来源：Terpenoids: Biosynthetic pathway and metabolite content in Echinophora platyloba（Plant Gene）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
扁叶刺芹（Echinophora platyloba）是伊朗传统药用植物，富含具有抗真菌、抗氧化和抗菌活性的萜类化合物。本研究首次对该植物进行转录组测序，鉴定出32个与萜类生物合成相关的基因，并通过GC-MS和qPCR分析了营养期与生殖期组织中萜类代谢物含量及关键酶基因的表达差异。结果显示BGS基因在生殖期表达量较营养期提高724倍，基因表达与代谢物含量呈显著正相关。
研究背景
植物作为固着生物，需要合成大量次生代谢产物以应对生态功能需求。这些化合物对人类健康意义重大，长期受到传统医学和现代医学关注。扁叶刺芹隶属伞形科，是伊朗特有植物，分布于克尔曼沙赫、洛雷斯坦、哈马丹等地。该植物产生萜烯、黄酮、生物碱和皂苷等多种有价值的代谢物，主要萜烯成分包括罗勒烯、顺式-β-罗勒烯、反式-β-罗勒烯、月桂烯、芳樟醇、α-蒎烯等，有时也含橙花叔醇和金合欢醇型倍半萜化合物。
扁叶刺芹在传统医学中具有重要价值，其药理特性包括抗微生物和抗真菌活性、食品保鲜与调味功能、抗氧化效应，以及实验证实的抗抑郁样作用、镇痛活性、伤口愈合支持及潜在抗癌效果。然而，尽管该植物已被药用数百年，其萜烯生物合成的分子机制在很大程度上仍是未解之谜。
研究方法
2.1 植物材料采集与制备
扁叶刺芹植株采集自伊朗克尔曼沙赫省松戈尔（北纬34°46′58″，东经47°35′54″），海拔1681米。该地区属半干旱气候，年均降雨量约367毫米。样品分别于2022年5月（营养生长期）和7月（生殖生长期）采集。扁叶刺芹通常分布于砂质-黏质土壤，多见于农业环境，海拔1400–2300米，坡度15%–30%。采集的样品立即用液氮冷冻，−80°C保存直至RNA提取和代谢物测定。每个样品设置三个生物学重复和技术重复。
【数据】采集地点：伊朗克尔曼沙赫省松戈尔（34°46′58″N，47°35′54″E）；海拔：1681m；气候：半干旱，年均降雨量367mm；采样时间：2022年5月（营养期）和7月（生殖期）；保存温度：−80°C；重复数：3个生物学+3个技术重复
2.2 气相色谱-质谱联用分析次生代谢物
分别采集营养期和生殖期的扁叶刺芹叶片。小心去除叶片上的刺，以提高单位质量代谢物浓度并防止精油提取过程中生物表面活性剂的形成。随后将各时期样品合并，取100 mg干燥地上部分合并材料，使用Clevenger型装置水蒸馏3小时，方法参照《欧洲药典》。使用二甲醚提高提取效率并最大化精油产量。收集的精油用无水硫酸钠干燥，4°C保存。称量最终精油的重量和体积以计算密度。
采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析营养期和生殖期叶片提取物。样品使用安捷伦科技6890N GC系统，配备Agilent 19091S-413 HP-5MS色谱柱（直径250 μm，长度30 m），程序升温初温60°C、终温300°C。氦气为载气。化合物鉴定通过将观察到的色谱峰与NIST和Wiley质谱库比对完成。各化合物在精油中的相对含量采用面积归一化法确定，不考虑响应因子。同时通过十二烷系列的线性保留指数比对以避免非特异性峰归属。
【数据】样品量：100mg干燥叶片；蒸馏时间：3h；蒸馏装置：Clevenger型；提取增强剂：二甲醚；干燥剂：无水硫酸钠；保存温度：4°C；GC柱：HP-5MS（250μm×30m）；程序升温：60°C→300°C；载气：氦气；定量方法：面积归一化法
2.3 RNA分离与转录组测序
取100 mg叶片组织（每个重复15个组织）使用DENAzist柱式RNA分离试剂盒（DENAzist Asia Co., S-1010，马什哈德，伊朗）提取RNA。每个技术和生物学样品进行三次重复用于基因表达分析。随后按照制造商说明书用DNase I（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）处理RNA。测序前，使用NanoDrop（BioTek，EPOCH）和1%琼脂糖凝胶评估RNA质量和数量。使用Agilent 2100 Bioanalyzer验证RIN值≥7。
