来源：Sustainable biosynthesis of levopimaradiene, a key precursor of bioactive ginkgolides, in Escherichia coli through cross-kingdom pathway engineering（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
银杏内酯是银杏中独有的二萜内酯类活性化合物，但因天然含量极低而供应受限。本研究在大肠杆菌中重构了银杏内酯关键前体左旋海松酸的从头生物合成途径，通过前体供给、酶工程、辅因子调控及发酵优化等多层次策略，将摇瓶产量从30.5 mg/L提升至114.1 mg/L，并在1.3 L补料分批发酵中达到618.5 mg/L，较原始菌株提高20.3倍，为复杂植物源活性化合物的微生物制造提供了可扩展路径。
研究背景
银杏内酯是仅存在于银杏中的独特植物源二萜内酯，因其强效的血小板活化因子受体拮抗活性，在缺血性脑卒中、冠状动脉粥样硬化等心脑血管疾病的治疗中具有重要前景。然而，其可持续获取面临重大挑战：当前工业生产主要依赖银杏叶提取，但银杏内酯在天然组织中含量极低，下游纯化复杂，且银杏树生长周期漫长；化学合成则因分子结构复杂、立体化学控制要求苛刻及多步合成流程冗长而缺乏实际生产价值。因此，开发银杏内酯或其关键生物合成前体的可持续替代生产路线具有重要意义。微生物合成生物学为银杏内酯及其生物合成中间体的供应提供了一条可持续且具有成本效益的替代路径。受益于银杏基因组测序的进展及途径相关基因的鉴定，银杏内酯前体在异源宿主中的重构合成成为可行策略。本研究聚焦于银杏内酯生物合成的关键前体——左旋海松酸（levopimaradiene），旨在通过系统性的途径工程与发酵优化，在大肠杆菌中实现其高效从头合成。
研究方法
2.1 化学试剂与材料
限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、PrimeSTAR Max DNA聚合酶及PCR试剂均购自Takara Bio Inc.（中国大连）。基因合成由Generay（中国上海）完成，引物由Sangon Biotech Co., Ltd.（中国上海）合成。1-二十碳烯（1-Eicosene）购自Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）。
【数据】试剂来源：Takara Bio Inc.、Generay、Sangon Biotech、Sigma-Aldrich；内标物：1-二十碳烯
2.2 质粒、菌株与培养条件
所用质粒与菌株列于表S1和S2。pETDuet-tac为pETDuet-1（Novagen, USA）的衍生载体，含有tac启动子，与pCDFDuet-tac共同用于构建体组装。克隆在大肠杆菌TOP10中进行，质粒扩繁在大肠杆菌DH5α中完成。培养使用Luria-Bertani（LB）培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl），添加1%（w/v）甘油及相应抗生素（34 mg/L氯霉素、100 mg/L氨苄青霉素）。过夜种子培养物按初始OD600 = 0.1接种至发酵培养基中，于37°C、200 rpm条件下培养。当OD600达到0.8–1.0时，加入0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和10%（v/v）十二烷。随后培养物于25°C继续培养72小时，除非另有说明。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）；甘油：1%（w/v）；抗生素：34 mg/L氯霉素、100 mg/L氨苄青霉素；接种OD600：0.1；温度：37°C；转速：200 rpm；诱导OD600：0.8–1.0；IPTG浓度：0.5 mM；十二烷：10%（v/v）；诱导温度：25°C；诱导时间：72 h
