来源：Boosting L-homoserine production by non-auxotrophic E. coli strain via iterative rational design and tolerance engineering（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-高丝氨酸是多种高附加值化学品的关键前体。本研究以本团队前期构建的HS15菌株为基础，通过动态调控竞争性必需氨基酸合成、半理性设计5′UTR实现关键基因染色体整合表达，并结合解旋酶-脱氨酶突变系统加速适应性实验室进化，最终获得菌株NS18。该菌株在低成本无机盐发酵培养基中达到144.5 g/L产量、0.48 g/g产率及3.01 g/L/h生产强度，为迄今报道的最高水平。多组学分析揭示了与氧化还原状态相关的生产强化机制。
研究背景
L-高丝氨酸是一种非蛋白源α-氨基酸，在微生物和植物代谢中扮演核心角色。作为天冬氨酸家族途径的中间产物，它是L-苏氨酸、L-甲硫氨酸和L-异亮氨酸等必需氨基酸的前体，同时也是合成草铵膦、2,4-二羟基丁酸、O-乙酰高丝氨酸和1,4-丁二醇等多种手性分子的通用起始底物。本团队近期还利用设计的脱羧酶从L-高丝氨酸合成了生物基D-泛醇的关键前体3-氨基-1-丙醇。自2021年以来，L-高丝氨酸合成领域快速发展，多种代谢通路优化和转运工程策略被尝试——Zhang等人通过优化大肠杆菌代谢通量和膜转运蛋白获得60.1 g/L产量；本团队前期首创氧化还原平衡策略，通过协同工程"AspC"和"AspA"途径获得菌株HS15，实现84.1 g/L产量和0.5 g/g葡萄糖产率。然而，营养缺陷型菌株的工业应用受限，且质粒表达系统在发酵过程中存在不稳定性。本研究旨在通过迭代理性设计和耐受性进化，构建非营养缺陷型、无质粒的高产L-高丝氨酸菌株。
研究方法
2.1 菌株、培养条件与化学试剂
本研究所用菌株列于表1。L-高丝氨酸生产使用大肠杆菌BW25113菌株，一般克隆使用大肠杆菌DH5α菌株。质粒构建时，大肠杆菌于37°C在Luria-Bertani（LB）培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中220 rpm振荡过夜培养，或在LB琼脂平板（1.5%琼脂，w/v）上培养。根据需要添加链霉素（50 μg/mL）和卡那霉素（50 μg/mL）。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）；温度：37°C；转速：220 rpm；琼脂：1.5%（w/v）；抗生素：链霉素50 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL
2.2 基因操作
基因敲除和染色体修饰采用基于CRISPR的基因组编辑系统。简要而言，设计靶向特定基因组位点的向导RNA并克隆至CRISPR质粒。构建含同源臂的供体DNA片段以促进同源重组。基因组位点选自已有充分研究的靶标。
【数据】基因编辑系统：CRISPR；编辑方式：基因敲除与染色体修饰；同源臂：PCR构建；靶标选择：已充分研究位点
2.3 5′UTR文库的半理性创建与表征
5′非翻译区（5′UTR）用于在翻译水平调控基因表达。每个5′UTR包含三个功能元件：用于稳定mRNA的茎环结构、增强翻译效率的AU富集区，以及核糖体结合位点（RBS）。所有构建体均采用标准化RBS B0034。茎环和AU富集区基于已报道的5′UTR序列设计。为产生多样性，使用易错PCR构建茎环和AU富集区的突变文库。使用高保真DNA聚合酶扩增质粒骨架pFS91G及含RBS B0034和sfGFP报告基因的片段。随后通过Gibson组装将这些片段与突变5′UTR区组装，构建5′UTR文库。组装质粒转化至大肠杆菌BW25113，从琼脂平板挑选显示不同sfGFP荧光强度的菌落。选中的菌落进一步在96孔板中筛选以评估荧光性能。最终选取10个具有不同表达水平的代表性5′UTR变体进行详细表征。荧光强度使用酶标仪（Beckman Coulter，美国）测量。
