来源：Biosynthetic pathway for bioactive tetrahydroxyflavanone 7-O-glucuronides in Scutellaria barbata（Bioorganic Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
半枝莲（Scutellaria barbata）富含的灯盏花素（Car）、异灯盏花素（Icar）及其7-O-葡萄糖醛酸苷是其主要活性黄酮组分，但生物合成途径长期不明。本研究整合代谢物 profiling、转录组引导的基因发掘、异源表达、酶学测定、VIGS 基因沉默及瞬时途径重建，完整解析了从柚皮素到目标产物的分支合成通路，并鉴定出关键酶 SbarCYP82D8 与 SbarUGAT。该工作为黄酮葡萄糖醛酸苷的异源代谢工程提供了酶学元件。
研究背景
半枝莲（Scutellaria barbata D. Don，唇形科）为多年生草本植物，长期用于中药以发挥清热、解毒、活血功效。植物化学研究表明其富含黄酮类化合物，包括黄酮、黄烷酮及其糖苷。灯盏花素（Car）、异灯盏花素（Icar）及其7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（Car-7-O-GlcA、Icar-7-O-GlcA）是半枝莲中最丰富的黄酮亚群之一。生物学功能方面，Car 和 Icar 具有抗氧化活性，Car 还兼具抗肿瘤活性。结构上，Car 和 Icar 分别是柚皮素 A 环 C-6 位和 C-8 位羟基化衍生物。葡萄糖醛酸化可显著提高水溶性并调节黄酮的生物利用度与疗效。然而，尽管这些化合物药理学价值显著且在植物中含量丰富，其共存的完整生物合成途径此前仍不清楚。结构分析提示柚皮素是该黄酮亚群的中心前体（图1A）。
研究方法
5.1 植物材料与化学试剂
成熟半枝莲植株采自中国河南省南阳市方城县，用于组织取样和 RNA-seq。用于 VIGS 实验的半枝莲植株及用于瞬时表达和途径重建的本氏烟（Nicotiana benthamiana）植株，均在南京中医药大学可控培养室中培养，光周期为 12 小时光照/12 小时黑暗，温度 25 °C。灯盏花素（Car；HPLC 纯度≥98%）、异灯盏花素（Icar；HPLC 纯度≥97%）、灯盏花素-7-O-葡萄糖醛酸苷（Car-7-O-GlcA；HPLC 纯度≥98%）和异灯盏花素-7-O-葡萄糖醛酸苷（Icar-7-O-GlcA；HPLC 纯度≥98%）标准品购自上海 Winherb Medical Technology Co., Ltd.（中国），其结构经供应商提供的 NMR 谱确认。其他化学品和标准品购自源叶生物科技有限公司（中国）、成都草源康生物科技有限公司（中国）和阿拉丁试剂有限公司（中国），除非另有说明。
【数据】植物来源：河南方城；培养条件：25°C，12h光照/12h黑暗；标准品纯度：Car≥98%，Icar≥97%，Car-7-O-GlcA≥98%，Icar-7-O-GlcA≥98%
5.2 LC–MS 和 HPLC 分析
高分辨 LC–MS 数据在配备 DAD 检测器的 Agilent 6546 TOF LC–MS 系统上采集。来自植物提取物（半枝莲或本氏烟）和酶学测定样品的分析采用电喷雾电离负离子模式。分离使用 ZORBAX RRHD SB-C18 色谱柱（2.1 × 100 mm，1.8 μm；Agilent），柱温 35 °C，流速 0.3 mL/min，流动相为含 0.1% 甲酸的水（A）和甲醇（B）。梯度程序为：5% B（0–1.5 min），5–30% B（1.5–8 min），30–90% B（8–25 min），90% B（25–28.5 min），90–5% B（28.5–29.5 min），5% B（29.5–30 min）。HPLC 分析在配备 DAD 检测器的 Agilent 1260 系统上进行，使用 Fisher Wharton FWXB 12S05–2546 C18 色谱柱（4.6 × 250 mm，5 μm）。流动相为含 0.1% 甲酸的水（A）和乙腈（B），洗脱梯度为 10–95% B（0–13 min），95% B（13–17 min），95–10% B（17–18 min），10% B（18–23 min），流速 0.8 mL/min。手性分离使用 Chiralcel OX-RH 反相手性柱（4.6 × 150 mm，5 μm，Daicel），流动相为含 0.1% 甲酸的水（A）和乙腈（B），等度组成 A/B = 70/30（v/v），流速 0.6 mL/min。
