来源：Engineering reutilization of Crabtree-derived ethanol enhances acetyl-CoA supply and terpene production in Saccharomyces cerevisiae（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
高浓度葡萄糖虽能支持酿酒酵母前期快速生长，却触发Crabtree效应导致乙醇溢出，碳流偏离目标产物合成。本研究采用非靶向转录组分析与逆向代谢工程相结合的策略，通过过表达HAP4重塑中心碳代谢，挖掘并工程化改造高活性乙酰化乙醛脱氢酶（ADA），将溢出乙醇高效回收为乙酰辅酶A。结合辅因子工程与补料分批发酵优化，工程菌株在30 L生物反应器中实现5.7 g L⁻¹沉香螺醇产量，展示了该策略的通用性与规模化潜力。
研究背景
绿色生物制造是可持续工业发展的关键技术，酿酒酵母凭借基因组注释完善、遗传操作成熟和异源表达能力强成为核心生产平台。萜烯是典型的乙酰辅酶A衍生化学品，在医药、香料、燃料等领域应用广泛。然而，在葡萄糖充足条件下，酿酒酵母表现出典型Crabtree效应——即使有氧存在，中心碳代谢仍主要流向发酵途径，1 mol葡萄糖仅产生2 mol ATP并生成2 mol乙醇。这种乙醇溢出减少了目标生物合成可用的碳源，降低能量效率，累积的乙醇还会进一步抑制细胞生长和生产性能。传统策略如直接敲除丙酮酸脱羧酶或乙醇脱氢酶基因虽可减少乙醇生成，但往往损害细胞生长。因此，亟需在高葡萄糖发酵条件下能够回收溢出碳的稳健酵母细胞工厂。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用酵母菌株列于表1。图1A所示补料分批发酵使用菌株BFSC0001。BFSC0001菌株保存在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基中（10 g L⁻¹酵母提取物、20 g L⁻¹蛋白胨、20 g L⁻¹葡萄糖）。工程菌株培养于SC-URA合成培养基中（YNB 6.7 g L⁻¹，葡萄糖20 g L⁻¹）（北京百瑞生物技术有限公司），详细组成见表S10。种子培养制备：从固体培养基挑取单菌落接种至5 mL SC-URA培养基，30°C、200 rpm振荡过夜培养。所得种子培养物随后转接至含SC-URA培养基的50/250 mL摇瓶中，30°C、200 rpm振荡培养。培养24 h后，加入10%（v/v）正壬烷作为有机溶剂萃取产生的萜烯。
【数据】菌株：BFSC0001；培养基：YPD（10 g L⁻¹酵母提取物、20 g L⁻¹蛋白胨、20 g L⁻¹葡萄糖）及SC-URA（YNB 6.7 g L⁻¹，葡萄糖20 g L⁻¹）；温度：30°C；转速：200 rpm；时间：过夜/24 h；萃取剂：10%（v/v）正壬烷
2.2 质粒构建
表达载体在大肠杆菌Trans10（全式金生物，北京）中构建。用于基因组编辑的CRISPR-Cas9质粒包括pSTG-URA3和pLacz-BsaI。酵母表达载体源自pYES。本研究构建和使用的所有质粒列于表S1，引物列于表S2，氨基酸序列见表S3。线性DNA片段使用Prime STAR Max DNA聚合酶（Takara Bio，北京）扩增，并用DNA纯化试剂盒（Omega Bio-Tek，美国）纯化。所有引物和异源基因由华大基因（北京）合成并进行密码子优化。质粒组装使用2 × Basic Assembly Cloning and Assembly Kit（全式金生物，北京），并由华大基因进行Sanger测序验证。表达质粒和线性化DNA片段使用Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research，美国加州）按制造商说明转化至工程酿酒酵母菌株。