【数据】5′UTR结构：茎环+AU富集区+RBS（B0034）；突变方式：易错PCR；组装方法：Gibson组装；报告基因：sfGFP；筛选方式：琼脂平板+96孔板；检测仪器：酶标仪（Beckman Coulter）
2.4 全基因组突变系统的构建与表征
来源于海七鳃鳗的胞嘧啶脱氨酶基因PmCDA1同源物由GenScript（中国南京）合成。解旋酶基因dnaB从大肠杆菌BW25113基因组扩增。启动子文库通过易错PCR从标准启动子J23119扩增。质粒骨架从缺失T7表达盒的pET-28a扩增。突变质粒的完整序列数据见补充信息文件（SEQ.1）。组装质粒转化至大肠杆菌BW25113。单菌落分别测序以确保DnaB-PmCDA1融合蛋白的正确翻译。突变系统的突变频率基于大肠杆菌BW25113中氨苄青霉素抗性突变体的出现进行评估。携带突变构建体的菌株在LB培养基中培养72小时。培养后，将各培养物的细胞密度归一化至OD600 = 1.0。细胞悬液经梯度稀释后涂布于含100 mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板。培养后计数各平板的抗性菌落数。突变频率定义为OD600 = 1.0时每毫升培养物产生的氨苄青霉素抗性菌落数。每个突变菌株进行五次独立生物学重复，计算平均值和方差。
【数据】脱氨酶来源：海七鳃鳗PmCDA1；解旋酶来源：大肠杆菌dnaB；启动子文库：J23119易错PCR；骨架载体：pET-28a（去T7表达盒）；培养时间：72h；细胞密度归一化：OD600=1.0；筛选压力：100 mg/L氨苄青霉素；生物学重复：5次
2.5 L-高丝氨酸耐受性改良的适应性实验室进化
使用EVO cell自动化进化系统（天木生物科技有限公司，中国）对携带突变系统的菌株GHS03进行适应性实验室进化（ALE）。采用两种补料溶液：溶液A为1/10 LB培养基补充200 g/L L-高丝氨酸，溶液B为不含L-高丝氨酸的1/10 LB培养基。进化过程中，溶液A与溶液B的比例从20:80逐步调整至70:30，从而增加选择压力。培养物在恒浊模式下维持，传代阈值为OD600 < 1.0。进化过程持续7天，共28代。进化后，培养物涂布于含100 g/L L-高丝氨酸的LB琼脂平板，分离单菌落用于进一步分析。分离菌株的耐受性使用MicroScreen HT系统（杰灵仪器，中国）通过高通量生长曲线分析评估。每个菌株进行五次独立生物学重复。
【数据】进化系统：EVO cell自动化进化系统；补料A：1/10 LB+200 g/L L-高丝氨酸；补料B：1/10 LB；A:B比例：20:80→70:30；传代阈值：OD600<1.0；进化时间：7天（28代）；筛选平板：100 g/L L-高丝氨酸；检测系统：MicroScreen HT；重复次数：5次
2.6 摇瓶发酵
工程菌株在含10 mL LB培养基的50 mL离心管中于37°C、220 rpm进行种子制备。过夜培养后，将细胞接种至含10 mL化学限定（CD）培养基的250 mL摇瓶中（20 g/L葡萄糖、4 g/L KH₂PO₄、4 g/L (NH₄)₂HPO₄、2 g/L MgSO₄·7H₂O、1.8 g/L柠檬酸、2 g/L酵母提取物和10 mL/L 100×微量元素溶液）进行摇瓶发酵。100×微量元素溶液含840 mg/L EDTA、250 mg/L CoCl₂·6H₂O、1500 mg/L MnCl₂·4H₂O、150 mg/L CuCl₂·2H₂O、300 mg/L H₃BO₃、250 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、1300 mg/L Zn(CH₃COO)₂·2H₂O和10000 mg/L Fe(III)柠檬酸盐。此外，营养缺陷型菌株需要时添加0.6 g/L L-赖氨酸、0.4 g/L L-苏氨酸、0.2 g/L甲硫氨酸。摇瓶在33°C、220 rpm条件下培养12小时。使用酚红作为指示剂监测pH，通过添加30%氢氧化铵维持pH在6.4至7.4之间。所有菌株的摇瓶发酵均进行三次重复。