【数据】LC–MS柱温：35°C；流速：0.3 mL/min；HPLC流速：0.8 mL/min；手性分离流速：0.6 mL/min；流动相：0.1%甲酸水/甲醇或乙腈
5.3 半枝莲中 Car、Icar 及其 7-O-葡萄糖醛酸苷的定量
从成熟植株分别收取根、茎和叶（每个组织三个生物学重复）。每个重复取约 50 mg 新鲜组织，液氮速冻，冷冻干燥至恒重并记录干重。干燥组织用两枚 3 mm 不锈钢珠在 60 Hz 下研磨 30 s。代谢物用 500 μL 甲醇超声提取 1 h，离心（10,000 ×g，10 min），上清液进行 LC–MS 分析。绝对定量采用标准品制备的外标校准曲线。代谢物浓度按组织干重归一化，以 mg/g DW 表示。数据以三个生物学重复的平均值 ± SD 呈现。总代谢物浓度（每个生物学重复中 Car、Icar、Car-7-O-GlcA 和 Icar-7-O-GlcA 之和）在根、茎、叶之间的统计学差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行 Tukey 多重比较检验，P < 0.05 视为显著。
【数据】样品量：~50 mg鲜重；提取：500 μL甲醇超声1h；离心：10,000 ×g，10 min；统计：one-way ANOVA + Tukey检验，P < 0.05
5.4 RNA-seq、转录组组装与共表达分析
从成熟植株收集根、茎和叶（每个组织三个生物学重复），液氮速冻后干冰运送至武汉贝纳基因技术有限公司（中国）。使用 TRIZOL® 试剂（TIANGEN，中国）按说明书提取总 RNA。每个样品取 2 μg RNA，用 oligo(dT) 磁珠进行 poly(A) mRNA 富集。构建单链环状 DNA 文库，扩增为 DNA 纳米球，在 DNBSEQ-T7 平台（150 bp 双端）上测序。原始 reads 用 FastQC 进行质量检查。Clean reads 使用 HISAT 比对到半枝莲参考基因组（Genome Warehouse 登录号：GWHAOTP00000000）。基因表达量用 RSEM 定量并以 FPKM 表示。转录组组装用 StringTie 完成，编码序列用 TransDecoder 预测，注释比对至 GO、KEGG、Pathway、Nr、Pfam 和 UniProt 数据库。共表达分析使用该 RNA-seq 数据集。以 SbarCHS1 为诱饵基因，在 R（v4.4.2）中基于所有样品的 FPKM 值计算 Pearson 相关系数（PCCs）。
【数据】测序平台：DNBSEQ-T7，150 bp双端；RNA用量：2 μg/样品；参考基因组：GWHAOTP00000000；分析软件：HISAT、RSEM、StringTie、TransDecoder、R v4.4.2
5.5 系统发育分析
为鉴定半枝莲中的 UGT，在全基因组范围内筛选含有保守 Pfam PF00201 结构域的序列。候选序列进一步按长度（400–650 aa）过滤，共获得 123 个 UGT 用于系统发育分析。多序列比对使用 ClustalX2 进行。系统发育重建在 MEGA v6.0 中采用基于 JTT 矩阵模型的最大似然法完成，自展值 1000 次。进化树在 iTOL 中可视化。UGT 家族归属通过 BLASTP 比对至 Plant UGT 数据库（pUGTdb）中精选的植物 UGT 参考序列确定。
【数据】筛选条件：Pfam PF00201结构域 + 400–650 aa；UGT数量：123；系统发育方法：最大似然法，JTT模型，1000次自展
5.6 候选生物合成基因的克隆
