来源：Efficient biosynthesis of ɑ-bisabolene in S. cerevisiae by combinatorial regulation of acetyl-CoA supply, bisabolene synthase expression, and bisabolene transportation（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
α-红没药烯是香料、药物和生物燃料的重要前体。本研究通过蛋白质融合表达、N端标签优化、竞争途径动态调控、乙酰-CoA供应强化及内源转运蛋白过表达等多层次代谢工程策略，在酿酒酵母中实现了α-红没药烯的高效合成。最终工程菌株在高密度发酵中产量达到58.64 g/L，较此前纪录提升3倍，胞外占比达95.7%，展示了微生物生产萜类燃料前体的工业可行性。
研究背景
红没药烯是植物来源的倍半萜烯，具有α、β、γ三种结构异构体，在植物中充当化学防御代谢物，同时也是香料、药物和生物燃料的多功能前体。α-红没药烯的加氢衍生物燃料性能与D2柴油相当，在可持续航空燃料领域具有应用前景。植物提取方式面临产量低、季节性波动和耕地竞争等问题，微生物合成成为可规模化的替代方案。此前工程酿酒酵母中α-红没药烯产量最高达18.6 g/L，但距离商业化仍有差距。将萜烯合酶与法尼基焦磷酸（FPP）合酶（Erg20）进行融合表达是促进倍半萜生物合成的有效策略，已在橙花叔醇和瓦伦烯合成中得到验证，但该策略是否适用于红没药烯尚不清楚。此外，植物来源的红没药烯合酶在酵母中可能存在功能性表达不足的问题。本研究针对上述瓶颈开展了系统性的代谢工程优化。
研究方法
2.1 菌株、培养基与试剂
所有酿酒酵母菌株详细信息见补充材料。α-红没药烯和角鲨烯标准品分别购自Witec（河南，中国）和Sigma-Aldrich（上海，中国）。其余试剂均为分析纯，购自国内供应商。PCR引物及测序服务由擎科生物（北京，中国）和优康生物（浙江，中国）提供。大肠杆菌TOP10（Novagen，美国）用于质粒扩增，在含抗生素的LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中于37°C培养。酿酒酵母菌株（BY4742、BY4741-C04、BY4742-C04、BY4742-M04）保藏于本实验室（Lv et al., 2016）。工程酵母菌株在添加氨基酸和抗生素的合成限定（SD）培养基（20 g/L葡萄糖、10% YNB）中培养。酵母培养物在30°C的YPD培养基（20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖）中培养并添加抗生素。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）；SD（20 g/L葡萄糖、10% YNB）；YPD（20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖）；温度：37°C（大肠杆菌）/30°C（酵母）
2.2 菌株构建
α-红没药烯合酶基因AgBIS（GenBank: AF006195.1）由清华大学李春教授惠赠，编码融合标签（MBP和GST）的基因由华大基因以酿酒酵母优化密码子合成。酵母内源基因从酿酒酵母BY4741基因组PCR扩增获得。基因组编辑使用PUMRI工具包（Lv et al., 2016）和CRISPR/Cas9系统。酵母转化采用LiAc/SS carrier DNA/PEG方法（Gietz & Schiestl, 2007）。重组菌株、质粒和引物详细信息见补充材料。二倍体菌株构建时，首先恢复由BY4741（MATa ura3Δ0 his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0）和BY4742（MATα ura3Δ0 his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0）构建的单倍体菌株中的URA3、HIS3、LEU2标记，然后以1:1比例混合，在YPD中于30°C温和振荡培养12小时。随后，在不含甲硫氨酸和赖氨酸的极限SD培养基平板上生长的原养型二倍体细胞通过PCR验证交配型位点和原养型恢复来确认。