【数据】种子培养基：LB（10 mL/50 mL管）；发酵培养基：CD（20 g/L葡萄糖、4 g/L KH₂PO₄、4 g/L (NH₄)₂HPO₄、2 g/L MgSO₄·7H₂O、1.8 g/L柠檬酸、2 g/L酵母提取物）；微量元素：EDTA 840 mg/L、CoCl₂·6H₂O 250 mg/L、MnCl₂·4H₂O 1500 mg/L、CuCl₂·2H₂O 150 mg/L、H₃BO₃ 300 mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 250 mg/L、Zn(CH₃COO)₂·2H₂O 1300 mg/L、Fe(III)柠檬酸盐 10000 mg/L；氨基酸添加：L-赖氨酸0.6 g/L、L-苏氨酸0.4 g/L、甲硫氨酸0.2 g/L；温度：33°C；转速：220 rpm；时间：12h；pH范围：6.4-7.4；重复：3次
2.7 生物反应器发酵
工程菌株在含100 mL LB培养基的250 mL摇瓶中进行种子制备。过夜培养后，细胞在5 L生物反应器中以上述CD培养基发酵。通过添加30%氢氧化铵维持pH为7.0。温度在初始葡萄糖消耗阶段控制在37°C，随后在补料阶段降至33°C。在搅拌速度400 rpm和通气速率1 vvm条件下定义100%溶解氧（DO）。发酵过程中通过自动调节搅拌速度和通气速率维持DO为30%。补料溶液含800 g/L葡萄糖，补充2 g/L酵母提取物和8 g/L (NH₄)₂SO₄。对于营养缺陷型菌株，补料溶液进一步补充2 g/L L-赖氨酸、1.5 g/L L-苏氨酸和1 g/L L-甲硫氨酸。初始补料速率设定为4 g/L/h，逐步增加至最高14 g/L/h，通过手动调节葡萄糖补料速率确保发酵过程中无残余葡萄糖。基于种子罐的发酵过程中，工程菌株首先在含100 mL LB培养基的250 mL摇瓶中培养用于种子制备。过夜培养后，培养物转移至含CD培养基的5 L生物反应器中。当OD600达到10时，以10%（v/v）接种比例将种子培养物接种至下一个5 L生物反应器。发酵和补料策略与上述一致。
【数据】种子培养基：LB（100 mL/250 mL瓶）；发酵罐：5 L；pH：7.0（30%氢氧化铵）；温度：37°C→33°C；DO：30%（100%定义于400 rpm、1 vvm）；补料：800 g/L葡萄糖+2 g/L酵母提取物+8 g/L (NH₄)₂SO₄；营养缺陷型补料：L-赖氨酸2 g/L、L-苏氨酸1.5 g/L、L-甲硫氨酸1 g/L；补料速率：4→14 g/L/h；接种OD600：10；接种比例：10%（v/v）
2.8 单核苷酸多态性和转录组分析
单核苷酸多态性（SNP）和转录组分析由Novogene有限公司（中国北京）完成。SNP分析中，对三个独立分离的NS18菌落进行全基因组测序。
【数据】分析公司：Novogene（北京）；SNP分析样本：3个独立NS18菌落
研究结果
3.1 建立非营养缺陷型L-高丝氨酸生产基础细胞
前期工作中构建了L-苏氨酸、L-甲硫氨酸和L-赖氨酸营养缺陷型菌株HS15。本研究首先解决了上述氨基酸的营养缺陷问题。由thrB编码的L-高丝氨酸激酶催化主要的L-高丝氨酸消耗反应，介导L-苏氨酸及下游支链氨基酸（L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸）的生物合成（图1a）。前期研究已证明动态调控策略在平衡细胞代谢和产物生产中的关键作用。因此，根据前期研究，首先在HS15中通过自调控启动子PfilC控制thrB基因的互补来实现L-苏氨酸途径的动态调控，生成菌株NHS01。此外，通过原位互补lysA和metA基因恢复L-甲硫氨酸和L-赖氨酸的合成，分别生成菌株NHS02和NHS03。摇瓶实验测试L-高丝氨酸产量，分别获得4.42 g/L、4.41 g/L和4.45 g/L的产量（图1b）。NHS01和NHS03随后在5 L生物反应器中评估48小时。添加L-甲硫氨酸和L-赖氨酸后，NHS01产生74.4 g/L L-高丝氨酸，产率为0.45 g/g（图1c）。NHS03在不添加任何氨基酸的情况下达到64.8 g/L产量和0.41 g/g产率（图1d）。代谢分流减少在意料之中，因为L-苏氨酸、L-赖氨酸和L-甲硫氨酸的生物合成需要前体的重新分配，而这些氨基酸此前是外源补充的。NHS03的非营养缺陷型表型从工业角度看具有优势。然而，需要进一步的菌株工程来提升性能。
