来源：Structural characterization and predicted biosynthetic pathway of the polysaccharide component of bioflocculant from starch-degrading Bacillus subtilis ZHX3（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
生物絮凝剂因可降解、无毒、安全高效而备受关注，但生产成本高企限制了其应用。本研究从市政污泥中分离的枯草芽孢杆菌ZHX3出发，系统解析了其生物絮凝剂MBF-ZHX3中多糖组分的化学结构——获得两种均一组分PS1–1（5982 Da）和PS2–1（17,577 Da），主链均为→4)-α-D-Glcp-(1→，并在O-6位连接α-D-Glcp-(1→分支。结合全基因组测序与qPCR转录分析，研究预测了该多糖的完整生物合成通路，锁定epsL、epsF、epsG为未来基因工程改造的优先靶点。
研究背景
工业化与城市化加速推进，水污染问题日益严峻。絮凝法因经济、易实施、耗时短，已成功应用于食品加工、制药、化妆品等废水处理。传统无机和有机絮凝剂存在二次污染风险——无机絮凝剂中的铝盐可能诱发阿尔茨海默病，有机絮凝剂中的丙烯酰胺单体对人体具有严重神经毒性。近年来，生物絮凝剂因其可生物降解、无毒、安全、高效等特性受到广泛关注。细菌、放线菌、藻类和真菌在生长过程中常分泌生物絮凝剂作为副产物，其成分主要包括多糖、蛋白质、脂质和核酸。与多肽类及蛋白类絮凝剂相比，多糖类生物絮凝剂具有热稳定性好、分子结构特征优良、不易受外界因素影响等优势。然而，生产成本高是制约其应用的关键瓶颈——解析生物合成通路是实现菌株定向改造的前提。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
枯草芽孢杆菌ZHX3最初分离自市政污泥，保存于−80°C、20%甘油中。在生物絮凝剂产生培养基中培养，培养基组成为：10 g/L可溶性淀粉、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl、3.25 mg/L FeCl₃，培养条件为30°C、150 rpm恒温振荡培养箱。LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）作为对照。菌株ZHX3在LB培养基中不能产生生物絮凝剂。
【数据】菌株：B. subtilis ZHX3；培养基：10 g/L可溶性淀粉+5 g/L酵母提取物+5 g/L NaCl+3.25 mg/L FeCl₃；温度：30°C；转速：150 rpm；对照培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨+5 g/L酵母提取物+5 g/L NaCl）
2.2 MBF-ZHX3蛋白组分的去除
在生物絮凝剂产生培养基中培养3天后，发酵液上清通过离心获得（10,000 g，4°C，15 min）。上清与四倍体积的95%乙醇混合，4°C静置过夜以沉淀MBF-ZHX3。沉淀经离心收集（10,000 g，4°C，15 min）后重新溶解于蒸馏水中。MBF-ZHX3溶液与Sevag试剂（正丁醇:氯仿 = 4:1，v/v）按4:1比例（样品:试剂）充分混合八次以去除蛋白质。去蛋白后的溶液对蒸馏水透析，冻干获得粗多糖，供进一步纯化使用。
【数据】离心：10,000 g、4°C、15 min；乙醇浓度：95%；乙醇体积：4倍；Sevag试剂配比：正丁醇:氯仿=4:1；样品:试剂=4:1；去蛋白次数：8次
2.3 粗多糖热重分析
粗多糖的热重分析（TG）、差热分析（DTA）和微商热重分析（DTG）使用热重分析仪（Netzsch STA-449F3，德国）进行。样品量为10 mg，从30°C加热至900°C，升温速率20°C/min，气体流速45 mL/min。