转化子在SC-URA培养基上筛选并通过聚合酶链反应（PCR）验证。乙醛脱氢酶（ADA）基因随后克隆至pET-28a(+)载体的NdeI和XhoI限制性酶切位点之间，该载体携带C端His6标签。定点突变引物设计用于在Y270、S274、N277、D283、E284、E286、L363、I364和V384位点引入单氨基酸替换。PCR扩增使用Phusion高保真DNA聚合酶（New England Biolabs，美国），以携带野生型基因的质粒为模板，按制造商推荐循环条件进行。扩增后，起始质粒DNA通过DpnI（5 U）在1 × CutSmart缓冲液中37°C消化1 h去除。所得质粒通过热激转化至大肠杆菌DH5α（全式金生物，北京）感受态细胞，转化子在含卡那霉素的Luria-Bertani（LB）培养基（10 g L⁻¹胰蛋白胨、5 g L⁻¹酵母提取物、10 g L⁻¹ NaCl）上筛选。阳性菌落质粒经分离测序确认目标突变。质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3），菌株在LB培养基中37°C过夜培养。当细胞密度达到0.6–0.8时，用0.1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达。菌株在恒温摇床中16°C、120 rpm过夜培养。首先，细胞通过离心（13680 × g，10 min，4°C）收集，重悬于5 mL裂解缓冲液（50 mM磷酸盐缓冲液、300 mM NaCl、10 mM咪唑，pH 7.5），并在冰上超声裂解（开2 s、关6 s）。随后细胞碎片通过离心（13680 × g，10 min，4°C）去除，上清液上样至预先用裂解缓冲液平衡的Ni-NTA琼脂糖柱（5 mL，Biorigin，中国）。之后，用3 mL洗涤缓冲液（50 mM磷酸盐缓冲液、300 mM NaCl和20 mM咪唑，pH 7.5）洗涤杂质。最后，用含250 mM咪唑的25 mL洗脱缓冲液洗脱目标蛋白。洗脱组分经SDS-PAGE分析后合并，通过超滤进行缓冲液置换去除咪唑。纯化蛋白分装后在含10%（w/w）甘油的条件下于−80°C保存备用。
【数据】宿主菌：大肠杆菌Trans10/DH5α/BL21(DE3)；诱导剂：0.1 mM IPTG；诱导温度：16°C；转速：120 rpm；裂解缓冲液：50 mM磷酸盐缓冲液、300 mM NaCl、10 mM咪唑，pH 7.5；超声参数：2 s开/6 s关；离心：13680 × g、10 min、4°C；洗脱：250 mM咪唑；突变位点：Y270、S274、N277、D283、E284、E286、L363、I364、V384；DpnI消化：5 U、37°C、1 h
2.3 酶活测定与动力学分析
标准酶活测定在30°C下进行，缓冲液为含1 mM二硫苏糖醇（DTT）和1 mM MgCl₂的50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）。反应总体积200 μL（96孔板中进行）。反应混合物含乙醛（10 mM）、NAD⁺（1 mM）和CoA（0.2 mM），溶于50 mM Tris-HCl中，通过添加纯化酶（每反应2 μg）启动反应。使用酶标仪在340 nm监测NADH生成。一个酶活单位（U）定义为在上述条件下每分钟催化生成1 μmol NADH所需的酶量。动力学分析中，在固定饱和浓度NAD⁺（1.0 mM）条件下，测定一系列乙醛浓度（0–10 mM）的初始速度。初始速率从反应进程曲线的线性部分计算，并使用GraphPad Prism通过非线性回归拟合至Michaelis-Menten方程，获得表观米氏常数（K_M）和Vmax值。转换数（k_cat）由Vmax和测定中总酶浓度计算，催化效率表示为k_cat/K_M。数据以三次独立实验的平均值±SD表示。
