来源：Precursor supply and translational machinery engineering of Saccharomyces cerevisiae for improving cellular protein content and biomass-based microbial protein bioproduction（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
微生物蛋白（MP）作为传统动植物蛋白的可持续替代方案，其生产核心在于高效积累胞内蛋白的微生物细胞工厂。本研究针对酿酒酵母天然蛋白含量有限的瓶颈，系统设计了多层级代谢工程策略：先通过基因组规模代谢模型预测并验证基因编辑靶点，再依次优化氮同化、TCA循环碳骨架供给、缬氨酰-tRNA合成酶表达及核糖体合成通路，最终结合二倍体化与转录调控因子SUT1整合，使工程菌株D3在5L生物反应器中蛋白含量峰值达75.2 g/100 g DCW，较亲本菌株Y1提升50.3%。该研究为高蛋白微生物菌株选育提供了无标记编辑与内源基因调控的关键靶点。
研究背景
全球食品与饲料蛋白需求持续增长，传统农业面临的环境约束日益凸显，可持续替代蛋白来源备受关注。微生物蛋白凭借资源效率高、可规模化生产等优势重新成为研究热点。在众多微生物宿主中，酿酒酵母凭借GRAS（公认安全）地位、清晰的遗传背景及悠久的工业发酵历史，成为极具吸引力的候选菌株。酵母生物量富含完全氨基酸谱系的蛋白质，同时含有维生素和矿物质等营养物质，是传统动植物蛋白的营养环保型替代品。然而，野生型酿酒酵母固有的蛋白含量成为主要瓶颈，限制了酵母基微生物蛋白生产的经济可行性。早期酵母蛋白生产主要依赖菌株适应与高通量筛选策略，但此类方法改造能力有限。因此，从代谢网络层面系统设计高蛋白含量酿酒酵母细胞工厂，是该领域的关键技术前沿。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
大肠杆菌Top10用于基因克隆与质粒扩增。本实验室保存的酿酒酵母尿嘧啶缺陷菌株Y1作为初始菌株。质粒构建采用Gibson Assembly方法。本研究所用全部质粒和引物分别列于表S2和表S3。大肠杆菌Top10在LB培养基中于37°C培养。酵母菌株常规维持于YPD培养基（2.0% w/v葡萄糖、1.0% w/v酵母提取物、2.0% w/v蛋白胨）中，30°C、220 rpm振荡培养。单菌落通过在YPD琼脂平板上划线获得。摇瓶发酵分析使用合成培养基，含有2.0%（w/v）葡萄糖、0.5%（w/v）硫酸铵、0.2%（w/v）磷酸二氢钾、0.1%（w/v）七水硫酸镁以及1×维生素和1×微量元素（储备液组成参照Verduyn等）。除非另有说明，所有化学试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
【数据】培养基：LB/YPD/合成培养基；培养温度：37°C（大肠杆菌）/30°C（酵母）；转速：220 rpm；葡萄糖：2.0% w/v；硫酸铵：0.5% w/v
2.2 菌株构建
采用CRISPR-Cas9技术进行酿酒酵母基因过表达与敲除。供体DNA片段包含目的基因及其上下游各1000 bp同源臂，通过融合聚合酶链式反应（PCR）构建，并与表达相应sgRNA的CRISPR-Cas9质粒共同转化。质粒与供体DNA采用LiAc/SS carrier DNA/PEG方法共转化至酵母细胞。转化子在相应的营养缺陷型培养基上筛选，遗传修饰通过菌落PCR和/或DNA测序验证。转化与验证后，通过在含5-氟乳清酸的YPD琼脂平板上进行反选择消除CRISPR质粒。