【数据】样品量：10 mg；升温范围：30–900°C；升温速率：20°C/min；气体流速：45 mL/min
2.4 粗多糖的分离与纯化
粗多糖以10 mg/mL浓度上样，首先经DEAE纤维素DE-52阴离子交换柱（30 cm × 2.6 cm）分级，依次以超纯水、0.1 M NaCl和0.2 M NaCl为洗脱液，流速1 mL/min。洗脱液自动收集（6 mL/管）。采用苯酚-硫酸法在490 nm处检测糖含量。获得两个组分（PS-1和PS-2），浓缩后进一步经Sephadex G-100凝胶柱（60 cm × 2.6 cm）纯化，以超纯水为洗脱液，流速0.5 mL/min，分别获得PS1–1和PS2–1。收集的PS1–1和PS2–1经浓缩、透析、冻干，供进一步分析使用。
【数据】粗多糖浓度：10 mg/mL；DE-52柱规格：30 cm×2.6 cm；洗脱液：超纯水、0.1 M NaCl、0.2 M NaCl；流速：1 mL/min；收集量：6 mL/管；检测波长：490 nm；Sephadex G-100柱规格：60 cm×2.6 cm；洗脱流速：0.5 mL/min
2.5 纯化PS1–1和PS2–1的理化分析
#### 2.5.1 均一性与分子量分析
多糖的均一性和分子量采用高效凝胶过滤色谱（HPGFC）测定，仪器为Waters 2695高效液相色谱系统（Waters Corporation，美国），配备示差折光检测器、Empower工作站和两根串联的Ultrahydrogel™ Linear柱（300 mm × 7.8 mm，10 μm）。柱温维持45°C。流动相为0.1 N NaNO₃，流速0.5 mL/min。使用葡聚糖标准品（葡萄糖180、Dextran T-5、Dextran T-10、Dextran T-150、Dextran T-300）绘制标准曲线。
【数据】色谱柱：Ultrahydrogel™ Linear（300 mm×7.8 mm，10 μm）×2串联；柱温：45°C；流动相：0.1 N NaNO₃；流速：0.5 mL/min；标准品：葡萄糖180、Dextran T-5/T-10/T-150/T-300
#### 2.5.2 单糖组成分析
单糖组成采用高效阴离子交换色谱（HPAEC）（Thermo ICS5000+，Thermo Fisher Scientific，美国）联用脉冲安培检测器（PAD）测定，配备Dionex™ CarboPac™ PA20分析柱（150 mm × 3.0 mm，10 μm）。流动相A为0.1 M NaOH，流动相B为含0.2 M NaOAc（乙酸钠）的0.1 M NaOH。流速维持在0.5 mL/min。单糖通过与标准糖保留时间比对进行鉴定。
【数据】色谱柱：CarboPac™ PA20（150 mm×3.0 mm，10 μm）；流动相A：0.1 M NaOH；流动相B：0.1 M NaOH+0.2 M NaOAc；流速：0.5 mL/min
#### 2.5.3 官能团分析
取1 mg干燥样品与100 mg KBr混合，充分研磨后压片。制备的压片用傅里叶变换红外光谱仪（NEXUS 670，Niclet，美国）扫描，分辨率2 cm⁻¹，扫描范围4000–400 cm⁻¹。
【数据】样品量：1 mg；KBr用量：100 mg；分辨率：2 cm⁻¹；扫描范围：4000–400 cm⁻¹
#### 2.5.4 甲基化分析
甲基化分析参照Needs和Selvendran的方法[17]并稍作修改。简要流程如下：取10 mg多糖样品与2 mL二甲基亚砜（DMSO）混合，超声溶解。然后加入NaOH的DMSO悬浮液，超声处理2 h。随后加入2 mL碘甲烷，避光继续超声30 min。加入1 mL蒸馏水终止反应。经透析、浓缩、冻干后，甲基化样品用FT-IR光谱分析确认甲基化反应是否完全。完全甲基化的样品溶于90%甲酸溶液，于110°C解聚6 h。加入3 mL 2 M三氟乙酸（TFA），于110°C水解4 h。水解后加入NaBH₄，室温还原3 h。加入乙酸中和终止还原反应。样品在真空干燥箱中干燥。乙酰化在100°C下进行2 h，使用乙酸酐与吡啶1:1（v/v）溶液。乙酰化样品用二氯甲烷与蒸馏水1:1（v/v）混合液萃取，重复萃取三次。最终产物溶于二氯甲烷，进行GC–MS分析。
