来源：Development of a bifunctional dynamic control system for effective product synthesis in Bacillus licheniformis DW2（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
地衣芽孢杆菌DW2是工业酶、脂肽和生化品合成的重要底盘菌株，但缺乏动态调控工具限制了其应用拓展。本研究在DW2中开发了一套性能优良的双功能动态控制系统：一方面构建了调控范围达1.03～352.37倍的木糖诱导表达系统和可响应0.001 mM IPTG的高灵敏诱导系统（动态开启模块），另一方面基于ClpXP蛋白酶构建了动态关闭模块。将两者偶联后首次在地衣芽孢杆菌中实现了对基因表达的同时上调和下调，并成功用于γ-PGA代谢通路的动态优化，使产量提升33.51%。
研究背景
合成生物学与代谢工程的快速发展使微生物细胞工厂能够以环境友好的方式将可再生生物质转化为高附加值生化品。为实现目标产物高产量、高得率和高生产强度，通常需要重编程胞内代谢流。静态控制依赖对微生物基因组的永久修饰，难以灵活适应细胞状态或外部环境变化，易导致代谢失衡和有毒中间物积累。动态控制则能实时感知和响应胞内代谢状态或胞外环境信号，在细胞生长与产物合成之间平衡代谢流，已成为构建高效微生物细胞工厂的核心策略。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株和质粒列于补充材料表1。大肠杆菌DH5α用于载体构建；地衣芽孢杆菌DW2用于GFP、RFP蛋白表达；地衣芽孢杆菌WX-02作为γ-PGA生产的底盘细胞。质粒pHY300PLK用于基因表达载体构建，T2(2)-Ori用于基因/ssrA标签整合或启动子替换。GFP或RFP的诱导表达：菌株在50 mL LB培养基中培养24小时，需要时加入一定浓度的木糖或IPTG。γ-PGA生产培养基组成：80 g/L葡萄糖、10 g/L柠檬酸钠、10 g/L NaNO₃、8 g/L NH₄Cl、1 g/L K₂HPO₄·3H₂O、1 g/L ZnSO₄·7H₂O、1 g/L MgSO₄·7H₂O、1 g/L CaCl₂、0.15 g/L MnSO₄·H₂O，pH 7.2，37°C，230 rpm/min培养36小时，每8或12小时取样。
【数据】培养基：LB（诱导表达）/γ-PGA专用培养基；温度：37°C；转速：230 rpm/min；时间：24h（诱导）/36h（γ-PGA）；pH：7.2；葡萄糖：80 g/L；柠檬酸钠：10 g/L；NaNO₃：10 g/L；NH₄Cl：8 g/L
2.2 重组质粒与重组菌株的构建
木糖或IPTG诱导表达重组菌株的构建参照已报道方法（Rao et al., 2023）。基于质粒pHY-R27-GFP和pHY-PUbay-GFP，使用ClonExpress One Step Cloning Kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），通过18 bp重叠序列的载体骨架自连接，按照制造商说明书分别构建杂合启动子质粒（pHY-R27xylO-GFP、pHY-PUbaylacO-GFP）。随后将融合片段（Pamp-XylR、Pamp-LacI）插入上述质粒，分别获得pHY-R27xylO-GFP-Pamp-XylR和pHY-PUbaylacO-GFP-Pamp-LacI。以类似方式构建一系列木糖或IPTG诱导表达质粒。最后通过电转化将质粒转入地衣芽孢杆菌获得重组菌株。
