来源：Pathway optimization for effective heterologous synthesis of ergothioneine in Aspergillus niger（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
麦角硫因（EGT）是一种强效天然抗氧化剂，在化妆品、医药和食品领域具有广阔应用前景。本研究首次在黑曲霉SH-2中建立完整的异源EGT生物合成途径，通过系统筛选不同来源的egt1和egt2基因组合，确定里氏木霉egt1与粗糙脉孢菌egt2为最优搭配。结合前体氨基酸补加与发酵优化，工程菌株OE4-T1N2在5-L生物反应器中EGT总产量达到3.12 g/L，为真菌中异源合成EGT的最高报道水平。
研究背景
麦角硫因（EGT）是一种高价值天然含硫氨基酸，化学式为C₈H₁₃N₃O₂S，分子量229.3 g/mol，水溶性高达0.9 mol/L。其独特的硫结构赋予EGT优异的抗氧化性能，并在细胞保护、免疫调节等生理过程中发挥关键作用。EGT分子稳定性突出，能在体内维持长效生物活性，因此吸引了膳食补充剂和药物开发领域的广泛关注。
EGT的生产方法主要包括生物提取、化学合成和微生物合成。某些真菌物种（如香菇、白蘑菇及多种野生菇）中EGT含量较高，食用真菌既是人类获取EGT的主要膳食来源，也是生物提取的关键原料。然而，生物提取条件苛刻、成本高昂，限制其规模化应用；化学合成路线复杂、产率低且反应过程难控制，大规模生产面临挑战。微生物合成因此成为更具潜力的替代路径。黑曲霉作为公认安全的工业宿主菌，具备强大的蛋白分泌能力和成熟的遗传操作体系，是异源合成EGT的理想底盘。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
大肠杆菌Mach1 T1和DH5α用于质粒繁殖，在LB培养基中37°C、220 rpm条件下培养，添加氨苄青霉素筛选。酿酒酵母BY4741（ΔUra3）用于体内组装，培养条件为30°C、220 rpm。黑曲霉SH-2（ΔkusA ΔpyrG）作为底盘菌株，在CD（Czapek-Dox）或DPY（葡萄糖蛋白胨酵母提取物）培养基中30°C培养，根据需要分别使用5-FOA/尿嘧啶或潮霉素B进行筛选。本研究所用全部菌株和培养基列于支撑信息（表S1）。
【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；转速：220 rpm；酿酒酵母培养温度：30°C；黑曲霉培养温度：30°C；筛选标记：5-FOA/尿嘧啶、潮霉素B
2.2 重组质粒的构建
为筛选EGT生物合成途径的最优基因，从NCBI数据库获取以下氨基酸序列：粗糙脉孢菌来源的Nc egt1（XP_956324）和Nc egt2（XP_001728131）、里氏木霉来源的Tr egt1（XP_006968620）和Tr egt2（XP_006968735）、麦角菌来源的Cp egt2（CCE33140.1）、裂殖酵母来源的Sp egt1（NP_596639.2）。片段之间引入50-bp同源臂，采用酿酒酵母BY4741体内TAR克隆技术，通过同源重组将基因片段、启动子、终止子、线性化pYep352载体、pyrG筛选标记和amyA侧翼区组装在一起。该方法共构建了六个重组质粒（表S1），所用引物详见支撑信息（表S2）。
另构建了四个前体增强质粒，同样使用酵母TAR克隆技术。这些质粒携带编码半胱氨酸γ-裂解酶mecB（An16g08720）、半胱氨酸合酶cysB（An02g10750）和CYS1（An12g09880）的基因，连同启动子Pgla、PpkiA和PcitA，构建半胱氨酸过表达载体pYep352-mecB-cysB-CYS1。对于组氨酸生物合成，将HIS1（An17g01640）和组氨醇脱氢酶HIS2（An14g07210）基因与各元件连接，生成组氨酸过表达载体pYep352-HIS1-HIS2。甲硫氨酸腺苷转移酶基因SAM1（An02g10660）也被过表达，使用SAM过表达载体pYep352-SAM1。为探索三种前体氨基酸的协同效应，将全部六个基因共同过表达于载体pYep352-mecB-cysB-CYS1-SAM1-HIS2-HIS1。所有质粒由武汉天一辉远基因科技有限公司（中国）测序，确认重组质粒构建正确。本研究所用基因的氨基酸序列列于支撑信息（表S3）。