【数据】NHS01摇瓶产量：4.42 g/L；NHS02摇瓶产量：4.41 g/L；NHS03摇瓶产量：4.45 g/L；NHS01 5L罐产量：74.4 g/L（产率0.45 g/g，添加甲硫氨酸和赖氨酸）；NHS03 5L罐产量：64.8 g/L（产率0.41 g/g，无氨基酸添加）
3.2 半理性设计thrA∗基因5′UTR二级结构增强代谢通量
NHS03仍携带表达关键生物合成基因thrA∗、asd和aspA的SC101复制起点质粒，这可能在发酵过程中导致表达不一致。为解决此问题，首先将asd和aspA基因由J23119启动子驱动整合至yjiV位点，而thrA∗仍留在质粒上表达，生成菌株NHS04。NHS04在5 L生物反应器中表现出与NHS03相当的发酵性能，达到65.0 g/L产量和0.41产率（图S1）。该结果表明asd和aspA基因的染色体表达水平在目前通量下足以支持L-高丝氨酸生产。因此，研究聚焦于实现thrA∗基因的高效表达。前期对thrA∗表达的研究主要依赖多拷贝表达策略。然而，转录是一个耗能过程，转录延伸过程中每个核苷酸的添加需要消耗一个ATP分子。因此，通过多拷贝基因表达简单增加转录强度的策略往往产生不理想的结果，并可能对细胞转化效率产生负面影响。
5′UTR在调控翻译效率中发挥关键作用，从而显著影响蛋白表达水平。它可以通过特定结构元件影响mRNA稳定性。例如，位于5′端的稳定茎环结构可以保护转录本免受核糖核酸酶攻击，从而延长mRNA半衰期并增加蛋白表达水平。此外，位于Shine-Dalgarno序列上游的AU富集单链区域可以增强核糖体招募并进一步促进翻译效率。因此，理性设计5′UTR，使其包含5′茎环结构、AU富集元件和B0034核糖体结合位点（图2a）。
为生成覆盖广泛表达范围的5′UTR文库，独立设计5′茎环区和AU富集区文库，并通过Gibson组装随机组合。所得构建体以sfGFP作为报告基因进行表征。从文库中随机选取10个显示不同荧光强度的5′UTR变体，代表13.7倍的动态范围（图2b）。大规模序列-活性研究揭示，翻译起始区（相对于起始密码子−30至+30 nt）周围的二级结构是影响翻译效率最关键的 determinants 之一。因此，5′UTR应与基因表达盒高度协调。
为实现5′UTR与表达基因之间的适当匹配，构建了5′UTR测试盒（图2c）。该盒由组成型启动子J23119驱动，在靶基因编码序列（CDS）前96 nt上游包含设计的5′UTR文库。包含96 nt CDS片段是为了模拟5′UTR与编码区之间可能形成的二级结构和相互作用，因为前期研究报道翻译起始位点周围的序列环境（±30 nt）对翻译效率影响最强。报告基因sfGFP下游融合His标签和凝血酶切割位点接头，便于检测靶基因表达。引入接头是为了最小化融合小肽对sfGFP折叠的潜在干扰。
在引入thrA∗基因前96 nt后，不同5′UTR的相对表达水平与直接表达sfGFP相比发生显著变化（图2d）。值得注意的是，携带5′UTR 2f-3、2h-2和2e-1的菌株未检测到荧光。这进一步证明5′UTR与CDS之间的相互作用对翻译效率有深远影响。幸运的是，UTR 2f-1的表达水平比最弱变体UTR 2f-4高47倍。随后将设计的5′UTR序列用于后续实验验证基因表达。