2.3 发酵产物的气相色谱-质谱定性与定量分析
由于缺乏商业化的左旋海松酸标准品，采用1-二十碳烯作为内标进行定量。该方法利用配备火焰离子化检测器（FID）的气相色谱，FID属于破坏性、质量敏感型检测器。因无左旋海松酸真实标准品，左旋海松酸以1-二十碳烯为内标、假定相对响应因子（RRF）为1.0进行定量。该方法基于C20烃的响应提供表观滴度估算。虽然烃类化合物的FID响应通常与碳含量相关，但分子结构、不饱和度及有效碳数也会影响检测器响应。因此，线性1-二十碳烯与三环左旋海松酸之间的结构差异可能会给绝对滴度值带来系统性不确定性。因此，所报道的左旋海松酸滴度为在上述分析假设下估算的表观滴度。然而，由于所有样品均以一致方式处理和分析，这些数值适用于比较工程菌株之间的相对产量差异。
样品在每个诱导期结束时及此后每24小时采集一次，直至培养72小时。72小时后，样品于12,000 × g离心5分钟，有机相通过配备FID的GC-MS（Agilent 7890）分析，使用DB-5 MS毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）。柱温初始为50°C（0 min），随后以15°C/min升至250°C并保持11分钟。检测器温度为300°C，分流比为10:1。目标产物左旋海松酸的出峰时间为12.54分钟（图S1）。分析物质（CAS 122712-77-0）与左旋海松酸CAS号匹配概率为90.94%，特征质谱峰与左旋海松酸一致，确证其为目标产物。
【数据】离心：12,000 × g，5 min；色谱柱：DB-5 MS（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；升温程序：50°C→250°C（15°C/min），保持11 min；检测器温度：300°C；分流比：10:1；出峰时间：12.54 min；CAS匹配率：90.94%
2.4 左旋海松酸生产的补料分批培养
挑取HLG02单菌落接种于5 mL LB培养基中，于37°C、250 rpm振荡培养过夜。随后将该种子培养物转移至50 mL新鲜TB培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养约12小时。当OD600达到15时，将种子培养物接种至含0.5 L AM无机盐培养基的1.3 L生物反应器（Dibeer Bioengineering Co., Ltd., Shanghai）中。AM培养基组成如下：4.2 g/L KH2PO4、15.7 g/L K2HPO4·H2O、2.0 g/L (NH4)2SO4、1.7 g/L柠檬酸、8.4 mg/L EDTA、20 g/L甘油、1.2 g/L MgSO4·7H2O、4.5 mg/L硫胺素·HCl及10 mL/L微量元素溶液（含0.25 g/L CoCl2·6H2O、1.5 g/L MnCl2·H2O等）。培养物补充相应抗生素（100 mg/L氨苄青霉素、50 mg/L链霉素及34 mg/L氯霉素）。
补料分批发酵在1.3 L生物反应器中进行，初始工作体积为0.5 L含20 g/L甘油的AM无机盐培养基。发酵温度和pH分别维持在37°C和7.0，pH通过自动添加25%氨水控制。溶解氧（DO）通过级联调节搅拌速度（300至1000 rpm）和通气速率（1至3 vvm）维持在约30%。当初始碳源耗尽（以DO升至60%以上为标志），自动启动脉冲补料，补料液含500 g/L甘油和12 g/L MgSO4·7H2O。补料脉冲用于维持约2–5 g/L的低残余甘油水平，以支持细胞生长同时降低碳源过量补加的风险。IPTG诱导在OD600 = 66时进行，并添加10%（v/v）正十二烷作为覆盖层用于原位产物萃取。在指定时间点采集样品，分析细胞生长和左旋海松酸产量。发酵过程中定期监测细胞密度、残余甘油（使用南京建成生物工程研究所试剂盒分析）及左旋海松酸浓度。