启动子替换和ssrA标签整合菌株的构建参照已有描述（Zhan et al., 2023）。基因rocG的启动子被替换为lacOPUbaylacO启动子；基因clpX的启动子被替换为PUTR12-LacI-lacOPUbaylacO。ssrA标签整合到地衣芽孢杆菌WX-02基因组中odhA的位置。简要流程：基于引物扩增并融合上游、下游同源臂和启动子/ssrA标签；将融合片段插入T2(2)-Ori获得启动子替换或ssrA标签整合质粒；通过电转化和单双交换构建相应重组菌株。GFP-ssrA质粒使用ClonExpress One Step Cloning Kit，基于pHY-R8-GFP质粒通过18 bp重叠序列的载体骨架自连接构建，相应的GFP-ssrA重组菌株通过电转化获得。
【数据】重叠序列：18 bp；试剂盒：ClonExpress One Step Cloning Kit（Vazyme）；转化方式：电转化；同源重组：单双交换
2.3 ssrA标签降解率的测定
以不含ssrA标签的GFP为对照，不同ssrA标签（LAA、LAA+2、LAA+4、DAS、DAS+2和DAS+4）在特定诱导时间T（T = 0、4、8、12 h）的降解率按以下公式计算：
DR_N (%) = (GFP_T^CK − GFP_T^N) / GFP_T^CK × 100
注：T = 0、4、8、12 h时，DR_CK (%)值均为0%。N代表LAA、LAA+2、LAA+4、DAS、DAS+2和DAS+4。
【数据】诱导时间点：0、4、8、12h；ssrA标签类型：LAA、LAA+2、LAA+4、DAS、DAS+2、DAS+4
2.4 γ-聚谷氨酸的检测与分析
γ-PGA采用高效液相色谱法（HPLC；Agilent，美国）测定，配备TSK Gel G6000 PWXL色谱柱（7.8 mm × 300 mm，Tosoh，东京，日本），方法参照已有报道（Cai et al., 2018）。样品用乙醇适当稀释后涡旋混匀，离心后取上清，用0.22 μm微孔滤膜过滤后进行仪器检测。流动相为25 mM硫酸钠和乙腈（8:1，v/v），流速0.5 mL/min，检测波长220 nm。使用纯化的γ-PGA建立浓度测定校准曲线。
【数据】色谱柱：TSK Gel G6000 PWXL（7.8 mm × 300 mm）；流动相：25 mM硫酸钠:乙腈 = 8:1（v/v）；流速：0.5 mL/min；检测波长：220 nm；滤膜：0.22 μm
2.5 分析方法
细胞生物量通过测定菌液OD600确定。GFP荧光强度在激发波长480 nm、发射波长520 nm条件下测定，RFP荧光强度在激发波长560 nm、发射波长600 nm条件下测定，使用Multi-Mode Microplate Reader（SpectraMax iD3；Molecular Devices），方法参照已有研究（Xiao et al., 2020）。α-酮戊二酸脱氢酶OdhA和DNA旋转酶GyrA（内参）的Western blot分析参照已报道方法（McGinness et al., 2006）。
【数据】GFP检测：激发480nm/发射520nm；RFP检测：激发560nm/发射600nm；仪器：SpectraMax iD3
2.6 统计分析
所有实验均进行三次重复。所有数据以平均值±标准差表示，方差分析显著性水平设定为P > 0.05（NS）、P < 0.05（）、P < 0.01（）和P < 0.001（）。
【数据】重复次数：3；显著性水平：P>0.05（NS）、P<0.05（）、P<0.01（）、P<0.001（）
研究结果
3.1 动态开启模块的设计与构建
木糖和IPTG诱导表达系统具有操作简便、可移植性好、适用范围广等特点，已在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母中用于靶基因的动态上调。本研究在地衣芽孢杆菌DW2中人工设计和构建了性能优良的木糖和IPTG诱导表达系统。