【数据】混合比例：1:1；培养时间：12h；温度：30°C；培养基：YPD、SD（缺甲硫氨酸和赖氨酸）
2.3 摇瓶培养
预培养通过将单菌落接种到5 mL YPD中，于30°C、220 rpm培养16–24小时。初级培养物以OD600 0.05稀释至50 mL YPD中，在相同条件下培养24小时。生产阶段添加10%（v/v）十二烷，培养物在30°C、220 rpm条件下继续培养72–120小时，每日取样。如生育三烯酚研究（Jiao et al., 2022）所报道，培养基中蛋白胨的来源和批次显著影响α-红没药烯产量（见补充材料），导致同一菌株在不同时间进行的实验中产物滴度存在差异。为尽量减少培养基带来的影响，始终纳入一个对照菌株来评估每种工程策略的效果。
【数据】预培养：5 mL YPD，30°C，220 rpm，16–24h；初级培养：OD600 0.05，50 mL YPD，24h；生产培养：10%（v/v）十二烷，30°C，220 rpm，72–120h
2.4 分析方法
为分析胞外产物，将两相培养液离心分离水相和有机相。十二烷层与内标（邻苯二甲酸二丁酯）混合，过滤后用配备HP-5毛细管柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）的气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）分析。GC条件如下：氮气载气（0.1 MPa），氢气和空气检测器气体（各0.1 MPa），进样口温度250°C，检测器温度320°C，柱温程序（100°C保持1 min；40°C/min升至200°C，保持2 min；40°C/min升至300°C，保持3 min；40°C/min返回100°C）。胞内产物分析时，从1 mL培养液中离心收集细胞，加入200 μL丙酮和研磨珠，使用Tissue Lyser-24多样品研磨机（净信，上海，中国）在60 Hz下破碎5分钟。破碎后补加400 μL丙酮，样品在冰浴中超声处理10分钟。离心后取200 μL上清液，使用LNG-T83台式离心浓缩仪（华利达，上海，中国）蒸发至干。残留物用200 μL十二烷重新溶解，按上述GC-FID方法分析。角鲨烯定量时，细胞沉淀经洗涤后在乙腈中用氧化锆珠（0.1 mm + 0.5 mm，1:1比例）通过均质器（65 Hz，5 min）裂解。离心过滤后，样品用HPLC分析，使用Amethyst C18-H色谱柱（4.6 × 150 mm，5 μm），柱温40°C，流动相为100%乙腈（1 mL/min），检测波长195 nm。为研究两种融合构建体性能差异的可能原因，使用AlphaFold2-multimer预测Erg20-AGBIS和AGBIS-Erg20的结构。为比较分析AgBIS与Erg20融合前后的表达水平，以及Erg20-AgBIS在TRX1标签化前后的表达水平，将EGFP分别融合到AgBIS、AGBIS-Erg20、Erg20-AgBIS和TRX1-Erg20-AgBIS的C末端，随后基因组整合到菌株BY4742-C04中。转化子在YPD中培养，收集后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，稀释至OD600为1.0。使用Infinite M200 Pro NanoQuant（TECAN，瑞士）定量荧光信号，激发波长585 nm，发射波长620 nm。胞内ROS水平使用活性氧检测试剂盒（碧云天，上海，中国）测定。NADP(H)浓度使用相应的NADP+/NADPH检测试剂盒（碧云天，上海，中国）按制造商方案测定。