【数据】种子培养：5 mL LB，37°C，250 rpm，过夜；二级种子：50 mL TB，37°C，200 rpm，约12 h；接种OD600：15；反应器：1.3 L，工作体积0.5 L；培养基：AM无机盐（4.2 g/L KH2PO4、15.7 g/L K2HPO4·H2O、2.0 g/L (NH4)2SO4、1.7 g/L柠檬酸、8.4 mg/L EDTA、20 g/L甘油、1.2 g/L MgSO4·7H2O、4.5 mg/L硫胺素·HCl、10 mL/L微量元素）；抗生素：100 mg/L氨苄青霉素、50 mg/L链霉素、34 mg/L氯霉素；温度：37°C；pH：7.0（25%氨水控制）；DO：约30%（300–1000 rpm，1–3 vvm）；补料液：500 g/L甘油+12 g/L MgSO4·7H2O；残余甘油：2–5 g/L；诱导OD600：66；正十二烷：10%（v/v）
2.5 统计分析
所有用于菌株或条件比较的定量发酵实验均进行三次独立生物学重复（除非另有说明）。数据以平均值±标准差（SD）表示。统计分析使用SPSS 26.0软件进行。多组间差异通过单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey事后多重比较检验评估。P < 0.05认为差异具有统计学显著性。图中不同小写字母表示组间差异显著。
【数据】生物学重复：3次；统计方法：单因素方差分析+ Tukey事后检验；显著性阈值：P < 0.05
研究结果
3.1 大肠杆菌中左旋海松酸生物合成途径的重构
为增强左旋海松酸生物合成所需的GGPP供给，对I类和II类香叶基香叶基焦磷酸合酶（GGPPS）进行了评估。TcGGPPS（II类，来源于加拿大红豆杉Taxus canadensis）和MbGGPPS（I类，来源于Methanorelula boonei）因其不同的催化机制而被选为代表酶：TcGGPPS利用涉及FPP作为中间体的逐步延伸机制，而MbGGPPS催化持续性、单步GGPP形成，绕过FPP释放。为增加II类途径中前体FPP的供给，过表达了法尼基焦磷酸合酶IspA，假设这将特异性地驱动TcGGPPS依赖途径中的代谢流朝向GGPP。
GGPP向左旋海松酸的转化由拉布达二烯基焦磷酸合酶（LPS）驱动，具体为银杏左旋海松酸合酶（GbLPS），这是一种双功能I/II类酶，具有典型的αβγ模块化结构，同时含有DXDD（II类型）和DDXXD（I类型）催化基序。在II类活性位点（DXDD）中，GGPP经历质子化引发的环化生成(+)-柯巴基焦磷酸（CPP），随后在I类活性位点（DDXXD）中加工生成C8-杉木海松二烯基阳离子；随后的去质子化、重排或1,2-甲基迁移事件产生左旋海松酸。序列比对显示GbLPS（GenBank: AY574248.2）与GbLPIS之间具有高度一致性（99.54%）（图S2）。此外，GbLPMS被鉴定为源自GbLPS模板的双突变体（M593I/Y700F）。因此，对这三种LPS变体（GbLPS、GbLPIS和GbLPMS），连同两种GGPPS（TcGGPPS和MbGGPPS）及IspA进行了系统比较。目标基因经大肠杆菌密码子优化后合成，其详细序列信息和GenBank登录号见表S3。
计算工具预测GbLPDS中不存在典型的N端信号肽（图S3）。为增强在大肠杆菌中的胞质表达，我们从GbLPS变体中删除了79个氨基酸的N端质体信号肽，构建了GbLPS-Δ79构建体（图2A）。功能筛选鉴定出共表达GbLPS-Δ79和TcGGPPS的DHLI03菌株产生最高左旋海松酸滴度（30.5 mg/L），较亲本DHL01菌株提高21倍（图2B）。逐步过表达IspA进一步提高了滴度，表明FPP向GGPP的转化是关键代谢瓶颈。因此，携带TcGGPPS、IspA和GbLPS-Δ79的DHLI03被选为进一步途径优化的出发点。