#### 3.1.1 人工设计木糖诱导表达系统的构建与优化
为在地衣芽孢杆菌DW2中构建木糖诱导表达系统，以绿色荧光蛋白GFP为报告蛋白，选择能使gfp持续稳定高水平转录的强杂合组成型启动子R27为研究对象。通过将R27与木糖操纵子（xylO：5′-TTAGTTTGTTTAAACAACAAACTAA-3′）杂交并与阻遏蛋白XylR组装，人工设计了木糖诱导表达系统——杂交位点位于R27的UP区与核心区之间，以及核心区与5′-UTR之间。其中，UP区是细菌σ70依赖性启动子中普遍存在的顺式作用增强元件，通常位于启动子核心区（−35 box）上游20～40个碱基对处，为保守的AT富集序列。其核心功能是与RNA聚合酶α亚基的C端结构域（α-CTD）特异性结合，显著提高RNAP与启动子之间的亲和力，从而增强启动子的转录活性。
非诱导条件下（无木糖）：XylR阻遏蛋白结合人工设计启动子xylOR27xylO中的两个xylO位点。一方面直接阻断RNAP与xylOR27xylO核心区的结合；另一方面产生空间位阻干扰UP元件与RNAP的α-CTD之间的相互作用，消除UP元件的增强效应。因此，xylOR27xylO在非诱导条件下表现出更强的转录抑制作用，降低了基础表达水平。诱导条件下（有木糖）：木糖与XylR结合并触发XylR阻遏蛋白的构象变化，使其从xylOR27xylO中的两个xylO位点解离，xylOR27xylO的抑制作用被解除。同时，UP元件可自由与RNAP的α-CTD相互作用，发挥转录增强效应，驱动xylOR27xylO启动子快速高效地上调gfp表达（图2A）。
首先，将xylO分别插入R27的UP区与核心区之间、核心区与5′-UTR之间，获得杂合启动子xylOR27和R27xylO。随后构建表达载体pHY-xylOR27-GFP-Pamp-XylR和pHY-R27xylO-GFP-Pamp-XylR，电转入地衣芽孢杆菌DW2，获得重组菌株X1（DW2/xylOR27-GFP-Pamp-XylR）和X2（DW2/R27xylO-GFP-Pamp-XylR）。最后在摇瓶50 mL LB培养基中发酵上述菌株，发酵10小时时添加1%（m/v）木糖。菌株X1和X2存在严重的泄漏表达现象：未添加木糖时，GFP荧光强度分别为214.45 × 10⁵和126.53 × 10⁵；添加1%木糖后，GFP荧光强度分别为221.17 × 10⁵和148.90 × 10⁵，相应动态范围仅为1.03倍和1.18倍（图2B）。
针对这一现象，推测可能是XylR表达水平不足，导致在无木糖条件下无法有效抑制杂合启动子xylOR27和R27xylO的活性。为验证这一假设，组装了带有优良5′-UTR（UTR12）的启动子Pamp，获得杂合启动子Pamp-UTR12。其中Pamp为中等强度的组成型启动子，驱动XylR阻遏蛋白的表达，使细胞内维持一定浓度的XylR蛋白。随后构建质粒pHY-R27xylO-GFP-Pamp-UTR12-XylR及相应重组菌株X3（DW2/R27xylO-GFP-Pamp-UTR12-XylR）。在无木糖和添加1%木糖条件下，菌株X3的GFP荧光强度分别为3.55 × 10⁵和150.82 × 10⁵，动态范围达42.48倍（图2B）。该结果验证了上述假设，表明XylR的表达优化有效降低了泄漏表达。
此前研究表明，增加操纵子数量可降低诱导表达系统的泄漏表达。因此，将xylO同时插入R27的UP区与核心区之间以及核心区与5′-UTR之间，获得杂合启动子xylOR27xylO，构建重组菌株X4（DW2/xylOR27xylO-GFP-Pamp-UTR12-XylR）。结果显示，在无木糖和添加1%木糖条件下，菌株X4的GFP荧光强度分别为0.51 × 10⁵和158.93 × 10⁵，动态范围提升至311.63倍（图2B）。结果表明，增加xylO数量使人工设计的木糖诱导表达系统仅存在痕量泄漏表达，且在优化XylR表达水平的基础上进一步提升了动态范围。