【数据】GC条件：进样口250°C，检测器320°C；细胞破碎：60 Hz，5 min；超声：冰浴10 min；角鲨烯提取：65 Hz，5 min；HPLC：40°C，100%乙腈，1 mL/min，195 nm；荧光检测：激发585 nm，发射620 nm
2.5 补料分批发酵
将单个二倍体菌落接种到5 mL YPD培养基中，于30°C、220 rpm培养12小时。该培养物作为种子培养的接种物，在YPD中于30°C、220 rpm培养至OD600达到8–10。种子培养物以10%（w/v）接种量转移至含有1.8 L发酵培养基的5 L生物反应器中，发酵培养基组成为：25 g/L葡萄糖、15 g/L (NH4)2SO4、8 g/L KH2PO4、6.15 g/L MgSO4·7H2O、3 g/L酵母提取物、5 g/L蛋白胨、5 mL/L微量元素溶液和3 mL/L维生素溶液（Xie et al., 2015）。补料溶液分别为560 g/L葡萄糖和75%（w/w）乙醇。采用两阶段发酵策略。在24小时时添加10%（v/v）十二烷以增强α-红没药烯的萃取。当乙醇浓度降至5 g/L以下时，启动与溶解氧（DO）联动的葡萄糖自动补料。在48小时时，碳源切换为75%（w/w）乙醇。补料速率设定为每30秒7.3 g葡萄糖和每20秒3.1 g乙醇。补料前，通过调节搅拌速度（200–600 rpm）将DO水平控制在40%。初始通气速率设定为1 vvm，补料开始后增加至2 vvm。补料阶段DO水平维持在30%以下。整个发酵过程中用氢氧化铵将pH控制在5。
【数据】种子培养：5 mL YPD，30°C，220 rpm，12h至OD600 8–10；接种量：10%（w/v）；发酵罐：5 L（装液1.8 L）；发酵培养基：25 g/L葡萄糖、15 g/L (NH4)2SO4、8 g/L KH2PO4、6.15 g/L MgSO4·7H2O、3 g/L酵母提取物、5 g/L蛋白胨；补料：560 g/L葡萄糖（7.3 g/30s）、75%乙醇（3.1 g/20s）；DO：补料前40%，补料后<30%；通气：初始1 vvm，补料后2 vvm；pH 5
研究结果
3.1 α-红没药烯生物合成途径的构建
将来自巨冷杉的α-红没药烯合酶基因AgBIS整合到菌株BY4742-C04（Lv et al., 2016）中——该菌株已过表达从ERG10到IDI1的完整MVA途径——构建了菌株C04-Ag。GC-MS分析确认了α-红没药烯的产生，其特征碎片图谱与标准品一致（图2A、B）。温度优化研究显示，30°C时α-红没药烯产量最高，摇瓶培养120小时后达到588.85 mg/L（图2C）。值得注意的是，这一初始基线滴度超过了早期酿酒酵母研究的起始菌株（<100 mg/L）（Peralta-Yahya et al., 2011），凸显了MVA途径过表达作为后续模块优化稳健起始底盘的价值。
【数据】菌株：C04-Ag；产量：588.85 mg/L；温度：30°C；时间：120h；对照基线：<100 mg/L
3.2 Erg20-AgBIS融合表达对α-红没药烯产量的影响
起始菌株BY4742-C04最初是为异戊二烯生产而构建的，其中IPP/DMAPP的合成得到增强，但其向FPP的进一步转化并未加强。单独过表达FPP合酶Erg20未能提高α-红没药烯产量，尽管生物量有所增加，这表明增强的FPP通量被分流至与细胞生长相关的竞争途径。为解决这一问题，构建了不同顺序的Erg20和AgBIS融合蛋白，即Erg20-AgBIS和AgBIS-Erg20（图2D），以促进从FPP合成到α-红没药烯转化的直接底物通道化。携带Erg20-AgBIS的菌株CEA和携带AgBIS-Erg20的菌株CAE分别产生899.50 mg/L和678.71 mg/L的α-红没药烯，较未融合的对照菌株C04-Ag分别显著提高了65.13%和24.60%（图2E）。为确定这种位置依赖性优势是由于表达水平改变还是内在催化效率增强所致，通过C末端EGFP标记定量了两种融合蛋白的体内表达水平。荧光定量结果显示，Erg20-AgBIS融合蛋白的表达水平略低于AgBIS-Erg20（见补充材料）。