【数据】同源臂长度：1000 bp；转化方法：LiAc/SS carrier DNA/PEG；反选择试剂：5-氟乳清酸
2.3 计算机模拟代谢建模与靶点预测
本研究使用的模型在酵母9.0.2模型基础上进行部分修改。采用通量平衡分析进行计算机模拟。为鉴定增强蛋白合成的基因靶点，应用了OptForce算法。葡萄糖摄取速率限制为20 mmol/g DCW h⁻¹，蛋白合成反应（r_4047）设为目标函数。所有模拟使用COBRA Toolbox v3.0及Gurobi优化器在MATLAB R2019b环境中运行。
【数据】葡萄糖摄取速率：20 mmol/g DCW h⁻¹；目标反应：r_4047；软件：COBRA Toolbox v3.0/MATLAB R2019b
2.4 生长曲线测定
工程菌株的生长曲线在摇瓶培养中测定。挑取单菌落接种于2 mL新鲜合成培养基，30°C、220 rpm振荡培养16–18 h。该预培养物以初始OD600为0.05–0.10（约1.0% v/v）接种至250 mL锥形瓶中的50 mL新鲜合成培养基。培养物于30°C、220 rpm振荡培养，每8小时间隔测定OD600以监测生长。
【数据】预培养体积：2 mL；预培养时间：16–18 h；接种体积：50 mL/250 mL锥形瓶；初始OD600：0.05–0.10；测定间隔：8 h
2.5 蛋白含量测定
摇瓶培养物中总细胞蛋白含量采用凯氏定氮法测定。离心洗涤后，细胞沉淀冻干至恒重以获得干细胞重（DCW），称取部分干燥样品，用含0.2 g CuSO₄、3.0 g K₂SO₄和10 mL浓H₂SO₄的混合液于420°C消化约1 h。消化后冷却，采用全自动凯氏定氮仪进行碱化消化、蒸馏和滴定：加入40 mL 400.0 g/L NaOH，接收液为20 mL含混合指示剂的20.0 g/L硼酸，加20 mL稀释水，蒸馏时间5 min。总氮含量根据HCl滴定体积计算，粗蛋白含量乘以换算系数6.25获得。
【数据】消化试剂：0.2 g CuSO₄ + 3.0 g K₂SO₄ + 10 mL浓H₂SO₄；消化温度：420°C；消化时间：1 h；NaOH：40 mL 400.0 g/L；硼酸：20 mL 20.0 g/L；蒸馏时间：5 min；换算系数：6.25
2.6 氮源消耗分析
通过测定培养上清液中铵浓度确定氮源消耗。不同时间点取样后于10,000 rpm离心。所得上清液采用奈斯勒试剂法分析。奈斯勒试剂与样品中铵离子（NH₄⁺）反应形成棕黄色络合物，于420 nm处测定吸光度，基于标准曲线计算铵浓度。
【数据】离心转速：10,000 rpm；检测波长：420 nm
2.7 胞内氨基酸与α-酮戊二酸分析
胞内氨基酸和α-酮戊二酸浓度参照已建立方法分析。发酵液细胞沉淀经离心收集，重悬于无菌水中，用玻璃珠破碎。裂解液离心后，上清液用10%三氯乙酸（1:1 v/v）去蛋白，随后8,000 × g离心30 min。上清液经0.22 μm滤膜过滤，使用Agilent 1100氨基酸分析仪（Agilent，美国）分析。氨基酸分析时，摇瓶培养细胞经离心收集、洗涤并冻干。冻干细胞经水解后，使用氨基酸分析仪测定氨基酸组成。α-KG测定采用配备紫外检测器的HPLC分析，以5 mM H₂SO₄为流动相，流速0.6 mL min⁻¹，柱温40°C，检测波长210 nm。
【数据】去蛋白试剂：10%三氯乙酸（1:1 v/v）；离心：8,000 × g，30 min；滤膜：0.22 μm；HPLC流动相：5 mM H₂SO₄；流速：0.6 mL min⁻¹；柱温：40°C；检测波长：210 nm
2.8 二倍体菌株构建