随后分别考察了人工设计木糖诱导表达系统的最佳诱导浓度和诱导时间。首先在菌株X4摇瓶发酵10小时时添加0%～1.2%的木糖。结果显示，在0%～1.2%木糖范围内GFP荧光强度先升高后降低，当木糖浓度为0.2%时GFP荧光强度达最高水平166.60 × 10⁵，为非诱导条件下的326.67倍（图2C）。且在0%～0.05%木糖浓度范围内，GFP荧光强度与木糖浓度呈显著正相关（见补充材料图1），表明该人工木糖诱导表达系统还可用于检测或监测木糖浓度。随后进一步确定了最佳诱导时间：在菌株X4摇瓶发酵4～16小时内添加0.2%木糖进行诱导。结果显示，10～14小时诱导窗口内木糖诱导效果优良。具体而言，诱导时间为12小时时GFP荧光强度达179.71 × 10⁵，为非诱导条件下的352.37倍（图2D），这是迄今报道的芽孢杆菌属木糖诱导表达系统中最大的动态范围（见补充材料表2）。
综上，在地衣芽孢杆菌DW2中构建并优化了人工设计的木糖诱导表达系统，最佳诱导浓度为0.2%、最佳诱导时间为12小时，GFP调控动态范围达1.03～352.37倍，具有低泄漏、宽动态范围的特点，在地衣芽孢杆菌蛋白表达和工程育种中具有潜在应用价值。
【数据】菌株X1：无木糖GFP 214.45×10⁵，1%木糖GFP 221.17×10⁵，动态范围1.03倍；菌株X2：无木糖GFP 126.53×10⁵，1%木糖GFP 148.90×10⁵，动态范围1.18倍；菌株X3：无木糖GFP 3.55×10⁵，1%木糖GFP 150.82×10⁵，动态范围42.48倍；菌株X4：无木糖GFP 0.51×10⁵，1%木糖GFP 158.93×10⁵，动态范围311.63倍；0.2%木糖：GFP 166.60×10⁵（326.67倍）；12h诱导：GFP 179.71×10⁵（352.37倍）；最佳诱导浓度：0.2%；最佳诱导时间：12h
#### 3.1.2 人工设计IPTG诱导表达系统的构建与优化
为在地衣芽孢杆菌DW2中构建IPTG诱导表达系统，同样以GFP为报告蛋白。以强杂合组成型启动子PUbay为研究对象——该启动子含有UP元件和Ubay（P43的核心区与5′-UTR杂合）元件。通过将PUbay与lac操纵子（lacO：5′-AATTGTGAGCGGATAACAATT-3′）杂交并与阻遏蛋白LacI组装，人工设计了IPTG诱导表达系统。杂交位点位于PUbay的UP区与核心区之间，以及核心区与5′-UTR之间。其调控机制与上述木糖诱导系统类似（图3A）。
首先将lacO插入PUbay的UP区与核心区之间及核心区与5′-UTR之间，获得杂合启动子lacOPUbay和PUbaylacO。构建表达载体pHY-lacOPUbay-GFP-Pamp-LacI和pHY-PUbaylacO-GFP-Pamp-LacI并电转入地衣芽孢杆菌DW2，获得重组菌株I1（DW2/lacOPUbay-GFP-Pamp-LacI）和I2（DW2/PUbaylacO-GFP-Pamp-LacI）。发酵10小时添加0.1 mM IPTG。菌株I1在无IPTG时GFP荧光强度为0.90 × 10⁵，添加0.1 mM IPTG后为181.63 × 10⁵，动态范围达201.81倍。菌株I2在无IPTG时GFP荧光强度为5.79 × 10⁵，添加0.1 mM IPTG后为185.01 × 10⁵，动态范围仅31.95倍（图3B）。菌株I1表现出更低的泄漏表达和更宽的动态范围，故选择I1进行后续优化。
为进一步提高动态范围，使用Pamp-UTR12替换Pamp驱动LacI表达。构建质粒pHY-lacOPUbay-GFP-Pamp-UTR12-LacI及菌株I3（DW2/lacOPUbay-GFP-Pamp-UTR12-LacI）。在无IPTG和0.1 mM IPTG条件下，菌株I3的GFP荧光强度分别为0.21 × 10⁵和184.42 × 10⁵，动态范围提升至878.19倍（图3B）。随后增加lacO数量——将lacO同时插入PUbay的UP区与核心区之间及核心区与5′-UTR之间，获得杂合启动子lacOPUbaylacO，构建菌株I4（DW2/lacOPUbaylacO-GFP-Pamp-UTR12-LacI）。在无IPTG和0.1 mM IPTG条件下，菌株I4的GFP荧光强度分别为0.13 × 10⁵和180.26 × 10⁵，动态范围进一步提升至1386.62倍（图3B）。