【数据】测定温度：30°C；缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM DTT、1 mM MgCl₂；底物：乙醛10 mM、NAD⁺ 1 mM、CoA 0.2 mM；酶量：2 μg/反应；检测波长：340 nm；乙醛浓度范围：0–10 mM；NAD⁺浓度：1.0 mM
2.4 非靶向转录组分析
在与图1A所示相同的补料分批操作条件下（30°C，pH 4.8–5.0由自动氨水添加控制，通气量1 vvm（每分钟每体积培养液的空气体积），搅拌速度400 rpm），菌株BFSC0001在5 L生物反应器中培养。RNA-seq样品从同一补料分批发酵的两个代表性代谢状态采集，以捕获与溢出乙醇形成及后续乙醇再利用相关的碳源依赖性转录程序：葡萄糖主导状态（8 h；残留葡萄糖9.2 g L⁻¹；乙醇1.8 g L⁻¹）和葡萄糖耗尽后的乙醇再利用状态（24 h；残留葡萄糖低于检测限；乙醇7.1 g L⁻¹）。每个条件采集三个独立生物学重复。每个采样点快速取出25 mL培养物，细胞立即在4°C离心收集，用冰预冷PBS洗涤一次，液氮速冻，−80°C保存。冷冻细胞沉淀在干冰上运送至诺禾致源（北京）进行RNA提取、文库构建和测序。文库使用poly(A)选择制备，并在Illumina平台上测序生成150 bp双端读段。原始读段使用fastp（v0.19.7）进行质量过滤，参数为“-g -q 5 -u 50 -n 15 -l 150”。清洁读段使用HISAT2（v2.0.5）比对至酿酒酵母S288c参考基因组（R64–2−1），基因水平计数使用featureCounts（v1.5.0-p3）生成。差异表达分析使用DESeq2（v1.20.0）进行。|log2FC| > 1且校正P值（padj）< 0.05的基因定义为差异表达基因。GO和KEGG富集分析使用clusterProfiler（v3.8.1）进行，padj < 0.05为显著性阈值。测序质量指标和重复相关性分析见图S2。
【数据】生物反应器：5 L；温度：30°C；pH：4.8–5.0；通气量：1 vvm；搅拌：400 rpm；采样点：8 h（葡萄糖9.2 g L⁻¹、乙醇1.8 g L⁻¹）和24 h（葡萄糖低于检测限、乙醇7.1 g L⁻¹）；生物学重复：3；样品量：25 mL；测序读长：150 bp双端
2.5 补料分批发酵
补料分批发酵在5 L生物反应器（xCUBIO twin，BBi-biotech，Braun，德国）中进行，初始体积3 L。TMS1培养基含20 g L⁻¹葡萄糖，
【数据】生物反应器：5 L（xCUBIO twin）；初始体积：3 L；培养基：TMS1；葡萄糖：20 g L⁻¹
研究结果
3.1 基于转录组分析的菌株重构与机制解析
BFSC0001的补料分批发酵显示，当培养从葡萄糖利用转向乙醇消耗时，生长速率显著下降（图1A），表明碳分配存在阶段特异性调控。Crabtree效应相关的乙醇溢出是由碳分配、呼吸能力、ATP经济和氧化还原稳态的系统性失衡驱动的，而非单一反应步骤的限制。因此，该表型无法通过操纵单一途径有效解决。由于乙醇溢出通常反映全局转录调控、能量/氧化还原状态和碳通量分配的系统性失衡，仅靠途径层面的理性重构往往不足以解决Crabtree效应相关的乙醇溢出和积累问题。因此，在代表性碳源条件下对不同生长阶段进行转录组分析，以解析阶段依赖性调控变化并鉴定限制基因和功能模块。