【数据】最佳菌株：DHLI03（共表达GbLPS-Δ79 + TcGGPPS）；左旋海松酸滴度：30.5 mg/L；较亲本提高：21倍；N端信号肽删除：79个氨基酸；GbLPS与GbLPIS一致性：99.54%
3.2 通过LPS多酶工程提高左旋海松酸产量
真核萜烯合酶在大肠杆菌中的异源表达常伴随蛋白质溶解度差、折叠错误及催化活性低等问题，共同限制了微生物萜烯生物合成。为克服这些限制，已探索了多种工程策略，包括密码子优化、靶向肽去除、分子伴侣共表达及非必需区域的理性截短。在这些方法中，融合标签工程已成为提高可溶性表达和功能性酶产量的有效手段。大的增溶标签如MBP、GST和SUMO通常有助于重组蛋白的折叠和积累，但可能引入空间效应干扰酶构象或催化。相比之下，短极性或离子型前导肽（通常不超过15个氨基酸）可以在结构扰动小得多的情况下增强溶解度。例如，有报道称引入短前导肽可使二萜产量提高3.4倍。然而，融合标签的性能高度依赖上下文，其效果受标签序列、电荷分布、亲水性和连接位置的影响。一般而言，N端融合更有利于提高可溶性表达，而C端修饰更可能破坏结构域组织并损害催化功能。本研究中使用的融合标签序列列于表S4。
基于结构的建模和保守残基分析指导了对GbLPS中参与CPP转化和底物定位的残基进行半理性突变（I类和II类活性位点的详细分子对接模型见图S5和图S6）。大多数突变降低了左旋海松酸产量，表明GbLPS的催化口袋对氨基酸替换高度敏感（所有变体的全面筛选图谱详见图S7）。数个变体导致产物形成显著丧失，而其他变体表现出滴度和酶活性的中等程度降低，表明这些残基有助于催化口袋完整性、底物结合和产物选择性。值得注意的是，所有 tested 突变均未提高左旋海松酸产量或选择性。这些发现表明，扰动底物-酶相互作用、蛋白质稳定性或活性位点微环境容易损害GbLPS功能，并为该酶的未来工程提供了有益指导。
由于直接活性位点突变未能改善功能，我们测试了六种短融合标签——三种前导肽（链霉素腺苷酰转移酶前导肽SM、氯霉素乙酰转移酶前导肽CM、突变型CAT前导肽E1）和三种短极性/离子型标签（(Arg)5、(Glu)5、(Ser)5）——分别融合至GbLPS-Δ79的N端和C端。N端SM融合使左旋海松酸滴度提高约19.7%，从30.5 mg/L增至36.5 mg/L（图3A），而C端融合与对应N端融合相比均降低了滴度（图3B）。生长曲线显示各菌株之间无显著差异，表明滴度变化源于酶性能的改变而非宿主生理状态。位置不对称性表明GbLPS的C端对于结构域堆积或催化至关重要，易受C端修饰的干扰。相反，有益的N端SM*可能改善共翻译折叠、溶解度或与宿主折叠机器的相互作用。因此，短N端前导标签可以适度提高左旋海松酸产量，但标签身份和连接位点是关键决定因素，为未来文库设计提供了参考。
【数据】N端SM融合滴度：36.5 mg/L（较30.5 mg/L提高19.7%）；融合标签：SM、CM、E1、(Arg)5、(Glu)5、(Ser)5；C端融合效果：均降低产量；生长曲线：无显著差异
3.3 II类二萜合酶与GbLPS的组合配对增强左旋海松酸生物合成
不同二萜合酶（DiTPS）的组合表达可显著提高生物合成效率。序列分析显示GbLPS-Δ79和GbLPIS-Δ79为双功能I/II类酶，而GbLPDS为单功能I类酶。由于II类DiTPS生成(+)-柯巴基焦磷酸（(+)-CPP）中间体，随后由I类酶转化为左旋海松酸，我们假设向途径中补充高效的II类环化酶将扩大CPP池并驱动代谢流向左旋海松酸（图4）。为验证这一假设，我们将GbLPS-Δ79与四种候选酶共表达：银杏BIS2（GenBank: QFP98432.1）和BIS3（GenBank: QFP98433.1），以及细菌II类环化酶SaCPS（来源于Salinispora arenicola）和CLDB（来源于Streptomyces cyslabdanicus）（图5A）。在pETDuet-1系统中的初步评估显示，CLDB构建体产生48.0 mg/L左旋海松酸，而SaCPS仅提供边际增益。转换至pCDFDuet-1载体上的单顺反子排列进一步提高了产量。最佳菌株DHLAC20（表达CLDB）产生57.7 mg/L左旋海松酸。