考察了不同IPTG浓度（0～0.1 mM）对菌株I4的诱导效果。结果显示，GFP荧光强度随IPTG浓度升高而增加后趋于稳定。当IPTG浓度为0.001 mM时，GFP荧光强度为32.62 × 10⁵，是非诱导条件的250.92倍，表明该系统对IPTG高度敏感。当IPTG浓度达0.01 mM时，GFP荧光强度接近饱和水平。基于此，选取0.01 mM IPTG作为最适诱导浓度。进一步考察最佳诱导时间：在菌株I4发酵4～16小时内添加0.01 mM IPTG。诱导时间为12小时时GFP荧光强度最高，达183.27 × 10⁵，为未诱导条件下的1410.54倍（图3C和图3D）。
【数据】菌株I1：无IPTG GFP 0.90×10⁵，0.1mM IPTG后181.63×10⁵，动态范围201.81倍；菌株I2：无IPTG GFP 5.79×10⁵，0.1mM IPTG后185.01×10⁵，动态范围31.95倍；菌株I3：无IPTG GFP 0.21×10⁵，0.1mM IPTG后184.42×10⁵，动态范围878.19倍；菌株I4：无IPTG GFP 0.13×10⁵，0.1mM IPTG后180.26×10⁵，动态范围1386.62倍；0.001mM IPTG：GFP 32.62×10⁵（250.92倍）；最适IPTG浓度：0.01mM；12h诱导GFP 183.27×10⁵（1410.54倍）
3.2 动态关闭模块——IPTG诱导的ClpXP蛋白酶降解系统的设计与构建
在上述动态开启模块基础上，进一步构建了基于ClpXP蛋白酶的动态关闭模块。地衣芽孢杆菌DW2基因组中含有clpX和clpP基因，其编码的ClpX和ClpP蛋白可组装成ClpXP蛋白酶复合物。该复合物能特异性识别并结合携带ssrA降解标签的靶蛋白，将其解折叠并转运至蛋白酶核心腔进行降解。通过选择不同强度的ssrA标签，可调控靶蛋白的降解效率。
以红色荧光蛋白RFP为报告蛋白，将不同强度的ssrA标签（LAA、LAA+2、LAA+4、DAS、DAS+2和DAS+4）融合至RFP的C端，构建RFP-ssrA融合表达系统。其中LAA标签介导高效降解，DAS标签介导低效降解。为精确调控降解系统的启动时机，将clpX基因的天然启动子替换为IPTG诱导型启动子PUTR12-LacI-lacOPUbaylacO，使ClpXP蛋白酶的表达受IPTG控制。同时将ssrA标签整合至地衣芽孢杆菌WX-02基因组odhA基因位点，使OdhA蛋白携带ssrA标签，可被ClpXP蛋白酶选择性降解。
在菌株DLC/R8-GFP中（含lacOPUbaylacO启动子控制GFP和IPTG诱导的ClpXP系统），添加IPTG诱导ClpXP表达后，携带不同ssrA标签的RFP降解效率呈现明显差异。以不添加IPTG为对照，添加0.1 mM IPTG诱导12小时后，携带LAA标签的RFP降解率达最高，携带DAS标签的RFP降解率较低。结果表明，通过选择不同ssrA标签可精细调控靶蛋白的降解速率，实现从快速降解到缓慢降解的梯度调节。
【数据】IPTG浓度：0.1mM；诱导时间：12h；ssrA标签降解梯度：LAA > LAA+2 > LAA+4 > DAS > DAS+2 > DAS+4（原文未给出具体降解率数值）
3.3 双功能动态控制系统的开发与表征
在上述动态开启和关闭模块基础上，通过偶联LacI和ClpXP，首次在地衣芽孢杆菌中建立了双功能动态控制系统。设计思路：将IPTG诱导的ClpXP蛋白酶降解系统与lacO调控的基因表达系统偶联——LacI阻遏蛋白同时控制靶基因的表达和ClpXP蛋白酶的表达。当添加IPTG时，LacI被解除抑制，靶基因（如rfp）表达上调；同时ClpXP蛋白酶表达，降解携带ssrA标签的靶蛋白（如GFP-LAA），实现一个诱导信号同时上调一个基因并下调另一个基因。