【数据】同源臂长度：50-bp；构建质粒数量：6个EGT表达质粒+4个前体增强质粒；过表达基因：mecB、cysB、CYS1、HIS1、HIS2、SAM1
2.3 表达EGT相关基因的工程菌株构建
黑曲霉转化采用PEG介导的原生质体转化法。酶解后，将原生质体与位点切割质粒和EGT表达质粒（表S1）混合，经PEG处理并在高渗培养基上恢复。阳性转化子通过诊断PCR验证。
【数据】转化方法：PEG介导的原生质体转化；验证方法：诊断PCR
2.4 胞内外EGT的HPLC检测与LC-MS鉴定
培养上清液经0.22 μm滤膜过滤后装入液相色谱进样瓶进行HPLC分析。色谱分离采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（5 μm，250 mm × 4.6 mm），检测波长257 nm。流动相A为水与甲醇99:1（v/v）混合液，pH调至5.0；流动相B为100%甲醇。进样量5 μL，梯度洗脱时间20分钟（表1）。培养上清液中的EGT进一步采用LC/MS-2020系统（岛津，日本）分析，C18色谱分离，ESI负离子模式检测，依据质荷比定性。
摇瓶培养的菌丝体经布氏漏斗收集，无菌水洗涤两次并抽滤去除多余水分。100 mL发酵液获得的总生物量称重记录为M。取收集的菌丝体样品在液氮中研磨成细粉，取0.1 g悬浮于1 mL无菌水中，涡旋混匀后10,000 g离心2分钟。上清液经0.22 μm滤膜过滤后进行HPLC分析，浓度记录为C。胞内EGT含量按下式计算：C_intra = C × 1 × M / (0.1 × 100)。
【数据】色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（5 μm，250 mm × 4.6 mm）；检测波长：257 nm；进样量：5 μL；洗脱时间：20 min；离心条件：10,000 g，2 min；菌丝体取样量：0.1 g；悬浮体积：1 mL无菌水
2.5 RNA纯化与RT-PCR
总RNA提取及后续RT-qPCR分析参照已发表方法进行。以gpdA基因（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）作为参考基因。每个cDNA样品进行三次重复的实时定量PCR（RT-qPCR）实验，结果采用2^(-ΔΔCT)方法分析。各目标基因进行20-25个扩增循环，使用特异性引物，结果进行半定量分析。用于表达分析的基因特异性引物列于支撑信息（表S4）。
【数据】参考基因：gpdA；qPCR重复次数：3次；分析方法：2^(-ΔΔCT)；扩增循环数：20-25
2.6 分子对接方法
选定小分子的化学结构从PubChem数据库获取，蛋白结构从UniProt获取。MGLTools用于蛋白准备。蛋白-小分子对接过程使用AutoDock Vina模拟，随后计算对接结合能。对接结果通过PyMOL软件可视化和分析。
【数据】对接软件：AutoDock Vina；可视化软件：PyMOL；数据库：PubChem、UniProt
2.7 碳源、前体及其他添加剂的优化
本研究使用不同碳源——包括甘油、麦芽糖、柠檬酸钠、木糖、可溶性淀粉和蔗糖——替代基础发酵培养基中的原始碳源。为确定碳源最适浓度，在发酵过程中设置一系列浓度梯度（3%、5%、6%、7%、8%和9%，w/v）。前体氨基酸优化方面，按表2所述添加不同浓度的半胱氨酸（Cys）、组氨酸（His）和甲硫氨酸（Met）。在前体最适浓度和最适碳源基础上，向发酵培养基中额外添加化合物以进一步提高工程黑曲霉的EGT产量。这些化合物包括柠檬酸铁铵（AFC，60 mg/L）、维生素B6（VB6，吡哆醇，60 mg/L）、Triton X-100（0.3%，v/v）、甜菜碱（600 mg/L）和精氨酸（Arg，600 mg/L）。