营养期叶片RNA测序由华大基因公司使用Illumina HiSeq 2500平台完成，采用150 bp双端（PE）读长。文库构建中，使用oligo(dT)磁珠富集mRNA，然后片段化为短片段。第一链cDNA使用随机六聚体引物合成，随后进行第二链cDNA合成。cDNA片段经末端修复、加A尾、连接测序接头。PCR扩增后，纯化文库并评估质量和浓度。
【数据】RNA提取量：100mg叶片组织；试剂盒：DENAzist柱式RNA分离试剂盒（S-1010）；DNase处理：DNase I（Thermo Fisher）；RIN值：≥7；测序平台：Illumina HiSeq 2500；读长：150bp双端；文库构建：oligo(dT)磁珠+mRNA片段化+随机六聚体引物
2.4 转录组分析与从头组装
使用FastQC（版本0.11.9）评估测序读段质量。使用fastp（版本0.20.1）从3′端修剪低质量读段和含模糊碱基（N）的读段，以提高组装准确性并减少错误。仅保留质量分数大于25（Q>25）的读段用于扁叶刺芹的从头组装。使用Trinity（版本2.6.6）进行组装，k-mer大小为32以优化N50值。过滤后的读段使用Bowtie2（版本2.4.1）比对。转录本丰度使用Salmon（版本1.9.0）量化。
【数据】质控软件：FastQC v0.11.9；修剪软件：fastp v0.20.1；质量阈值：Q>25；组装软件：Trinity v2.6.6；k-mer：32；比对软件：Bowtie2 v2.4.1；定量软件：Salmon v1.9.0
2.5 功能注释与代谢途径鉴定
使用TransDecoder（v4.1.0）从扁叶刺芹组装的contigs预测开放阅读框（ORF）。功能注释通过将组装的contigs与公共蛋白数据库（包括NR和Swiss-Prot数据库）进行BLASTX比对完成，E值阈值为1×10⁻⁵。使用KEGG数据库（版本93.0）和NCBI BLAST（v2.9.9）基于与NCBI数据库中近缘属种的序列同源性识别扁叶刺芹次生代谢途径相关基因。功能分类和GO富集分析（包括生物学过程、分子功能和细胞组分）通过AgriGo网络工具确定的GO条目完成。扁叶刺芹萜烯生物合成相关途径使用上述数据库进一步检查，并通过文献综述和计算机离线BLAST支持。候选基因的功能结构域和保守基序使用Clustal Omega（v1.2.2）检查，用WebLogo（v2.8.2）可视化。系统发育分析使用MEGA-X中的邻接法进行，bootstrap支持考虑2000次重复，至少包含10个其他物种。最后，使用DeepLOC-1.0和PredictNLS（v21.22）等在线工具预测萜烯生物合成途径候选基因的亚细胞定位和功能。
【数据】ORF预测：TransDecoder v4.1.0；注释数据库：NR+Swiss-Prot；BLASTX E值阈值：1×10⁻⁵；KEGG版本：93.0；多序列比对：Clustal Omega v1.2.2；可视化：WebLogo v2.8.2；系统发育：MEGA-X邻接法，2000次bootstrap；亚细胞定位预测：DeepLOC-1.0和PredictNLS v21.22
2.6 简单序列重复（SSR）鉴定
使用MIcroSAtellite（MISA）软件以默认参数分析扁叶刺芹转录组序列中简单序列重复（SSR）的存在情况。SSR检测所需的最小重复单元数设置为：单核苷酸10次、二核苷酸6次、三/四/五/六核苷酸5次。复合微卫星中两个SSR之间的最大允许间隔设为100 bp。
【数据】SSR检测软件：MISA（默认参数）；最小重复数：单核苷酸10、二核苷酸6、三至六核苷酸5；复合SSR最大间隔：100bp
2.7 萜烯途径相关基因的qPCR分析