【数据】样品量：10 mg；DMSO：2 mL；NaOH-DMSO超声：2 h；碘甲烷：2 mL，避光超声30 min；终止：1 mL蒸馏水；解聚：90%甲酸、110°C、6 h；水解：2 M TFA 3 mL、110°C、4 h；还原：NaBH₄、室温、3 h；乙酰化：乙酸酐:吡啶=1:1、100°C、2 h；萃取：二氯甲烷:水=1:1，重复3次
#### 2.5.5 ¹H核磁共振（NMR）波谱
纯化多糖组分（PS1–1和PS2–1）溶于D₂O（99.9%）后，在Bruker Avance III 600 MHz波谱仪（Bruker，德国）上记录¹H NMR谱。化学位移以“parts per million”（ppm）表示。
【数据】溶剂：D₂O（99.9%）；仪器：Bruker Avance III 600 MHz
2.6 枯草芽孢杆菌ZHX3全基因组测序
将培养至对数生长期的枯草芽孢杆菌ZHX3总DNA用Qiagen试剂盒按说明书提取。DNA纯度用NanoDrop 2000分光光度计测定，DNA浓度用Qubit荧光计测量。高质量DNA（无降解，OD₂₆₀/₂₈₀ = 1.8–2.0，OD₂₆₀/₂₃₀ = 2.0–2.2，总量≥10 μg）送至Nextomics Bioscience Co., Ltd.进行de novo测序（Oxford Nanopore平台）。染色体、质粒、tRNA和rRNA的编码序列（CDSs）分别使用Prodigal（v 2.6.3）、GeneMarkS、tRNAscan-SE（v 2.0）和RNAmmer（v 1.2）预测。使用Rpsblast、InterProScan（v5.25–64.0）和BLASTP分别将预测的CDSs比对至COG、GO和KEGG数据库进行功能注释。蛋白质跨膜结构域使用在线工具TMHMM-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）预测。
【数据】DNA质量标准：OD₂₆₀/₂₈₀=1.8–2.0，OD₂₆₀/₂₃₀=2.0–2.2，总量≥10 μg；测序平台：Oxford Nanopore；注释工具：Prodigal v2.6.3、GeneMarkS、tRNAscan-SE v2.0、RNAmmer v1.2、Rpsblast、InterProScan v5.25–64.0、BLASTP、TMHMM-2.0
2.7 关键功能基因的定量实时PCR（qPCR）分析
菌株ZHX3在生物絮凝剂产生培养基中培养24 h（达对数生长期）和60 h（达稳定期）的细菌样品分别收集并命名为SY1和SY2。菌株ZHX3在非生物絮凝剂产生LB培养基中培养48 h（达稳定期）的细菌样品收集并命名为LB。设置两个比较组：SY2/LB组（以LB为对照，SY2为实验组）和SY2/SY1组（以SY1为对照，SY2为实验组）。根据预测的多糖生物合成相关功能选择25个靶基因进行qPCR分析（表S1），包括：(i) 淀粉水解（amyE、glvA、bbmA、mdxK、malL）；(ii) 底物转运（ptsG、ptsI、ptsH、malP和mdxEFG-msmX）；(iii) 核苷酸糖前体合成（pgcA、gtaB、yngB、ytdA、yvdM）；(iv) eps基因簇（epsL、epsE、epsF、epsG、epsK、epsA、epsB）。所有引物对设计扩增产物长度为100–250 bp，GC含量40–60%，Tm值55–65°C，并检查了发夹结构和二聚体形成情况。