首先消除NHS04中携带thrA∗基因的质粒，生成菌株GHS01。选择中等强度变体UTR 2g-4和最强变体UTR 2f-1构建thrA∗表达盒，染色体整合至GHS01的frwA-frwC位点，分别生成菌株GHS02和GHS03。摇瓶实验中，GHS01仅产生2.3 g/L L-高丝氨酸，而GHS02和GHS03分别产生3.7 g/L和5.6 g/L L-高丝氨酸，较GHS01分别增加60.9%和147.0%（图3a）。进一步评估了菌株GHS01、GHS02和GHS03的体内ThrA∗酶活性（图S2）。ThrA∗酶活性趋势与荧光表征结果一致，更强的5′UTR导致更高的ThrA∗酶活性，进一步验证了本研究所开发表征策略的有效性。
5 L生物反应器发酵结果与摇瓶观察趋势一致，L-高丝氨酸产量从GHS01到GHS03逐渐增加（图3b和c）。令人鼓舞的是，菌株GHS03在48小时内产生83.6 g/L L-高丝氨酸，在相同工艺条件下发酵性能优于HS15，且无需氨基酸补充。进一步优化发酵工艺，采用更激进的葡萄糖补料策略。令人兴奋的是，GHS03在48小时内产生110.6 g/L L-高丝氨酸，产率达0.41 g/g（图3d）。虽然产率略低于HS15，但菌株GHS03超过了HS15的总产量。
【数据】NHS04 5L罐产量：65.0 g/L（产率0.41）；5′UTR动态范围：13.7倍；2f-1表达水平：比2f-4高47倍；GHS01摇瓶产量：2.3 g/L；GHS02摇瓶产量：3.7 g/L（较GHS01提高60.9%）；GHS03摇瓶产量：5.6 g/L（较GHS01提高147.0%）；GHS03 5L罐产量：83.6 g/L（48h）；优化补料后GHS03产量：110.6 g/L（48h，产率0.41 g/g）
3.3 基于脱氨酶和解旋酶的全基因组突变系统的构建
【数据】原文未详述
3.4 GHS03的耐受性进化
【数据】原文未详述
3.5 菌株NS18在种子罐工艺中的发酵性能
【数据】原文未详述
3.6 SNP分析探索NS18高L-高丝氨酸耐受性和生产能力的机制
【数据】原文未详述
3.7 体内辅因子浓度分析
【数据】原文未详述
3.8 GHS03与NS18的比较转录组分析
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究基于前期开发的大肠杆菌HS15菌株，通过整合理性工程和适应性实验室进化，迭代式提升了L-高丝氨酸产量。通过动态调控必需氨基酸合成，消除了HS15菌株的营养缺陷限制。此外，通过5′UTR工程建立了无质粒表达系统，实现关键途径基因在染色体上的稳定强表达。这些改造生成菌株GHS03，在补料分批发酵中产生超过110 g/L L-高丝氨酸，性能超过HS15和多数已报道菌株。
5′UTR工程以往主要集中在调节核糖体结合位点强度以优化基因表达和代谢通量，往往忽视5′UTR二级结构的作用。虽然5′UTR二级结构对翻译效率的影响已被认识一段时间，但高可翻译性5′UTR的理性设计需要与编码序列进行上下文依赖性整合。这种相互依赖性限制了5′UTR二级结构工程相比传统RBS设计的普适性和可扩展性。然而，针对特定蛋白表达，5′UTR二级结构的靶向优化具有独特优势。
编译者解读：本研究的方法论亮点在于"理性设计+定向进化"的双轮驱动策略——先用半理性5′UTR工程解决染色体整合表达效率问题，再用解旋酶-脱氨酶突变系统加速全基因组突变以筛选高耐受菌株。144.5 g/L的产量与3.01 g/L/h的生产强度刷新了L-高丝氨酸发酵的纪录。值得注意的是，作者通过SNP分析和转录组学揭示了辅因子平衡与支链氨基酸合成上调在耐受性中的关联，这为后续针对氧化还原状态的系统水平优化提供了分子靶标。从合成生物学应用角度看，非营养缺陷型和无质粒设计显著降低了工业放大中的成本与稳定性风险，但5′UTR的上下文依赖性设计策略是否可迁移至其他产物体系仍需进一步验证。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2026
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102491
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102491