构建菌株DLC/lacOPUbaylacO-RFP-R8-GFP-LAA，其中RFP由IPTG诱导的lacOPUbaylacO启动子控制表达，GFP-LAA由组成型启动子R8驱动表达且携带LAA降解标签。在添加IPTG后，RFP荧光强度随诱导时间逐渐升高，而GFP-LAA荧光强度则逐渐下降。对照菌株（不含ClpXP降解系统）中GFP荧光强度保持稳定。结果表明，该双功能系统可在同一诱导信号下同步实现一个基因的动态上调和另一个基因的动态下调，且两种调控互不干扰。
【数据】IPTG浓度：原文未详述；调控方式：同一信号同时上调rfp、下调gfp；对照菌株GFP稳定
3.4 双功能动态控制系统在γ-PGA代谢工程育种中的应用
将上述双功能动态控制系统应用于γ-PGA代谢通路的动态优化。γ-PGA合成途径中，α-酮戊二酸脱氢酶（由odhA基因编码）是三羧酸循环的关键酶，与γ-PGA合成竞争碳代谢流。通过将ssrA标签整合至odhA基因位点，使OdhA蛋白携带降解标签；同时用IPTG诱导型启动子控制ClpXP蛋白酶的表达。在发酵前期（细胞生长阶段），不添加IPTG，OdhA正常表达，三羧酸循环正常运行，保障细胞生长。在发酵后期（产物合成阶段），添加IPTG诱导ClpXP表达，选择性降解OdhA蛋白，减少碳代谢流向三羧酸循环的分配，将更多代谢流导向γ-PGA合成。
在γ-PGA发酵中应用该策略，发酵36小时后，工程菌株的γ-PGA产量较对照菌株提高33.51%。Western blot分析证实，添加IPTG后OdhA蛋白水平显著下降，而内参蛋白GyrA水平不变，证明ClpXP系统对OdhA的降解具有特异性。
【数据】γ-PGA产量提升：33.51%；发酵时间：36h；降解靶标：OdhA；内参：GyrA
讨论与解读
本研究首次在地衣芽孢杆菌DW2中建立了完整的双功能动态控制工具包。动态开启模块方面，木糖诱导系统通过优化XylR表达水平和增加xylO数量，将动态范围从1.03倍逐步提升至352.37倍，是目前芽孢杆菌属报道的最大动态范围。IPTG诱导系统通过类似策略实现了0.001 mM级别的高灵敏度响应，动态范围达1386.62倍。动态关闭模块利用ClpXP蛋白酶和不同强度ssrA标签的组合，实现了对靶蛋白降解速率的梯度调控。双功能系统的核心创新在于将LacI偶联ClpXP，使单一诱导信号即可同时上调一个基因并下调另一个基因，避免了使用多个诱导剂带来的相互干扰问题。应用层面，通过动态下调odhA基因（三羧酸循环关键酶），在发酵后期将碳代谢流从细胞生长转向γ-PGA合成，产量提升33.51%——这一策略体现了动态控制相较于静态敲除的核心优势：先保生长、后促合成。
编译者解读：从合成生物学应用角度看，本研究的技术路线具有清晰的模块化特征——先分别优化"开启"和"关闭"模块，再进行系统偶联，这种"先分后合"的策略降低了复杂调控网络的设计难度。尤其值得关注的是，将蛋白质降解机制引入地衣芽孢杆菌代谢工程，突破了传统上仅依赖转录水平调控的局限，为胞内代谢通量的精细调节提供了蛋白质水平的操作维度。不过，当前系统仍依赖IPTG等化学诱导剂，未来若能与细胞密度或代谢物浓度响应的自诱导元件整合，将更贴近工业发酵的实际需求。此外，γ-PGA产量提升33.51%是在特定培养基和发酵条件下的结果，该双功能系统对其他代谢产物的普适性调控效果仍需进一步验证。
参考来源
Rao Y. Development of a bifunctional dynamic control system for effective product synthesis in Bacillus licheniformis DW2. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135320
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135320