留磷酸，但对尿苷的结合较弱。这一缺陷可能归因于铰链区稳定化不足——尽管Mu5是稳定单体，但倾向于采用开放构象，从而阻止尿苷的稳定结合。
基于上述计算结果，以WT为对照，评估了Mu5_lp4和Mu5对经典底物尿苷和2′-脱氧尿苷的催化活性。结果显示，对于尿苷，WT的比活性为156 U/mg，而Mu5_lp4保持了132 U/mg的显著活性，Mu5则几乎完全丧失催化活性。2′-脱氧尿苷也观察到类似趋势——Mu5_lp4维持了与WT相当的高活性，而Mu5再次表现出几乎完全的催化活性丧失（图1c）。
PyNP活性单体Mu5_lp4的设计进一步证明了集成MPNN和arDCA策略在活性单体设计中的有效性。此外，该实例强调了稳定活性构象作为实现稳定活性单体设计的关键原则。总体而言，成功实现了同时具有开放和闭合构象状态的酶的活性单体化，这将促进其后续固定化和实际应用。
【数据】铰链区：G113-T117、G152-P159、D169-I177、R365-V371；铰链区突变数：17个（G113N, H116F, Q153I, T154G, G155N, D156G, L157I, D169A, A172G, V174T, N175G, I177E, R365K, A366K, K368I, E369D, V371K）；界面位点：14个（相关系数<0.8）；保守功能位点：4个（熵值<0.25）；最终变体：Mu5_lp4（24个突变）；比活性（尿苷）：WT 156 U/mg，Mu5_lp4 132 U/mg；模拟温度：350 K
3.2 重新设计的单体架构保持PyNP催化功能并提高储存稳定性
为实验验证计算预测，通过SEC分析WT和Mu5_lp4的溶液态寡聚状态，以BSA（66.5 kDa）作为参照（图2a和补充图S1）。WT蛋白在15.98 min处洗脱，早于BSA标准品，与其天然同源二聚体结构（92 kDa）一致。相比之下，Mu5_lp4在17.30 min处延迟洗脱。这一相对于BSA的显著位移表明其流体力学半径更小，证实Mu5_lp4主要以单体形式存在（46 kDa），验证了基于结构的单体化策略的有效性。
随后，系统评估了Mu5_lp4突变体和WT的催化性质和稳定性。酶学性质表征表明，Mu5_lp4保留了天然PyNP的基本催化特征，最适反应温度和pH谱与WT相同，提示理性设计未改变核心催化机制。然而，Mu5_lp4与WT之间的催化活性差异随温度和pH升高而减小（图2b,c）。这一观察意味着在极端物理化学条件下，构象稳定性超越动力学参数成为限制催化效率的主导因素。Mu5_lp4和WT表现出大致相当的热稳定性和pH稳定性谱，尽管Mu5_lp4在若干测试条件下显示出略高的残余活性（图2d,e）。
为评估PyNP的储存潜力，在4°C下评估了Mu5_lp4和WT的长期稳定性。WT在储存10天后开始表现出明显活性下降，至第20天保留约40%初始活性，对应约60%的活性丧失。相比之下，Mu5_lp4在20天后仍保留超过60%的初始活性（图2f）。综合而言，Mu5_lp4在溶液中主要以单体形式存在，同时保留了WT PyNP的主要催化特征。其热稳定性和pH稳定性与WT大致相当，而4°C储存稳定性有所提高。这些发现确立了Mu5_lp4作为具有催化能力的单体酶的地位。
【数据】SEC洗脱时间：WT 15.98 min，Mu5_lp4 17.30 min，BSA参照66.5 kDa；分子量：WT二聚体92 kDa，Mu5_lp4单体46 kDa；储存稳定性（4°C）：WT第20天保留~40%初始活性（损失~60%），Mu5_lp4第20天保留>60%初始活性
3.3 细胞外展示与功能表征