候选靶点通过整合主成分分析（PCA）中生物学重复的聚类一致性（图1B）、热图中差异表达模式（图1C）以及与乙醇代谢和胞内乙酰辅酶A供应的功能相关性进行优先级排序。这些显著差异表达基因主要与丙酮酸代谢和PDH旁路相关，包括ADH2、ALD4、ACS1、ADH1和PDC1；葡萄糖摄取和糖酵解相关基因包括HXT1、HXK2和CDC19；呼吸调控以HAP4为代表；糖异生包括PCK1和MLS1；细胞壁或应激反应以SDH2为代表。总体而言，这些基因指向控制乙酰辅酶A和甲羟戊酸（MVA）途径所需糖酵解中间体分配的代谢和调控节点。
基于基因表达变化和已知基因功能，每个候选基因在菌株BFSC0001中过表达或敲除。单基因工程性能评估显示菌株间萜烯产量存在差异。其中，HAP4过表达效果最为显著，96 h时萜烯滴度提高至215.3 mg L⁻¹，较BFSC0001（179.1 mg L⁻¹）增加20.2%（图1D）。8 h和24 h的逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析显示，与呼吸和三羧酸（TCA）循环相关的代表性基因协调上调。相比之下，糖酵解和发酵的标志基因保持不变或仅轻微下调，这种转录对比在24 h更为明显（图1G）。5 L补料分批发酵的生理学证据进一步支持了这些转录变化——在乙醇再利用期间，BFSC0006较BFSC0001表现出更高的氧气摄取和更低的呼吸商（图1H）。综合来看，这些结果表明HAP4过表达在葡萄糖-乙醇转换期间促进呼吸相关代谢状态，从而增强乙醇再利用并将溢出碳重定向至生产性代谢。
相比之下，PCK1过表达菌株BFSC0003表现出生长受限，仅产生159.8 mg L⁻¹萜烯，较BFSC0001下降10.8%。由于有限的核苷酸前体供应（特别是嘧啶）在代谢重塑下可能限制酵母生长和产物形成，因此使用尿嘧啶补充进一步探究该表型。补充1 mM尿嘧啶使BFSC0003的萜烯滴度从159.8 mg L⁻¹恢复至181.4 mg L⁻¹（图1I），表明受损表型与嘧啶可用性有限一致，而非工程靶途径的直接限制。这一结果也表明，草酰乙酸过度转向糖异生可能损害嘧啶生物合成的前体供应，最终限制生产力。
相比之下，ADH2、ALD4和ACS1的过表达将萜烯滴度提高至184.9–195.5 mg L⁻¹，对应3.2–9.2%的提升。这些修饰在提高产物滴度的同时适度改善了生物量（图1F），表明通过乙醇再利用和PDH旁路的碳通量被更有效地引导以支持生长和萜烯生物合成。
在BFSC0006背景下进一步引入组合修饰后，菌株间表现出明显性能差异。携带HAP4过表达同时敲除CDC19或HXT1的菌株在前15 h生长与BFSC0006相当（图1L），但在15–60 h发酵阶段其生长较BFSC0006显著降低。这一结果表明，过度限制糖酵解进入或丙酮酸形成可能破坏生长与产物形成之间的平衡。相比之下，敲除HXK2（BFSC0009）和ADH1（BFSC0012）显著改善了发酵性能。60 h时，BFSC0009和BFSC0012分别达到234.8和245.6 mg L⁻¹的萜烯滴度，较BFSC0006分别增加31.1%和36.7%（图1J）。胞内乙酰辅酶A浓度分别增加50.4%和83.3%（图1K），支持了增强的乙醇再利用和呼吸通量。
总体而言，这些结果表明转录组引导的工程改造鉴定了控制乙醇溢出与乙醇再利用之间平衡的关键调控和代谢瓶颈。重要的是，这些修饰并非旨在通过消除乙醇产生来改善发酵性能——这种做法通常会损害细胞生长和生产力。相反，它们旨在增强乙醇积累后的再利用，从而将溢出碳重定向至生物合成代谢，同时保留足够的糖酵解通量以维持生长和能量供应。这种协调的重塑将部分溢出碳通量转向呼吸代谢，从而增加胞内乙酰辅酶A供应并促进萜烯生物合成。
【数据】HAP4过表达菌株：215.3 mg L⁻¹（96 h），较BFSC0001（179.1 mg L⁻¹）增加20.2%；PCK1过表达菌株：159.8 mg L⁻¹，下降10.8%；尿嘧啶补充（1 mM）后恢复至181.4 mg L⁻¹；ADH2/ALD4/ACS1过表达：184.9–195.5 mg L⁻¹，提升3.2–9.2%；BFSC0009（ΔHXK2）：234.8 mg L⁻¹（60 h），增加31.1%；BFSC0012（ΔADH1）：245.6 mg L⁻¹（60 h），增加36.7%；乙酰辅酶A增加：50.4%（BFSC0009）和83.3%（BFSC0012）