【数据】SY1：产絮培养基培养24 h（对数期）；SY2：产絮培养基培养60 h（稳定期）；LB：LB培养基培养48 h（稳定期）；比较组：SY2/LB、SY2/SY1；靶基因数：25个；引物参数：扩增产物100–250 bp，GC 40–60%，Tm 55–65°C
研究结果
3.1 热重分析
粗多糖的热重曲线如图1所示。第一次失重发生在100°C附近，失重率约为11.9%。这主要归因于吸附水和结构水的损失（如与多糖氢键结合的水分解吸）[19]。然而，考虑到纯化多糖组分相对较低的分子量，尤其是PS1–1（5982 Da），不能完全排除低分子量寡糖在100°C附近的部分挥发或热降解。第二次失重发生在275.3°C至332.8°C之间，快速减重49.49%。这表明多糖发生剧烈分解，涉及碳链和氢键断裂，并生成水和二氧化碳[20]。500°C之后，失重速率降低。899°C时残余质量约为原始重量的25.42%。这些结果表明粗多糖在275°C以下相对稳定。
【数据】第一次失重：~100°C，失重率~11.9%；第二次失重：275.3–332.8°C，失重率49.49%；899°C残余质量：25.42%
3.2 多糖的分离与纯化
经DEAE纤维素DE-52色谱首次分离后，粗多糖被分为两个独立的洗脱组分：一个以超纯水洗脱，命名为PS-1；另一个以0.1 M NaCl洗脱，命名为PS-2（图2A）。PS-1和PS-2的比例分别为52.3%和27.8%。PS-1和PS-2组分进一步经Sephadex G-100色谱纯化，各获得单一洗脱峰，分别命名为PS1–1（图2B）和PS2–1（图2C）。
【数据】PS-1占比：52.3%；PS-2占比：27.8%；纯化产物：PS1–1、PS2–1
3.3 纯化多糖的结构表征
#### 3.3.1 均一性与分子量分析
采用HPGFC评估纯化PS1–1和PS2–1的均一性和分子量。结果显示PS1–1和PS2–1均呈现单一峰（图S1），表明两种组分均高度均一。PS1–1和PS2–1的分子量分别为5982 Da和17,577 Da。Hu等人利用DEAE-纤维素和Sephadex G-75色谱纯化了Bacillus sp. S-1产生的胞外多糖，报道其主要组分BS-2分子量为1.765 × 10⁴ Da，与本研究中的PS2–1相近[21]。P. elgii B69分泌的生物絮凝剂MBF经Q-Sepharose fast flow阴离子交换色谱纯化后，凝胶渗透色谱测定其分子量为3.5 × 10⁶ Da[22]。不同微生物产生的多糖在分子量上的差异反映了这些聚合物的菌株特异性。
【数据】PS1–1分子量：5982 Da；PS2–1分子量：17,577 Da；对比菌株Bacillus sp. S-1 BS-2分子量：1.765×10⁴ Da；对比菌株P. elgii B69 MBF分子量：3.5×10⁶ Da
#### 3.3.2 单糖组成分析
PS1–1和PS2–1的单糖组成如图S2所示。PS1–1中葡萄糖与甘露糖的摩尔比为85.9:1。PS2–1中出现少量半乳糖，葡萄糖、甘露糖和半乳糖的摩尔比为75.1:6.5:1。葡萄糖在PS1–1和PS2–1中占绝对主导地位。单糖组成不仅取决于不同细菌菌株之间的特异性，还取决于各纯化组分不同的合成途径[23]。
【数据】PS1–1单糖摩尔比：葡萄糖:甘露糖=85.9:1；PS2–1单糖摩尔比：葡萄糖:甘露糖:半乳糖=75.1:6.5:1
#### 3.3.3 FT-IR分析
PS1–1和PS2–1在400–4000 cm⁻¹范围内观察到相似的官能团，如图3所示。3431.85 cm⁻¹（PS1–1）和3424.31 cm⁻¹（PS2–1）处的强烈宽吸收峰归属于-OH伸缩振动。脂肪族CH₂基团的CH伸缩振动在2925.17 cm⁻¹（PS1–1）和2925.70 cm⁻¹（PS2–1）处产生吸收峰。1639.26 cm⁻¹（PS1–1）和1646.83 cm⁻¹（PS2–1）处的峰更适当地归属于结合水（H–O–H）的弯曲振动。1458.54 cm⁻¹（PS1–1）和1422.03 cm⁻¹（PS2–1）处的峰对应CH弯曲振动。1160.40 cm⁻¹（PS1–1）以及1158.85、1083.62和1021.53 cm⁻¹（PS2–1）处的峰表明存在糖环的C-O-C伸缩振动，这是糖衍生物的特征。PS1–1和PS2–1中在851.51 cm⁻¹处观察到的吸收峰是α-d-葡萄糖的特征[24–26]。在1000–1200 cm⁻¹区域，PS2–1的吸收强度显著高于PS1–1。与分子量分析一致，PS2–1较高的分子量与其较强的C–O–C吸收峰相关。