然而，Erg20-AgBIS菌株的α-红没药烯滴度显著更高（增加32.5%）。这一直接的体内证据有力地支持了滴度增加是由增强的内在催化效率和底物通道化而非翻译效率驱动的结论。这一实验观察与AlphaFold2-multimer预测完全吻合（见补充材料），预测显示Erg20-AgBIS构型中活性位点之间的距离更短。从生物学角度看，AgBIS的C末端紧邻对催化至关重要的保守结构域（McAndrew et al., 2011）。因此，将Erg20置于N末端可最大限度地减少对这些结构域的空间干扰，同时最大化活性位点之间的空间邻近性。与其他倍半萜融合研究相比，这一发现提供了关键的比较性见解。例如，虽然N末端萜烯合酶融合（如瓦伦烯合酶-Erg20）被证明对瓦伦烯生产是最优的（Chen et al., 2025），但本研究中Erg20-AgBIS（N末端FPP合酶）构型对α-红没药烯显著更优。这种差异凸显了底物通道化并非放之四海而皆准的通用工具；其有效性严格依赖于酶的种类，需要仔细考虑结构因素。最终，简单地将两种酶融合是不够的——序列顺序深刻影响催化结果。
【数据】菌株CEA（Erg20-AgBIS）：899.50 mg/L，较对照提高65.13%；菌株CAE（AgBIS-Erg20）：678.71 mg/L，较对照提高24.60%；Erg20-AgBIS较AgBIS-Erg20提高32.5%
3.3 N端融合标签增强α-红没药烯产量
植物来源酶在酵母宿主中往往表现出有限的功能性表达，这构成了异源途径的瓶颈（Butt et al., 2005）。为提高功能性Erg20-AgBIS融合蛋白水平，评估了四种N端融合标签：TRX1、SMT3（酵母SUMO）、GST和MBP，分别生成菌株YD01、YD02、YD03和YD04。菌株YD01中TRX1标记的融合蛋白将α-红没药烯滴度提高至937.63 mg/L，较未标记对照提高了11.9%（图2F）。相比之下，GST、SMT3和MBP标签表现出可忽略或不利的影响。为直接量化TRX1标签带来的表达增益，将EGFP融合到标记和未标记的构建体上并测量荧光强度。由于EGFP荧光严格依赖于蛋白质的正确折叠，这一直接的体内测量证实TRX1标记显著改善了Erg20-AgBIS融合蛋白的功能性表达和正确折叠（见补充材料）。这种改善可能源于TRX1的双重机制：通过分子伴侣样活性防止蛋白质错误折叠和聚集（Lauber et al., 2001），以及减少胞质环境中不适当的二硫键形成（Muller, 1991）。
【数据】菌株YD01（TRX1标签）：937.63 mg/L，较未标记对照提高11.9%；标签类型：TRX1、SMT3、GST、MBP
3.4 通过P HXT1介导的ERG9下调动态调控竞争途径
FPP是异戊二烯代谢中的关键分支点，通过角鲨烯合酶（Erg9）流向甾醇合成，或流向α-红没药烯等特化代谢物。为将代谢通量重定向至α-红没药烯生产，将菌株YD01中的天然ERG9启动子替换为葡萄糖诱导型P HXT1启动子，构建了对角鲨烯合成具有动态控制能力的菌株YD05。该设计与GAL80敲除背景下控制α-红没药烯合成的GAL启动子的葡萄糖阻遏特性相结合，预期能够实现葡萄糖响应的序贯代谢编程，在葡萄糖耗尽时将FPP通量从角鲨烯合成转向α-红没药烯生产（图3A）。结果显示，红没药烯滴度提高了14.9%至1.03 g/L，同时角鲨烯积累减少了75.6%（从110.30 mg/L降至26.87 mg/L）（图3B）。这种葡萄糖响应的序贯控制也已被证明对其他萜烯有效（Xie et al., 2015）。其机制优势在于双相代谢编程：在发酵早期高葡萄糖浓度下，ERG9表达得以维持以保留甾醇生物合成用于膜发生和细胞分裂；当葡萄糖耗尽时，P HXT1的抑制下调ERG9，同时GAL启动子的去阻遏激活合成途径基因。
【数据】菌株YD05：红没药烯1.03 g/L，提高14.9%；角鲨烯从110.30 mg/L降至26.87 mg/L，减少75.6%
3.5 内源转运蛋白的鉴定与工程改造以增强产物分泌