3.2 异源ADA酶的筛选与表达
虽然内源PDH旁路可以将乙醇回收为胞内乙酰辅酶A，但乙酰辅酶A合成酶（ACS）步骤消耗ATP，增加了乙醇再利用的能量成本。为避免这一ATP成本，研究引入乙酰化ADA，以ATP非依赖反应将乙醛直接转化为乙酰辅酶A，同时生成NADH（图2B）。来自Dickeya zeae的乙酰化ADA此前已被报道可催化该反应，以其作为查询序列在NCBI蛋白数据库中进行BLAST搜索。检索到的同源蛋白序列进行比对并基于氨基酸序列相似性进行系统发育分析，解析出几个不同分支（图2A）。由于这些分支反映的是ADA同源物之间的序列差异而非预先设定的生物体或功能类别，从每个主要分支选择一个代表序列在酿酒酵母中进行异源表达，从而能够在广泛的系统发育范围内进行功能评估，而不偏向任何单一来源生物。
使用乙醛作为底物的体外酶活测定显示，ADA同源物之间的比活在多达11.8倍范围内变化（图2E）。来自枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌的酶分别表现出比DzADA高9.3倍和11.8倍的活性，而其余候选酶的活性接近
【数据】比活差异：最高达11.8倍；枯草芽孢杆菌ADA：较DzADA高9.3倍；谷氨酸棒状杆菌ADA：较DzADA高11.8倍
讨论与解读
本研究将多种代谢与过程工程策略相结合，在酿酒酵母中回收Crabtree驱动的乙醇溢出并增强胞内乙酰辅酶A供应。在细胞层面，非靶向转录组与逆向代谢工程联用，通过过表达HAP4及引入和优化ADA加速乙醇利用，减轻乙醇转化为乙酰辅酶A的ATP需求负担，同时辅因子工程改善NAD(P)H再生。在发酵层面，基于DO的自动化补料控制策略和DO设定值优化实现了稳定的高细胞密度培养，使沉香螺醇滴度在5 L中提高至6.5 g L⁻¹、30 L补料分批生物反应器中达到5.7 g L⁻¹。该平台使多种下游萜类化合物的产量提高4.3–14.2倍。总体而言，这些结果为理性设计乙醇同化型酵母细胞工厂用于萜类及其他乙酰辅酶A衍生化学品的高效生物合成提供了通用且可扩展的框架。
编译者解读：该研究的核心价值在于将"问题"转化为"资源"——不试图消除Crabtree效应，而是通过转录组引导的逆向代谢工程高效回收溢出乙醇。HAP4过表达与ADA模块的组合策略体现了系统级思维：前者重塑碳代谢格局，后者以ATP非依赖方式打通乙醛→乙酰辅酶A的捷径。结构引导的酶工程进一步提升了模块效率，使乙醇消耗率提升53.6%、乙醇→乙酰辅酶A转化效率提高10.5倍。从合成生物学应用角度看，该策略的通用性（多种乙酰辅酶A衍生产物均受益）和可扩展性（30 L规模验证）使其具有明确的工业转化潜力。局限在于当前研究主要聚焦于萜烯类产物，该平台对其他乙酰辅酶A衍生化学品的适用性仍需更广泛验证。
参考来源
Feng P. Engineering reutilization of Crabtree-derived ethanol enhances acetyl-CoA supply and terpene production in Saccharomyces cerevisiae. Biochemical Engineering Journal, 2026.
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110337
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110337