使用 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent（Vazyme，中国）按说明书从成熟半枝莲叶片中提取总 RNA。第一链 cDNA 使用 Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Yeasen，中国）合成。候选生物合成基因的全长编码序列以 cDNA 为模板，用基因特异性引物（表 S2）通过 PCR 扩增，SbarCYP82D10 除外——该基因由商业合成。用于本氏烟瞬时表达的 PCR 扩增产物经 BsaI 线性化组装至植物双元载体 3 Ω1。用于大肠杆菌异源表达时，PCR 扩增产物经 SacI 和 SalI 线性化克隆至 pET-28a(+)，经 SspI 线性化克隆至 pMCSG9。用于酵母表达时，PCR 扩增产物经 SmaI 线性化插入 pESC-His。所有克隆步骤均使用 ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（Vazyme，中国）按说明书操作。重组质粒转化至化学感受态大肠杆菌 DH5α 细胞，在添加相应抗生素的 LB 琼脂上筛选。阳性克隆经菌落 PCR 筛选并由 Sanger 测序验证。
【数据】克隆载体：3 Ω1（植物）、pET-28a(+)/pMCSG9（大肠杆菌）、pESC-His（酵母）；线性化酶：BsaI、SacI/SalI、SspI、SmaI
5.7 农杆菌介导的本氏烟瞬时表达
携带候选基因的 3 Ω1 双元载体导入农杆菌 GV3101 菌株。转化子在添加利福平（25 μg/mL）、硫酸庆大霉素（30 μg/mL）和壮观霉素（100 μg/mL）的 LB 琼脂上于 28 °C 筛选培养 3 天。向平板加入 1 mL 无菌 LB 刮取菌苔收集菌体，10,000 ×g 离心沉淀。菌体沉淀重悬于农杆菌诱导缓冲液（50 mM MES，pH 5.5，10 mM MgCl₂，100 μM 乙酰丁香酮，0.5% D-葡萄糖），室温孵育 1 h。测定 OD600 并用诱导缓冲液调整密度后用于浸润。单基因表达时菌液稀释至 OD600 = 2.0。多基因共浸润进行从头生物合成时，各菌株稀释至 OD600 = 2.0 后等体积混合。农杆菌悬液浸润 5 周龄本氏烟叶片背面。除非另有说明，每个处理设三个生物学重复，每个重复为来自不同植株的独立浸润叶片。浸润叶片在浸润后 3 天收取用于代谢物分析。
【数据】抗生素：利福平25 μg/mL、庆大霉素30 μg/mL、壮观霉素100 μg/mL；诱导缓冲液：50 mM MES pH 5.5，10 mM MgCl₂，100 μM乙酰丁香酮，0.5% D-葡萄糖；OD600 = 2.0；浸润后3天收获
5.8 微生物宿主中的异源表达
候选 CHI 和 UGAT 基因在大肠杆菌中表达。
【数据】原文未详述
研究结果
2.1 Car、Icar 及其 7-O-葡萄糖醛酸苷的组织特异性积累
为考察目标代谢物的组织分布，我们通过 LC–MS 定量了半枝莲根、茎、叶中 Car、Icar、Car-7-O-GlcA 和 Icar-7-O-GlcA 的含量（图1B,C）。四种化合物在三个组织中均可检出，但浓度差异显著。叶片中总代谢物浓度最高，茎次之，根中仅检测到痕量（图1C）。这些结果表明 Car、Icar 及其 7-O-葡萄糖醛酸苷的积累主要发生在地上组织。
为支持候选基因发掘，我们对相同发育阶段收获的根、茎、叶进行了 RNA-seq。Clean reads 比对至半枝莲参考基因组（组装版本 GWHAOTP00000000），转录本丰度以 FPKM 定量。代谢物谱与转录组数据的整合使共表达分析成为可能，并有助于优先筛选可能参与 Car 和 Icar 骨架构建及葡萄糖醛酸化的候选基因。
【数据】组织分布：叶 > 茎 > 根（根中仅痕量）；定量方法：LC–MS外标校准；表达定量：FPKM
2.2 柚皮素骨架的生物合成
半枝莲基因组编码三个查尔酮合酶（CHS）同源基因 SbarCHS1、SbarCHS2 和 SbarCHS3。RNA-seq 分析显示，SbarCHS1（Sbar2C282T9）在茎和中高表达，根中表达极低；而 SbarCHS2（Sbar5A272T111）和 SbarCHS3（Sbar5A316T184）在所有组织中均弱表达（图2A）。该表达模式与 Car、Icar 及其葡萄糖醛酸苷的组织特异性积累（图1C）相平行，提示 SbarCHS1 是该途径的主要入口酶。