二倍体菌株构建参照已有方法并加以修改。简言之，通过CRISPR/Cas9介导的基因替换将单倍体MATa菌株的交配型位点转换为MATα。将等量的MATa与所得MATα细胞混合于YPD液体培养基中，30°C孵育4–6 h以诱导交配。显微镜下观察到哑铃状细胞结合结构后，将混合物涂布于YPD平板培养。分离单菌落纯化后，通过三重引物PCR验证二倍体状态——使用一条通用引物（MAT-F）和两条交配型特异性引物（MAT-a和MAT-α）。二倍体通过同时扩增出544 bp（MATa）和404 bp（MATα）两个片段来确认。
【数据】交配温度：30°C；交配时间：4–6 h；PCR片段：544 bp（MATa）+ 404 bp（MATα）
2.9 5 L生物反应器补料分批发酵
在5-L生物反应器中进行补料分批发酵以评估菌株在受控条件下的性能。挑取单菌落接种于5 mL YPD培养基，30°C培养24 h。该预培养物转接至含50 mL YPD培养基的250 mL锥形瓶中培养20 h。所得培养物离心、洗涤并重悬，接种至生物反应器中1 L发酵培养基。初始发酵培养基（1 L）含有：10 g葡萄糖、10 g酵母提取物、10 g硫酸铵、8 g磷酸二氢钾、3 g硫酸镁、0.72 g七水硫酸锌、1 mL 1,000×微量金属溶液和1 mL 1,000×维生素溶液。发酵于30°C进行。通过自动添加15%氨水维持pH为5.0。通过调节搅拌速度（300–1000 rpm）和通气速率（1–3 vvm）维持溶解氧（DO）高于30.0%饱和度。含50%（w/v）葡萄糖、2.4 g/L CaCl₂和4.8 g/L KCl的补料溶液作为碳源。含20%（w/v）硫酸铵和10.0%（w/v）磷酸二氢铵的另一补料溶液提供氮源和磷源。搅拌和通气经调整以维持高DO水平，尤其在发酵后期。接种后4 h开始取样，每2小时间隔取样测定OD600、蛋白含量和乙醇浓度。
【数据】发酵体积：1 L；温度：30°C；pH：5.0（15%氨水自动维持）；DO：>30.0%饱和度；搅拌：300–1000 rpm；通气：1–3 vvm；补料碳源：50% w/v葡萄糖 + 2.4 g/L CaCl₂ + 4.8 g/L KCl；补料氮/磷源：20% w/v (NH₄)₂SO₄ + 10.0% w/v NH₄H₂PO₄；取样起始：接种后4 h；取样间隔：2 h
2.10 统计分析
（原文未详述具体统计方法）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 蛋白合成靶点的计算机模拟预测与实验验证
为系统提升酿酒酵母蛋白合成能力，将基因组规模代谢模型（GSMM）Yeast 9.0.2与计算预测工具OptForce整合。以蛋白合成为目标输出，对胞内代谢网络进行通量平衡分析，鉴定增强蛋白通量的关键基因靶点。通过预测与分析，共鉴定出5个基因敲除靶点和5个基因上调靶点（图1a）。值得注意的是，所有推荐上调的基因均编码氨酰-tRNA合成酶（AaRSs），包括ALA1（丙氨酰-tRNA合成酶）、VAS1（缬氨酰-tRNA合成酶）、GUS1（谷氨酰-tRNA合成酶）、KRS1（赖氨酰-tRNA合成酶）和ILS1（异亮氨酰-tRNA合成酶）。这些酶在翻译过程中催化特定氨基酸与对应tRNA的连接，生成氨酰-tRNA——蛋白合成的关键底物。因此，这些酶可能作为蛋白合成的限速因子。相比之下，预测的敲除靶点涉及多种代谢途径，具体包括：草酰乙酸转运蛋白OAC1、多胺转运蛋白TPO5、苹果酸脱氢酶MDH3（参与三羧酸循环，TCA循环）、d-核糖-5-磷酸3-差向异构酶RPE1（磷酸戊糖途径）和二磷酸核苷酸酶MET22（硫代谢）。这些靶点提示，重定向代谢碳氮流并减少副产物积累可能是提高蛋白合成效率的有效策略。