【数据】碳源种类：甘油、麦芽糖、柠檬酸钠、木糖、可溶性淀粉、蔗糖；碳源浓度梯度：3%-9%（w/v）；AFC：60 mg/L；VB6：60 mg/L；Triton X-100：0.3%（v/v）；甜菜碱：600 mg/L；精氨酸：600 mg/L
2.8 发酵罐培养
种子制备时，将黑曲霉菌落接种至液体CD培养基获得活化培养物，然后以10%（v/v）接种量转接至1 L摇瓶，30°C、220 rpm培养2-3天直至形成紧实菌球。成熟种子培养物以10%（v/v）接种量转接至5 L发酵罐。发酵条件为30°C、200 rpm，初始溶氧设定为30%。培养过程中根据需要调整搅拌转速和通气速率以维持充足的氧气供应。
【数据】接种量：10%（v/v）；摇瓶培养：30°C、220 rpm、2-3天；发酵罐：5 L；发酵温度：30°C；转速：200 rpm；初始溶氧：30%
2.9 统计分析
所有实验均进行三次重复，结果以平均值±标准差（n = 3）表示。统计分析使用GraphPad Prism软件。P值<0.05和P值<0.01通常分别认为具有统计学显著性和极显著差异，P值<0.05（）、P值<0.01（）、P值<0.001（），“ns”表示无显著差异。
【数据】重复次数：3次（n = 3）；显著性阈值：P<0.05（）、P<0.01（）、P<0.001（）
研究结果
3.1 不同来源EGT生物合成基因的组合
EGT标准曲线如图S1所示。真菌EGT生物合成途径由两种酶催化（图1A）。含不同来源egt1和egt2的EGT表达质粒通过酵母TAR克隆组装（图1B）。基因组位点（amyA）切割质粒和EGT表达质粒（图1D和表S1）分别转入黑曲霉SH-2 ku-pyrG-。切割质粒靶向amyA位点，而重组质粒携带amyA位点两侧500-bp同源臂，通过同源重组实现基因组整合（图1C）。基因组PCR分析确认上下游区域均正确整合（图1E）。最终成功构建了六个工程菌株，分别命名为OE1-N1N2、OE2-N1T2、OE3-N1C2、OE4-T1N2、OE5-S1N2和OE6-T1T2。
【数据】同源臂长度：500-bp；整合位点：amyA；构建菌株数：6个
3.2 黑曲霉中EGT生物合成途径的优化
六个工程菌株和亲本菌株SH-2 ku-pyrG-进行发酵，分析培养上清液。HPLC分析显示所有工程菌株在5.3 min处出现相应色谱峰，而亲本菌株SH-2 ku-pyrG-未检测到明显峰（图2A）。采用逐步筛选策略替代全组合测试：先在相同egt1背景下评估候选egt2基因，再在相同egt2背景下筛选egt1基因，最后将表现最佳的基因组合进行进一步分析。EGT产量如图2A所示。野生型菌株未检测到EGT合成。基线菌株OE1-N1N2（表达粗糙脉孢菌Nc egt1和Nc egt2）产生191.70 mg/L EGT。在所有测试菌株中，OE4-T1N2（表达里氏木霉Tr egt1和粗糙脉孢菌Nc egt2）产量最高，达419.32 mg/L，较OE1-N1N2提高118.73%。
对共享Nc egt1但egt2来源不同的菌株OE1-N1N2、OE2-N1T2和OE3-N1C2进行比较分析，发现Nc egt2在黑曲霉中最有效，性能排序为Nc egt2 > Tr egt2 > Cp egt2。类似地，对OE1-N1N2、OE4-T1N2和OE5-S1N2的比较表明，里氏木霉来源的egt1表现最佳，排序为Tr egt1 > Nc egt1 > Sp egt1。这些结果表明，EGT生物合成途径的优化可显著提高EGT产量。此外，egt1和egt2基因的来源可能起重要作用——不同真菌的基因在同一宿主中对EGT生物合成可能产生不同影响。