通过qPCR分析扁叶刺芹萜烯生物合成途径中关键基因的表达。选定萜烯基因的引物从转录本的3′UTR区域设计，使用Perlprimer软件（版本1.1.21）确保扩增的高准确性和特异性。随后使用Oligoanalyzer软件（版本3.1）检查引物的熔解温度、GC百分比、发夹结构形成、异源二聚体形成和自身二聚体。引物序列和反应条件的详细信息见表1。RNA提取使用DENAzist柱式RNA分离试剂盒。
【数据】引物设计软件：Perlprimer v1.1.21；引物验证：Oligoanalyzer v3.1；引物来源区域：3′UTR
研究结果
3.1 GC/MS代谢物组成鉴定
气相色谱-质谱联用（GC/MS）是鉴定和定量扁叶刺芹精油提取物中萜烯成分的关键分析技术。结果表明，生殖期组织中萜烯浓度高于营养期组织。这些结果证实了代谢物组分在不同发育阶段间的差异。由于营养期组织代谢物组成范围广泛，该样品被选作萜烯生物合成相关转录组研究的材料。
GC/MS结果显示，β-罗勒烯在营养期叶片中的含量为10.12 mg/g DW，而该代谢物在生殖期叶片中的含量为10.25 mg/g DW。水芹烯代谢物浓度从营养期组织的5.46 mg/g DW增加到生殖期组织的5.86 mg/g DW。GC/MS结果还显示，匙叶桉油烯醇在营养期和生殖期组织中的含量分别为5.67和24.15 mg/g DW。
【数据】β-罗勒烯含量：营养期10.12mg/g DW，生殖期10.25mg/g DW；水芹烯含量：营养期5.46mg/g DW，生殖期5.86mg/g DW；匙叶桉油烯醇含量：营养期5.67mg/g DW，生殖期24.15mg/g DW
3.2 转录组数据分析
进行转录组数据分析以鉴定扁叶刺芹次生代谢物生物合成途径中的关键基因。首先去除接头和低质量区域，获得42,277,848条双端读段。Trinity从头组装结果显示获得38,461个基因和50,672条转录本，GC含量为41.26%，平均长度为1104.85 bp。N50值评估为1664 bp。比对率估计为72.8%。
KEGG途径分析将17,037个基因归类到429条途径中，包括碳水化合物代谢、能量代谢、脂质代谢、氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢以及萜烯和聚酮化合物代谢。每个基因和异构体的丰度估计基于FPKM和TPM值。
【数据】双端读段数：42,277,848；基因数：38,461；转录本数：50,672；GC含量：41.26%；平均长度：1104.85bp；N50：1664bp；比对率：72.8%；KEGG注释基因数：17,037；KEGG途径数：429
3.3 萜烯生物合成候选基因的鉴定
鉴于萜烯化合物是该植物产生的主要代谢物类别，本研究的主要目标是鉴定其生物合成途径中涉及的基因。基于与近缘物种同源基因的高度相似性及文献综述，鉴定了与MEP、MVA和甲基丁香酚生物合成等萜烯途径相关的基因。本研究首次在扁叶刺芹中鉴定出总共32个萜烯次生代谢物相关基因。
使用离线BLASTp（版本2.13.0）鉴定与次生代谢途径相关的候选转录本，如 bicyclogermacrene 合酶（BGS）、水芹烯合酶（PHS）和β-罗勒烯合酶（BOS），E值阈值≤10⁻¹⁰。
BOS是将香叶基二磷酸转化为β-罗勒烯的关键酶。在BOS中发现两个保守基序，即金属结合基序（DDVYD）和富精氨酸N端（RRSANYPPSFW），该酶的定位预测在细胞质中。DeepLoc分析显示BOS被归类为叶绿体跨膜蛋白。本研究在扁叶刺芹中鉴定到该酶的一个异构体。
BGS在法尼基二磷酸向香叶基二磷酸的转化中起催化作用，是匙叶桉油烯醇生物合成的限速步骤。在扁叶刺芹中鉴定到金属结合保守基序（DDVYD）和一个与BGS生物合成相关的基因异构体。结果证实BGS酶在细胞质中有活性。系统发育树分析显示BGS与同属伞形科的明日叶（Angelica keiskei）和阿育魏实（Trachyspermum ammi）亲缘关系密切。
还研究了参与水芹烯生物合成的PHS。鉴定到PHS中保守的结构基序——富精氨酸N端（RRSGNYKPCMW）和金属结合基序（DDVYD）。在该生物合成途径中鉴定到PHS的三个活性异构体。PHS基因定位于叶绿体，被检测为跨膜蛋白。此外，系统发育树证实BOS和PHS基因与阿育魏实和胡萝卜（Daucus carota）中的相应基因密切相关。萜烯及其他基因的功能结构域和保守基序如图所示。