OptForce分析将AaRS基因优先列为上调靶点，因其在代谢网络中紧邻蛋白合成目标函数，成为实验验证的合理首选。我们假设，若翻译能力是主要瓶颈，增强tRNA负载将直接提升蛋白含量。为验证这些计算机预测，我们利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑构建了相应的基因过表达和敲除菌株（MET22敲除除外——因其导致严重生长受损而未开展）。摇瓶发酵分析显示，大多数工程菌株的蛋白产量高于亲本菌株Y1（0.8 g/L），而其蛋白含量（g/100 g DCW）保持不变甚至下降（图1b–e）。蛋白产量最高出现在AaRS过表达菌株中，特别是Y1-ILS1和Y1-GUS1，均达到0.9 g/L。这表明增强tRNA氨酰化可缓解翻译瓶颈。相比之下，多个敲除菌株蛋白含量下降，说明代谢碳和能量可能被分流至生物量形成而非蛋白合成。
蛋白产量与含量之间的脱钩表明，仅增强翻译能力不足以提高稳态蛋白浓度。额外的合成能力似乎优先流向生物量积累（细胞增殖），而非增加胞内蛋白密度。这种生物量驱动的稀释效应可能由多个相互关联的因素解释。第一，在前体供给（氨基酸和能量）受限条件下，翻译效率提升可能优先支持核糖体蛋白和生长相关因子的合成，从而加速细胞分裂和生物量形成。第二，如果蛋白合成速率未超过细胞体积增长率，快速生物量扩增必然稀释胞内蛋白库。第三，酵母细胞通过严密调控机制维持蛋白稳态；超过某一蛋白浓度阈值可能触发应激反应，限制进一步积累。
综合来看，这些发现表明蛋白合成机器与前体供给之间存在系统性失衡。单一AaRS的过表达可能产生代谢汇效应，不成比例地消耗其同源氨基酸库并引发代谢失衡，进而触发氨基酸饥饿并抑制全局翻译。互补地，中心碳代谢敲除突变体中蛋白含量的不足表明，氨基酸生物合成所需碳骨架供给存在关键缺口。因此，我们推断提升胞内蛋白含量从根本上受限于氨基酸前体的可得性。为解决这一核心限制，我们将策略从靶向单个酶转向中心代谢的整体重构，具体目标是提升氮同化效率并通过TCA循环增强碳骨架供给。
【数据】敲除靶点：5个（OAC1、TPO5、MDH3、RPE1、MET22）；上调靶点：5个（ALA1、VAS1、GUS1、KRS1、ILS1）；Y1蛋白产量：0.8 g/L；Y1-ILS1/Y1-GUS1蛋白产量：0.9 g/L
3.2 改造氮代谢以增强铵同化
在酿酒酵母中，高效蛋白合成高度依赖碳源和氮源的协同利用效率，这一过程主要由中心碳代谢和中心氮代谢途径的整合调控决定。中心氮代谢的核心在于谷氨酸（Glu）和谷氨酰胺（Gln）的合成与转化。作为细胞内最重要的氨基供体，谷氨酸的氨基氮构成细胞总氮的主要来源（约85%），通过转氨反应为其他氨基酸的合成提供氮。谷氨酰胺作为酰胺基载体，提供剩余约15%的细胞氮。胞内氮代谢通量强度直接决定氨基酸供给能力，进而影响蛋白合成速率。
为增强氮同化，我们过表达了谷氨酸/谷氨酰胺合成网络中的关键基因（GDH1、GDH2、GLN1、GLT1）。工程菌株生长无显著变化（图S2a），但铵消耗加速（图S2b），证实氮摄取增强。然而，该干预未显著提高胞内蛋白含量，各菌株蛋白含量仍接近亲本菌株Y1（48.4 g/100 g DCW，图S2c）。相反，所有突变体的DCW均出现显著且一致的增加，Y1-GLN1达到最高生物量1.9 g/L（图S2d）。这些结果表明，增强氮通量有效促进细胞增殖和总蛋白产量，但不足以提高蛋白含量，提示碳骨架供给在此条件下可能成为限制因素。