【数据】FT-IR特征峰（PS1–1/PS2–1）：3431.85/3424.31 cm⁻¹（-OH），2925.17/2925.70 cm⁻¹（CH₂），1639.26/1646.83 cm⁻¹（H–O–H），1458.54/1422.03 cm⁻¹（CH），1160.40及1158.85、1083.62、1021.53 cm⁻¹（C-O-C），851.51 cm⁻¹（α-d-葡萄糖）
#### 3.3.4 甲基化分析
采用甲基化分析确定多糖的连接方式[27]。PS1–1和PS2–1的甲基化产物首先经FT-IR检测以验证甲基化反应是否完全。如图S3所示，3000–3500 cm⁻¹区域的-OH伸缩振动完全消失，而2930 cm⁻¹附近的甲基伸缩振动显著增强，表明PS1–1和PS2–1均被高度甲基化。随后，甲基化样品经完全酸水解、NaBH₄还原和乙酰化，获得部分甲基化糖醇乙酸酯（PMAAs）进行GC–MS分析。如图S4所示，PS1–1的三个对称PMAA峰被鉴定为1,5-二-O-乙酰基-2,3,4,6-四-O-甲基葡萄糖醇、1,4,5-三-O-乙酰基-2,3,6-三-O-甲基葡萄糖醇和1,4,5,6-四-O-乙酰基-2,3-二-O-甲基葡萄糖醇。该鉴定基于其特征质量碎片（m/z）、保留时间以及与复杂碳水化合物结构数据库和文献中质谱谱图的比对。三种PMAAs的摩尔比为1.1:6:1。PS2–1检测到的PMAA类型与PS1–1相同，但摩尔比为1:8:1（图S5）。甲基化分析结果汇总于表1。这些结果表明两种多糖的主链均由[→4)-Glcp-(1→]连接组成，并在O-6位连接Glcp-(1→分支。单糖分析显示葡萄糖占主导，与甲基化确认的[→4)-Glcp-(1→]连接一致。基于摩尔比和分子量推算，PS1–1的重复单元中每七个1,4-连接葡萄糖残基含一个分支Glcp-(1→，而PS2–1的重复单元中每九个1,4-连接葡萄糖残基含一个分支Glcp-(1→。因此，PS1–1和PS2–1分别由约四个和十个重复单元组成。PS1–1和PS2–1的推定结构如图4所示。
值得注意的是，甲基化分析仅检测到来源于葡萄糖的连接类型。单糖组成分析中检测到的甘露糖和半乳糖（第3.3.2节）在GC–MS色谱图中未观察到明显的PMAA峰（图S4、S5）。这一差异可能归因于这些微量组分丰度较低（甘露糖≤7.5%，半乳糖≤1.2%），低于当前实验条件下甲基化-GC–MS方法的可靠检测阈值。另一种可能是甘露糖和半乳糖的PMAA衍生物与葡萄糖的PMAA衍生物共洗脱而未被区分。鉴于这些微量组分合计占总糖的不到9%，其未解析的连接方式不影响对以葡萄糖为主导的多糖（MBF-ZHX3的主要结构组分）的整体表征。因此，微量单糖组分的连接方式在本研究中未做表征。
【数据】PS1–1 PMAA摩尔比：1.1:6:1（末端葡萄糖:1,4-连接葡萄糖:1,4,6-连接葡萄糖）；PS2–1 PMAA摩尔比：1:8:1；PS1–1重复单元：每7个1,4-连接葡萄糖残基含1个分支，共~4个重复单元；PS2–1重复单元：每9个1,4-连接葡萄糖残基含1个分支，共~10个重复单元；甘露糖≤7.5%；半乳糖≤1.2%
#### 3.3.5 ¹H NMR分析
为确认纯化多糖的异头碳构型，对PS1–1和PS2–1进行了¹H NMR波谱分析（600 MHz，D₂O，水抑制）。谱图（图S12）显示两种组分在δ 5.0–5.5 ppm区域均有明显的异头氢信号，其中PS1–1在δ 5.25 ppm处、PS2–1在δ 5.32 ppm处有显著信号。这些化学位移是α-d-吡喃葡萄糖残基的特征[28]。未观察到β-构型的特征信号。