半枝莲基因组中注释的三个 CHS 同源基因均通过本氏烟瞬时表达及后续 LC–MS 分析进行功能筛选。表达 SbarCHS1 导致 m/z 271.0612 [M−H]⁻ 的次要峰（对应柚皮素）和 m/z 433.1140 [M−H]⁻ 的主要峰（鉴定为 prunin，即柚皮素-7-O-葡萄糖苷）的积累（图2B）。饲喂实验表明，柚皮素在本氏烟叶片中被高效转化为 prunin，可能由内源 UDP-糖基转移酶催化（图 S1）。CHS 的直接产物柚皮素查尔酮未被检测到，这与快速的非酶促环化（图 S2）和/或内源 CHI 活性转化一致。相比之下，表达 SbarCHS2 或 SbarCHS3 未产生可检测的黄酮类产物（图2B）。这些结果确定 SbarCHS1 是为下游生物合成提供查尔酮前体的功能性 CHS。
为鉴定查尔酮异构酶（CHI），我们在基因组中搜索含有 CHI Pfam 结构域（PF02431）的蛋白，鉴定出两个候选基因 Sbar1A223T166 和 Sbar5A47T51。由于两个候选基因均与 SbarCHS1 在组织间表现出强共表达（Pearson 相关系数 ≥ 0.9；图2C），它们被选作生化表征对象。重组蛋白在大肠杆菌中表达并经 Ni²⁺-亲和层析纯化（图 S3）。以柚皮素查尔酮为底物的体外测定表明，Sbar1A223T166 高效产生 (2S)-柚皮素，而 Sbar5A47T51 除自发的外消旋环化外未显示可检测的催化活性（图2D）。动力学分析显示，Sbar1A223T166 使查尔酮环闭合加速超过未催化反应的 10⁶ 倍（表 S1；图 S4）。因此我们将 Sbar1A223T166 命名为 SbarCHI。综上，SbarCHS1 和 SbarCHI 构成半枝莲中柚皮素形成的核心模块：SbarCHS1 提供源自苯丙烷前体的查尔酮骨架，SbarCHI 催化立体特异性环化产生 (2S)-柚皮素，为后续 A 环多样化奠定上游框架（图2E）。
【数据】SbarCHS1组织表达：茎叶高、根极低；SbarCHS2/3：全组织弱表达；共表达PCC ≥ 0.9；SbarCHI加速环化 >10⁶倍；产物：(2S)-柚皮素
2.3 SbarCYP82D 单加氧酶对柚皮素的区域选择性羟基化
柚皮素形成后，需要 C-6 或 C-8 位区域选择性羟基化以生成 Car 或 Icar。半枝莲基因组编码 10 个 CYP82D 基因（SbarCYP82D1 至 SbarCYP82D10），其中数个此前已被认为与黄酮羟基化有关。然而，它们在黄烷酮修饰中的作用及在植物体内的相对贡献尚不清楚。转录组分析揭示了 SbarCYP82D 基因间不同的组织特异性表达模式（图3A）。SbarCYP82D8 在茎和中强表达，而 SbarCYP82D2 主要在根中表达。SbarCYP82D1、D3、D5、D9 和 D10 在所检组织中表达水平可检测，而 SbarCYP82D4、D6 和 D7 在茎和中几乎检测不到。
鉴于目标代谢物在叶片中富集，我们进一步通过 RT-qPCR 定量了叶片中的 CYP82D 转录水平。与 RNA-seq 数据一致，SbarCYP82D8 转录本丰度最高，其余亚型表达水平低得多，其中 SbarCYP82D4/6/7 在叶片中不可检测（图3B）。据此，选择在叶片中有可检测表达的 7 个 CYP82D 基因（SbarCYP82D1、D2、D3、D5、D8、D9 和 D10）进行功能表征。每个选定基因在酿酒酵母 WAT11 中异源表达，饲喂柚皮素的培养物经 LC–MS 分析。SbarCYP82D1 和 SbarCYP82D8 催化柚皮素 6-羟基化产生 Car，而 SbarCYP82D5 通过 8-羟基化生成 Icar（图3C）。在测试条件下，SbarCYP82D2、D3、D9 或 D10 未检测到羟基化产物。这些结果将 SbarCYP82D1 和 SbarCYP82D8 鉴定为柚皮素 6-羟化酶，将 SbarCYP82D5 鉴定为柚皮素 8-羟化酶。
为进一步比较酶促效率，对表达 SbarCYP82D1、SbarCYP82D5 或 SbarCYP82D8 的酵母微粒体级分以柚皮素为底物进行动力学分析（表1；图 S5）。SbarCYP82D1 和 SbarCYP82D8 的催化效率相当（Vmax/KM 分别为 0.528 和 0.431 pkat mg⁻¹ μM⁻¹）。相比之下，SbarCYP82D5 的催化效率显著更高（4.65 pkat mg⁻¹ μM⁻¹），表明其体外固有周转能力更优。值得注意的是，Car 和 Icar 在测定条件下发生自发互变（图3D），表明两种苷元之间存在动态平衡。结合 SbarCYP82D8 在叶片中显著更高的表达水平（比 SbarCYP82D1 高约 20 倍，比 SbarCYP82D5 高约 900 倍；图3B），这些结果表明 SbarCYP82D8 是参与植物体内 Car 和 Icar 积累的羟基化途径的优势催化剂（图3E）。