在前期单基因操作基础上，我们实施了氮同化途径的组合工程。构建了双基因（Y4：GLT1 + GDH1；Y5：GLT1 + GLN1）和三基因（Y6：GLT1 + GDH1 + GLN1）过表达菌株，以协同促进α-KG和氨向谷氨酸的生物合成。尽管组合菌株的生长基本不受影响（图2a），菌株Y6达到最高OD600和最快的铵消耗速率（图2b），表明其氮同化能力最大化。相应地，Y6也获得最高DCW，较亲本菌株Y1提高10.8%（图2d）。虽然所有组合菌株的蛋白含量保持稳定（图2c），但生物量的大幅增加使Y6获得最高总蛋白产量（较Y1提高11.6%）。这些结果证实，多基因策略可有效增强氮同化驱动的生物量积累，但单独增强氮代谢仍不足以突破蛋白含量的限制。
【数据】Y1蛋白含量：48.4 g/100 g DCW；Y1-GLN1最高DCW：1.9 g/L；Y6的DCW较Y1提高：10.8%；Y6总蛋白产量较Y1提高：11.6%
3.3 增强TCA循环对蛋白生物合成的影响
（原文节选未完整呈现此节全部内容，以下基于可获取的原文信息编译）
基于氮代谢工程的结果，碳骨架供给成为下一个改造靶点。TCA循环为氨基酸生物合成提供关键的碳骨架前体（如α-酮戊二酸、草酰乙酸）。通过增强TCA循环相关基因（如CIT1、IDH1），工程菌株的生长曲线、铵消耗谱及胞内蛋白含量如图3所示。
【数据】原文节选未完整呈现具体数值
3.4 增强核糖体合成对蛋白生产的影响
在解决前体供给问题后，翻译机器的效率成为进一步提升蛋白含量的关键。通过过表达转录因子IFH1增强核糖体合成通路，以及单拷贝40S核糖体亚基蛋白基因的过表达，工程菌株的蛋白含量如图4所示。IFH1过表达菌株的蛋白产量和DCW均有提升。
【数据】原文节选未完整呈现具体数值
3.5 二倍体菌株构建与转录因子SUT1增强
在单倍体水平的多层级改造基础上，本研究进一步通过二倍化策略提升蛋白含量。图5a展示了二倍体菌株构建流程示意图，图5b为二倍体菌株的凝胶电泳验证结果。二倍体酵母菌株的蛋白含量如图5c所示，蛋白产量如图5d所示。通过二倍化结合转录因子SUT1的整合增强，最终菌株D3在摇瓶培养中蛋白含量达到66.5 g/100 g DCW。
【数据】D3摇瓶蛋白含量：66.5 g/100 g DCW
3.6 D3菌株在5-L生物反应器中的性能
在受控的5 L生物反应器条件下，最终工程菌株D3的蛋白含量进一步提升至峰值75.2 g/100 g DCW，较亲本菌株Y1提高50.3%。图6显示了补料分批培养过程中细胞密度（OD600）、蛋白含量和乙醇浓度的时间曲线。
【数据】D3生物反应器蛋白含量峰值：75.2 g/100 g DCW；较Y1提升：50.3%
讨论与解读
本研究建立了涵盖前体供给平衡、翻译机器调控和二倍体菌株构建的多层级代谢工程策略。中心碳氮代谢的协调优化增强了前体供给，提升了蛋白含量；随后的核糖体生物合成与翻译效率强化进一步提高了蛋白含量。通过二倍化结合增强转录调控，最终菌株D3在5 L生物反应器条件下实现75.2 g/100 g DCW的蛋白含量，较亲本菌株提高50.3%。值得注意的是，在核糖体与翻译优化组合的菌株中，蛋白含量的大幅提升伴随生物量积累减少，反映了超高蛋白合成固有的代谢负担。该工程酵母菌株采用无标记基因组编辑、不引入外源DNA，也为高蛋白微生物菌株的筛选提供了关键进化工程靶点。
编译者解读：该研究的核心价值在于展示了"前体供给—翻译能力—细胞全局调控"三个层级在蛋白积累中的协同必要性——单一层级改造往往被代谢网络的其他瓶颈抵消。从合成生物学应用角度看，无标记编辑策略使该菌株无需外源抗性基因即可用于食品级微生物蛋白生产，降低了监管障碍。然而，超高蛋白含量伴随的生物量下降提示，蛋白积累与细胞生长的权衡可能是进一步提升产量的核心矛盾，未来或可通过动态调控策略在生长前期积累生物量、后期诱导蛋白合成来解耦这一矛盾。
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135462