Chen等人报道在E. coli中表达Tr egt1和Tr egt2于2 L发酵罐中获得4.34 g/L EGT，而表达Nc egt1和Nc egt2的产量低于里氏木霉组合。为检验该组合是否也能增强黑曲霉中的EGT合成，构建了整合Tr egt1和Tr egt2的菌株OE6-T1T2。然而，OE6-T1T2的产量并未高于OE1-N1N2，且显著低于OE4-T1N2（图2A）。这一结果进一步印证Nc egt2对EGT生物合成的影响大于Tr egt2。类似地，Van der Hoek等人在酿酒酵母中表达了三种不同egt1和egt2基因重组组合以及原核EGT生物合成基因簇egtABCDE，确定Nc egt1与Cp egt2为最优组合。Doyle等人发现，即使在酿酒酵母中仅表达来自烟曲霉的单个基因egtA，也能诱导EGT分泌。这些发现表明，EGT生物合成基因的性能可能因宿主生物不同而有所差异，而Tr egt1与Nc egt2的组合在黑曲霉SH-2中似乎是最有效的重组方式。
为进一步确认工程菌株OE4-T1N2中的EGT合成，对培养上清液进行LC-MS分析，检测到显著的m/z 228.09信号（[M-H]-），与EGT（分子量229.3）一致，确认产物身份（图2C）。为测定菌株OE4-T1N2中EGT生物合成基因Tr egt1和Nc egt2的转录水平，提取菌株RNA并反转录为cDNA，以亲本菌株SH-2为对照。半定量PCR（图2B）结果显示参考基因扩增一致，亲本菌株中Tr egt1和Nc egt2无表达，而工程菌株OE4-T1N2中表达清晰可见。实时定量PCR（图2B）表明，OE4-T1N2中Tr egt1和Nc egt2的转录水平显著高于亲本菌株，与摇瓶发酵结果一致——OE4-T1N2的EGT产量远高于SH-2。
【数据】HPLC出峰时间：5.3 min；OE1-N1N2产量：191.70 mg/L；OE4-T1N2产量：419.32 mg/L；产量提升：118.73%；LC-MS检测m/z：228.09（[M-H]-）；EGT分子量：229.3
3.3 EGT合成酶与底物的分子对接
为更好地理解工程菌株中EGT合成的潜在机制，进行了分子对接研究以评估关键酶与其底物之间的相互作用。一般而言，较低的结合能意味着更有利的酶-底物相互作用和更高的结合稳定性。Egt1是一种非血红素铁酶，催化三种氨基酸前体（Cys、His和SAM）的反应。对接结果汇总于表3，表明最稳定的相互作用发生在Tr Egt1与Cys（-4.6 kcal·mol⁻¹）、Tr Egt1与His（-5.2 kcal·mol⁻¹）以及Tr Egt1与SAM（-7.9 kcal·mol⁻¹）之间。在这些相互作用中，Tr Egt1表现出最高的结合亲和力，与其在3.2节（图2A）中表现出的优异EGT合成活性一致。使用PyMOL对强结合Egt1-配体复合物进行可视化（图2D），揭示Tr Egt1与Cys之间的氢键（ARG480、ARG556）、Tr Egt1与His之间的氢键（ARG336、SER697）以及Tr Egt1与SAM之间的氢键（THR368、TYR640、TRP742、HIS741、HIS743）。
Egt2是一种PLP依赖型C-S裂解酶，切割S-(hercyn-2-yl)-L-半胱氨酸亚砜（Cys-HER）的C-S键，促进EGT合成。三种Egt2变体与Cys-HER的对接结果显示，最稳定的相互作用发生在Nc Egt2与Cys-HER之间（-6.0 kcal·mol⁻¹），与3.2节（图2A）中观察到的Nc egt2基因改善EGT合成效果基本一致。Nc Egt2与Cys-HER之间的相互作用进一步表征为与THR251、LEU249、GLN224、ASN244和ALA223形成的氢键（图2E）。这些研究为Egt1和Egt2与其各自底物的潜在相互作用提供了支持性见解，部分解释了携带不同egt基因的菌株之间EGT产量差异的原因。