随着α-红没药烯滴度的提高，产物在细胞内的积累可能成为新的瓶颈。为增强产物分泌，系统过表达了多效耐药（PDR）亚家族ATP结合盒（ABC）转运蛋白成员——已知其参与甾醇摄取、脂质转运和多药耐药（Buechel & Pinkett, 2020），近期也被认为与萜类化合物分泌有关，如β-胡萝卜素（Bu et al., 2020）和生育三烯酚（Jiao et al., 2022）。单独过表达PDR调控因子Pdr1和PDR转运蛋白Snq2分别使α-红没药烯滴度增加了156.52 mg/L（23.4%）和44.87 mg/L（6.7%）（图4A）。在菌株YD01-11中共表达PDR1和SNQ2使α-红没药烯产量增加了214.89 mg/L（32.2%）。将转运蛋白工程与此前的优化（TRX1-EA表达盒和P HXT1介导的ERG9抑制）整合到菌株YD02-11中，与YD01-11相比，α-红没药烯滴度实现了124.3%的显著提升（1.16 g/L）。Snq2-Pdr1协同效应的机制基础具有启示性，并凸显了一个可推广的设计原则：Pdr1是PDR家族蛋白的关键转录调控因子，响应细胞应激上调Snq2及相关转运蛋白（Buechel & Pinkett, 2020）。本研究的共过表达策略可能放大了这一调控响应。对照菌株在胞内积累了相当比例的α-红没药烯（原文未详述具体数值）。
【数据】Pdr1过表达：+156.52 mg/L（+23.4%）；Snq2过表达：+44.87 mg/L（+6.7%）；PDR1+SNQ2共表达：+214.89 mg/L（+32.2%）；菌株YD02-11：1.16 g/L，较YD01-11提高124.3%
3.6 通过区室化或强化胞质乙酰-CoA合成来增强乙酰-CoA供应
（原文此节内容未完整提供，具体数据原文未详述。）
【数据】原文未详述
3.7 最终工程菌株的α-红没药烯产量
（原文此节内容未完整提供，具体数据原文未详述。）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过系统性的多层级代谢工程策略，在酿酒酵母中实现了α-红没药烯的高效合成。高密度发酵中58.64 g/L的产量较此前纪录提升3倍，0.50 g/L/h的体积生产率和超过95%的提取效率展示了工业可行性。研究的关键创新包括：ERG20-AgBIS融合蛋白的结构优化（顺序调整和N端修饰）克服了下游催化瓶颈；鉴定了酵母内源PDR家族蛋白（Pdr1和Snq2）用于α-红没药烯外排；系统比较分析揭示了胞质乙酰-CoA供应优于过氧化物酶体途径。通过将下游"拉动"与上游"推动"策略序贯整合并结合二倍体杂交，该工作为优化高价值异戊二烯类化合物提供了宿主特异的综合蓝图，也验证了微生物生物燃料的可行性。
编译者解读
该研究最值得借鉴之处在于"顺序敏感性"的发现——融合蛋白的排列方向显著影响催化效率，这提醒合成生物学工作者不能简单套用既有融合策略。Pdr1-Snq2内源转运蛋白的挖掘策略也为其他萜类产物的分泌工程提供了可迁移的靶点。58.64 g/L的成绩固然亮眼，但需要看到高密度发酵的工艺复杂度（两阶段碳源切换、DO联动补料）可能增加放大生产的成本。此外，原文部分章节（3.6和3.7）未完整提供，乙酰-CoA区室化比较与最终发酵的具体参数细节有待查阅全文确认。
参考来源
Wang, X. (2026). Efficient biosynthesis of ɑ-bisabolene in S. cerevisiae by combinatorial regulation of acetyl-CoA supply, bisabolene synthase expression, and bisabolene transportation. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135460
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135460