【数据】鉴定萜烯基因数：32个；BLASTp E值阈值：≤10⁻¹⁰；BOS保守基序：DDVYD（金属结合）+RRSANYPPSFW（富精氨酸N端）；BOS定位：细胞质/叶绿体跨膜蛋白；BOS异构体数：1个；BGS保守基序：DDVYD；BGS定位：细胞质；BGS异构体数：1个；PHS保守基序：DDVYD+RRSGNYKPCMW；PHS定位：叶绿体跨膜蛋白；PHS异构体数：3个
3.4 简单序列重复（SSR）分析
SSR标记相比其他标记系统具有高重复性、共显性遗传和相对丰富等优势。转录组来源的SSR还表现出较高的种间可转移性。本研究分析了含有不同数量串联重复序列的SSR频率。
在50,672条序列中共鉴定到2570个SSR，占数据集的5.1%。此外，103条序列含有一个以上SSR位点。鉴定到的SSR基序包括单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复。最常见的重复类型为二核苷酸（64.47%，1657个SSR）和三核苷酸（10.97%，282个SSR）。其中，二核苷酸基序TC、CT和GA最为普遍。含十个串联重复的SSR最为丰富。
【数据】SSR总数：2570个（占50,672条序列的5.1%）；含多SSR位点序列数：103条；二核苷酸重复：64.47%（1657个）；三核苷酸重复：10.97%（282个）；优势基序：TC、CT、GA
3.5 RT-qPCR基因表达评估
在营养期和生殖期两个阶段评估了萜烯生物合成关键基因的表达水平。RT-qPCR分析显示，扁叶刺芹生殖期组织中萜烯基因的相对表达量趋向于高于营养期组织。
参与β-罗勒烯合成的BOS基因在生殖期组织中的相对表达量比营养期高35倍。参与香叶基二磷酸向水芹烯转化的PHS基因在生殖期组织中的表达比营养期提高5倍。BGS基因的相对表达量在生殖期组织中比营养期高724倍。这些结果揭示了扁叶刺芹生殖期组织中存在相当高浓度的萜烯。
BOS基因的表达水平与β-罗勒烯含量呈正相关。BGS和PHS也分别与匙叶桉油烯醇和水芹烯呈正相关。该分析揭示了基因表达与萜烯含量之间的关键相关性。
【数据】BOS生殖期/营养期表达倍数：35倍；PHS生殖期/营养期表达倍数：5倍；BGS生殖期/营养期表达倍数：724倍；相关性：BOS↔β-罗勒烯正相关、BGS↔匙叶桉油烯醇正相关、PHS↔水芹烯正相关；置信水平：0.95
讨论与解读
本研究的主要目标之一是探索和利用药用植物的潜力，重点关注用于传统医学的扁叶刺芹。尽管其次生代谢物及其多种生物活性已得到公认，但此前研究仅调查了少数生态型中有限数量的代谢物产生情况。本研究首次表征了扁叶刺芹的转录组和代谢组谱，为该物种有价值的次生代谢物生物合成提供了新见解。结果揭示了多个可能参与萜烯产生的候选基因和生物合成途径，拓展了当前对扁叶刺芹次生代谢物生物合成分子机制的理解。
此外，研究分析了β-罗勒烯、匙叶桉油烯醇和水芹烯等三种关键次生代谢物相关基因在营养期和生殖期的表达，并揭示了该植物中代谢物含量与基因表达之间的关系。本研究采用的方法与此前对药用植物如波斯独活、科奇荆芥、葫芦巴、大阿米芹和皇冠贝母的转录组和代谢组研究一致，这些研究旨在鉴定参与次生代谢物生物合成的基因——萜烯积累模式与关键生物合成基因表达之间的显著正相关性表明，转录调控在协调萜烯组织特异性积累中起重要作用。
编译者解读
本研究将转录组学与代谢物 profiling 相结合，系统解析了扁叶刺芹萜烯生物合成的分子基础。方法选择上的亮点在于同时关注MEP和MVA两条前体供给途径，并对BOS、PHS、BGS三个关键合酶进行了差异表达验证。BGS基因724倍的表达差异尤为突出，提示匙叶桉油烯醇的积累可能主要受转录水平调控。从合成生物学应用角度看，这些鉴定的基因——尤其是生殖期高表达的BGS——可作为异源重构萜烯合成通路的候选元件。不过，研究仅停留在转录-代谢相关性层面，缺乏体内功能验证（如病毒诱导基因沉默或异源表达），这是后续研究需要补足的关键环节。
DOI: 10.1016/j.plgene.2026.100597