【数据】Tr Egt1-Cys结合能：-4.6 kcal·mol⁻¹；Tr Egt1-His结合能：-5.2 kcal·mol⁻¹；Tr Egt1-SAM结合能：-7.9 kcal·mol⁻¹；Nc Egt2-Cys-HER结合能：-6.0 kcal·mol⁻¹；参与氢键的氨基酸残基：ARG480、ARG556、ARG336、SER697、THR368、TYR640、TRP742、HIS741、HIS743、THR251、LEU249、GLN224、ASN244、ALA223
3.4 外源前体氨基酸对EGT合成的影响
前体氨基酸的供应可影响EGT合成。为研究初始条件下EGT合成的主要前体限制因素，在500 mL摇瓶培养体系中分别以1 g/L浓度补加三种前体氨基酸（His、Cys、Met）。外源补加的结果如图3A所示。对照菌株OE4-T1N2中，胞外EGT产量为509.55 mg/L，胞内产量为276.76 mg/L，胞内EGT占总产量的35.20%，表明EGT在胞内显著积累（图3A）。在前体补加处理中，添加Cys使EGT总产量较对照提高11.78%，但胞外EGT分泌未见显著改善。相比之下，添加His和Met抑制了EGT合成；然而菌株生长量增加（图3A），提示这些氨基酸的添加可能将代谢流导向细胞生长而非EGT合成。
【数据】对照菌株胞外EGT：509.55 mg/L；对照菌株胞内EGT：276.76 mg/L；胞内占比：35.20%；Cys添加使总产量提升：11.78%；前体添加浓度：1 g/L
3.5 5-L发酵罐规模验证
（注：原文节选未完整提供3.5节内容，以下基于可获得的摘要及结论信息编译。）通过逐步优化，工程菌株OE4-T1N2在5-L生物反应器中经144小时发酵，EGT最高产量达到3.12 g/L（胞内与胞外总量），较摇瓶发酵提高225.9%。这是目前真菌中异源合成EGT的最高报道产量。图4展示了逐步优化过程中不同实验背景下获得的胞外EGT产量数据，各面板间不适用于直接比较。
【数据】5-L发酵罐EGT最高产量：3.12 g/L；发酵时间：144 h；较摇瓶提升：225.9%
讨论与解读
本研究首次在黑曲霉中建立了完整的异源EGT生物合成途径。通过对EGT生物合成基因的系统筛选，证明Tr egt1与Nc egt2的组合在该宿主中产EGT效果最佳。这一结果表明，酶来源在决定丝状真菌宿主中途径效率方面起关键作用。在途径构建之外，通过前体氨基酸补加和培养基优化进一步提高了EGT产量，凸显了代谢背景对支持异源生物合成的重要性。这些改进成功转化至生物反应器规模发酵，胞内与胞外EGT总滴度达到3.12 g/L，较摇瓶发酵提高225.9%。尽管前体代谢途径的完全重构尚未实现，但研究结果揭示了基因表达与EGT生产效率之间关系的新认识。
编译者解读：该研究展示了典型的合成生物学迭代优化逻辑——从"基因元件筛选"到"前体供给调控"再到"发酵工艺放大"，每一步都有明确的量化评估。值得关注的是，作者发现增强前体合成途径反而对EGT合成基因的转录产生负面影响，这一"非预期结果"恰恰揭示了代谢网络中基因表达调控的复杂性，也为后续研究指明了方向。从应用角度看，3.12 g/L的产量在真菌异源合成EGT领域具有竞争力，但距离工业化要求仍有距离。分子对接数据为理解不同来源酶的活性差异提供了结构层面的解释，这种"实验+计算"的联合策略值得同类研究借鉴。局限在于前体途径重构的不完整性——原文对此直言不讳，这种坦诚在学术写作中值得肯定。
参考来源
Chen L. Pathway optimization for effective heterologous synthesis of ergothioneine in Aspergillus niger. Journal of Biotechnology, 2026.
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.04.018
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.04.018