（原文此节内容在节选范围内未完整呈现，以下依据可获得的摘要与讨论信息忠实转述。）将单体化变体与TasA融合实现细胞外展示。通过TasA纤维介导的胞外展示系统，将WT二聚体PyNP（T-Di菌株）和单体化Mu5_lp4（T-Mo菌株）分别展示于细胞表面。结构引导的单体化使TasA融合酶的胞外分布比例从28.4%提高到50.1%，并增强了其表面相关的胞外可及性。
【数据】胞外分布比例：28.4%→50.1%（单体化后）
3.4 底盘形态重塑增强生物催化性能与溶剂耐受性
为进一步提高催化性能，通过调控细胞分裂重塑底盘形态。对T-Mo、T-MoP、T-MoL和T-MoS菌株的培养生长曲线进行了比较分析。扫描电子显微镜成像显示了T-Mo和T-MoL在不同放大倍数下的形态差异。形态重塑策略增强了细胞的催化容量和稳健性。蛋白质工程与底盘工程相结合，将体积全细胞活性从860 U/mL提高至3569 U/mL，达到展示二聚体酶菌株体积活性的4.1倍。
【数据】体积全细胞活性：860→3569 U/mL；倍数：4.1倍（相对于二聚体展示菌株）
3.5 底物保护实现卤代嘧啶核苷的连续流生物催化
工程菌株经海藻酸钙微珠包埋后，采用底物保护策略——在室温下评估了Mu5_lp4在有无尿苷存在下的时间依赖性残余活性。随后进行原位交联并填充至连续流反应器中。以5-氟尿苷合成为代表性反应，填充床反应器实现了87.6%的转化率和9.2 g/L/h的时空产率，停留时间为30 min。连续运行20个柱体积后，转化率仍保持在70%以上。该系统还实现了多种5-卤代嘧啶核苷（核糖核苷和脱氧核糖核苷）的高效合成，展示了广泛的底物适用性。
【数据】转化率：87.6%；时空产率：9.2 g/L/h；停留时间：30 min；连续运行：20个柱体积后转化率>70%；底物：5-卤代嘧啶核糖核苷和脱氧核糖核苷
讨论与解读
本研究开发了一种多尺度工程策略，将PyNP单体化、底盘形态重塑和全细胞固定化整合，构建基于TasA的胞外生物催化剂。结构引导的单体化将TasA融合酶的胞外分布比例从28.4%提升至50.1%，并增强了其表面相关的胞外可及性。蛋白质与底盘联合工程将体积全细胞活性从860提升至3569 U/mL，达到二聚体展示菌株体积活性的4.1倍。经海藻酸钙包埋和底物保护交联后，工程细胞直接用于填充床反应器，在30 min停留时间下实现87.6%的转化率和9.2 g/L/h的时空产率。连续运行20个柱体积后转化率保持在70%以上，且反应器支持多种5-卤代嘧啶核苷和脱氧核苷的合成。通过将酶的四级结构与TasA介导的胞外部署对齐，并将这一设计延伸至细胞和反应器尺度，本研究解决了寡聚酶表面展示和过程集成中的关键限制。
编译者解读：这项工作的核心价值在于打通了"计算设计—蛋白工程—底盘改造—过程工程"的完整链条。从合成生物学应用角度看，将天然寡聚酶理性单体化以适配细菌分泌途径，解决了表面展示技术长期面临的"酶结构不兼容"瓶颈；底盘形态重塑与酶工程协同增效的思路也颇具借鉴意义。连续流反应器87.6%的转化率与9.2 g/L/h的时空产率表明该系统具备实际工业应用潜力。局限在于目前仅验证了嘧啶核苷磷酸化酶一个酶种，其设计策略向其他寡聚酶（如激酶、糖基转移酶）的推广仍需更多案例验证。
参考来源
Wang Q. Multiscale engineering of enzyme monomerization and chassis morphology for surface-displayed nucleoside phosphorylase biocatalysts. Chemical Engineering Journal, 2026.
DOI: 10.1016/j.cej.2026.181407
DOI: 10.1016/j.cej.2026.181407