【数据】¹H NMR：PS1–1异头氢信号δ 5.25 ppm；PS2–1异头氢信号δ 5.32 ppm；构型：α-d-吡喃葡萄糖；未检测到β-构型信号
3.4 基因组分析
枯草芽孢杆菌ZHX3的全基因组测序结果揭示了其遗传特征。基因组由一个环状染色体和两个质粒组成。功能注释显示该菌株具有较高的碳水化合物代谢活性，分别有284个基因（9.52%）和264个基因（11.28%）被注释到COG和KEGG数据库的碳水化合物代谢类别中。
【数据】染色体大小：4,122,369 bp；质粒数量：2个；COG碳水化合物代谢基因：284个（9.52%）；KEGG碳水化合物代谢基因：264个（11.28%）
3.5 eps基因簇鉴定与qPCR分析
在枯草芽孢杆菌ZHX3基因组中鉴定出一个完整的eps基因簇，由15个开放阅读框组成。qPCR分析显示，参与底物摄取（ptsG、malP、mdxEFG-msmX）和核苷酸糖合成（pgcA、gtaB）的关键基因显著上调。起始糖基转移酶（GT）epsL和主要GT epsF上调，翻转酶epsK、聚合酶epsG以及链长调节因子epsA和epsB也同步上调。
【数据】eps基因簇：15个开放阅读框；上调基因：ptsG、malP、mdxEFG-msmX、pgcA、gtaB、epsL、epsF、epsK、epsG、epsA、epsB
讨论与解读
MBF-ZHX3中的多糖由两种均一组分PS1–1和PS2–1构成，两者均具有→4)-α-D-Glcp-(1→主链和O-6位α-D-Glcp-(1→分支。菌株ZHX3的基因组分析揭示了丰富的碳水化合物代谢相关基因，特别是参与淀粉利用和多糖合成的基因，这有利于高效生产生物絮凝剂。qPCR证实了底物转运、核苷酸糖前体合成以及多糖组装和输出相关基因的协同上调。据此提出了多糖的推定生物合成通路。然而，eps基因簇中关键基因（如epsL、epsF和epsG）的推定功能仍需通过基因敲除或互补实验进一步验证。尽管如此，通过整合结构、基因组和转录组数据，本研究建立了一个概念性和实验性框架，将epsL、epsF和epsG列为优先改造靶点，为生物絮凝剂产量和性能的理性遗传改良提供了方向。
编译者解读
该研究提供了一个值得借鉴的分析范式——从"终产物结构"出发，反向锁定"合成基因"，再通过转录水平验证，最终圈定可操作的改造靶点。结构表征做得相当扎实：HPGFC、甲基化-GC-MS、NMR多种手段交叉验证，连微量甘露糖/半乳糖的连接方式未解析这一局限也如实交代，这种严谨在合成生物学研究中尤为可贵。从应用角度看，将epsL、epsF、epsG列为优先靶点具有明确的可操作性——但这只是"预测"，真正的考验在于后续的基因敲除与回补实验能否证实这些基因的功能。另外，两种多糖组分的分子量差异（5982 Da vs 17,577 Da）提示菌株可能存在分子量调控机制，若能阐明其调控逻辑，对定制生产特定分子量范围的多糖絮凝剂将有很大价值。
参考来源
Xia M. Structural characterization and predicted biosynthetic pathway of the polysaccharide component of bioflocculant from starch-degrading Bacillus subtilis ZHX3. International Journal of Biological Macromolecules, 2026. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.154343
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.154343