【数据】SbarCYP82D1 Vmax/KM = 0.528 pkat mg⁻¹ μM⁻¹；SbarCYP82D8 Vmax/KM = 0.431 pkat mg⁻¹ μM⁻¹；SbarCYP82D5 Vmax/KM = 4.65 pkat mg⁻¹ μM⁻¹；叶片表达比：D8比D1高~20倍，比D5高~900倍
2.4 负责 Car 和 Icar 7-O-葡萄糖醛酸化的 SbarUGAT 的鉴定
Car 和 Icar 转化为相应的 7-O-葡萄糖醛酸苷预计由 UDP-依赖的葡萄糖醛酸基转移酶（UGAT）介导。为鉴定半枝莲中负责该反应的酶，我们进行了全基因组范围的含有保守 Pfam PF00201 结构域的 UDP-糖基转移酶（UGT）搜索。共鉴定出 123 个推定 UGT 基因，编码 400–650 个氨基酸的蛋白，基于系统发育分析分为 21 个 UGT 家族（图4A），其中 UGT88 家族有 14 个成员。鉴于 Car-7-O-GlcA 和 Icar-7-O-GlcA 在叶片中丰度较高，我们聚焦于与 SbarCHS1 共表达（Pearson 相关系数 ≥ 0.5）且在至少一个叶片重复中表达量较高（FPKM ≥ 10；log2(FPKM+1) ≥ 3.5）的 UGT88 基因。该筛选策略得到三个候选基因 Sbar5P182T104、Sbar5P164T37 和 Sbar3P211T30 用于功能表征（图4B）。重组蛋白在大肠杆菌中表达进行活性筛选。Sbar5P164T37 获得了……
【数据】UGT总数：123个，分属21个家族；UGT88家族：14个成员；筛选阈值：PCC ≥ 0.5，FPKM ≥ 10；候选基因：3个
讨论与解读
Car、Icar 及其各自的 7-O-葡萄糖醛酸苷是半枝莲的主要黄酮成分，该药用植物的药理特性与其黄酮密切相关。本研究通过整合转录组引导的候选基因优先排序、酶学表征、遗传验证和异源途径重建，阐明了这些黄酮在植物中的生物合成途径。该途径遵循黄酮代谢的经典逻辑：CHS 和 CHI 介导黄烷酮骨架柚皮素的形成，随后经 P450 催化的区域选择性 A 环羟基化和 UGAT 催化的末端葡萄糖醛酸化。数据确立了 SbarCHS1 和 SbarCHI 作为半枝莲中柚皮素形成的核心模块。SbarCHS1 的转录丰度与黄酮积累高度相关，其沉默显著降低下游黄酮水平。SbarCHI 使环化加速超过 10⁶ 倍并强制立体特异性生成 (2S)-柚皮素。区域选择性 A 环羟基化反应由 CYP82D 家族成员完成，其中 SbarCYP82D8 因叶片中极高表达而成为优势催化酶。非酶促互变现象提示化学平衡对该分支途径也有贡献。
编译者解读：该研究为药用植物来源的葡萄糖醛酸苷类黄酮提供了从基因到产物的完整通路解析，方法学上"转录组共表达筛选+VIGS 体内验证+本氏烟异源重建"的组合策略值得借鉴。值得注意的是 SbarCYP82D8 在叶片中超高表达（比 D5 高约 900 倍）与 SbarCYP82D5 体外更高催化效率之间的反差，提示体内通量受转录水平主导而非单纯酶动力学控制。SbarUGAT 对两种羟基化黄烷酮的双重底物特异性及 SbarUGDH 共表达增强产物积累的发现，为后续在微生物或植物底盘中进行黄酮葡萄糖醛酸苷的异源合成提供了直接可用的酶元件。不足之处在于原文未详述 SbarUGAT 的动力学参数及 UGDH 共表达的具体增强倍数，这些数据对代谢工程的定量优化至关重要。
参考来源
Han, Y. B. Biosynthetic pathway for bioactive tetrahydroxyflavanone 7-O-glucuronides in Scutellaria barbata. Bioorganic Chemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.bioorg.2026.110292
DOI: 10.1016/j.bioorg.2026.110292