【数据】CLDB构建体产量：48.0 mg/L（pETDuet-1系统）；最佳菌株DHLAC20产量：57.7 mg/L；候选II类酶：BIS2、BIS3、SaCPS、CLDB
3.4 辅因子NADPH调控对左旋海松酸产量的影响（基于摘要与结果衔接推断，结果节选止于此处，后续内容依据原文摘要与结论综合呈现）
左旋海松酸生物合成需要NADPH作为还原力。研究对大肠杆菌中NADPH代谢途径的关键限速酶进行了靶向调控，包括zwf（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、PNTAB（吡啶核苷酸氢化酶）和NADK（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶）（图6A）。通过系统优化NADPH再生，左旋海松酸滴度提高至65.2 mg/L。进一步对摇瓶培养条件进行优化——包括溶氧条件（圆底/挡板锥形瓶）、诱导时机（OD600范围：0.6–2.6）及IPTG浓度（图7）——将滴度提升至114.1 mg/L。
【数据】NADPH优化后滴度：65.2 mg/L；摇瓶优化后滴度：114.1 mg/L；诱导时机范围：OD600 0.6–2.6
3.5 1.3 L平行生物反应器中的扩大培养
在1.3 L平行生物反应器中进行了补料分批发酵扩大培养。发酵过程中定期监测细胞密度、残余甘油浓度及左旋海松酸产量。通过补料策略维持低残余甘油水平（约2–5 g/L），避免了碳源过量的风险。最终，可控的补料分批发酵实现了618.5 mg/L的左旋海松酸产量，较亲本菌株提高20.3倍（图8）。图中黑线、红线和蓝线分别代表甘油浓度、OD600和产量。
【数据】补料分批发酵产量：618.5 mg/L；较亲本提高：20.3倍；反应器：1.3 L；残余甘油：2–5 g/L
讨论与解读
本研究通过多层次系统优化，在大肠杆菌中建立了高效的左旋海松酸生物合成平台。通过前体途径优化、酶表达改善、跨物种途径工程、辅因子平衡及发酵调控的协同整合，左旋海松酸产量在摇瓶培养中从30.5 mg/L提高至114.1 mg/L，在补料分批发酵中达到618.5 mg/L。这些发现证明了协调的途径与工艺工程对微生物宿主中二萜生产的有效性。该工作为有价值银杏内酯前体的生产提供了可规模化路线，并有助于复杂植物源生物活性化合物的可持续生物合成。
编译者解读： 本研究展示了典型的合成生物学系统优化范式——从途径重构到酶工程再到发酵放大的层层递进逻辑清晰，特别是跨物种组合细菌II类环化酶与植物I/II类合酶的策略巧妙解决了双功能酶催化效率受限的问题。值得注意的是，作者对GbLPS活性位点进行半理性突变的所有变体均未提升产量，这一"阴性结果"的完整报告在同类研究中较为罕见，为后续酶工程提供了宝贵的负面参考。尽管以1-二十碳烯为内标的表观定量方法存在系统性偏差，但618.5 mg/L的产量在微生物合成二萜前体领域仍具竞争力。未来若能在产物原位萃取、CYP介导的下游氧化修饰等方面取得突破，将有望打通从简单碳源到银杏内酯的完整生物合成链条。
参考来源
Kong, X. (2026). Sustainable biosynthesis of levopimaradiene, a key precursor of bioactive ginkgolides, in Escherichia coli through cross-kingdom pathway engineering. Food Bioscience, 2026. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109896
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109896