来源：CYP719F3 of Schisandra sphenanthera catalyzes the formation of two methylenedioxy bridges in schisandrin C biosynthesis（Industrial Crops and Products）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
五味子（Schisandra sphenanthera）是我国传统保肝中药材，其活性成分五味子丙素含有两个特征性亚甲二氧桥结构。本研究通过对雌雄植株七个组织的转录组与代谢物分析，筛选出候选细胞色素P450酶，并在酵母中异源表达验证，发现SsCYP719F3可连续催化两个亚甲二氧桥的形成。分子动力学模拟进一步揭示了Ser292残基通过氢键定位底物的催化机制。该工作为五味子丙素的异源合成与代谢工程提供了关键酶学基础。
研究背景
五味子（Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils.）是五味子科雌雄异株多年生木质藤本植物，主要分布于中国中南部。该植物在传统中医中用于治疗肝炎、糖尿病、失眠及慢性咳嗽。联苯环辛二烯型木脂素（DBCOD木脂素）是其主要生物活性成分，具有抗氧化、抗癌、抗炎及保肝等多种药理活性。迄今已报道超过350种DBCOD木脂素，其中37种具有保肝作用。五味子丙素作为代表性DBCOD木脂素，在对抗肝损伤方面表现出显著生物活性，其结构中含有两个特征性亚甲二氧桥（MDB）。尽管五味子丙素的全合成已有报道，但其生物合成途径尚未完全阐明。解析该途径对于理解DBCOD木脂素的生物合成至关重要。
研究方法
2.1 植物材料与化学试剂
五味子样品采集自中国湖南省通道县黑老虎生物科技有限公司。植物材料包括健康三年生雌株的果实、根、茎和叶，以及雄株的根、茎和叶。每个组织设置三个生物学重复。样品经液氮速冻后于–80°C保存至分析。每个样品分为两份，分别用于代谢组和转录组分析。Gomisin J（≥98%）、gomisin L2（≥98%）、五味子丙素（≥98%）和五味子酯甲（≥98%）购自昆明BioBioPha有限公司。
【数据】样品来源：湖南通道县；植物株龄：三年生；生物学重复：3个/组织；保存温度：–80°C；标准品纯度：≥98%
2.2 植物组织提取物中DBCOD木脂素的HPLC分析
每个组织的干燥粉末（0.1 g）用甲醇（1 mL）超声提取30 min。提取液经0.22 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。HPLC分析采用Thermo U3000平台（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）。分离使用Thermo C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相为0.1%磷酸和乙腈（28:72，v/v），流速1.0 mL/min。检测波长220 nm，进样量10 μL，运行时间45 min。每个组织设置三个生物学重复进行提取和分析。
【数据】样品量：0.1 g干粉；提取液：甲醇1 mL；超声时间：30 min；滤膜：0.22 μm；色谱柱：Thermo C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸/乙腈=28:72（v/v）；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；进样量：10 μL；运行时间：45 min
2.3 转录组测序与功能注释
五味子七个组织的转录组测序由诺禾致源（中国天津）在Illumina NovaSeq 6000平台上完成。下游生物信息学分析，包括从头组装、unigene聚类、编码序列（CDS）预测、功能注释和基于TPM的表达定量，均按照作者先前报道的方法进行（Fu et al., 2024）。所得转录组数据集用于筛选候选CYP基因。
【数据】测序平台：Illumina NovaSeq 6000；分析内容：从头组装、unigene聚类、CDS预测、功能注释、TPM表达定量
2.4 系统发育分析
从五味子中筛选带有PF00067注释且编码蛋白长度超过280个氨基酸的序列作为CYP。这些序列与来自其他植物的CYP一同使用MAFFT（v7.52）的G-INS-i策略进行比对（Rozewicki et al., 2019）。使用IQ-TREE（v1.6.12）选择最优替代模型（Q.PLANT+I+G4）（Nguyen et al., 2015），随后以1000次超快自举重复构建最大似然（ML）系统发育树。树的可视化使用tvBOT（v2.6.1）在线工具完成（Xie et al., 2023）。
【数据】序列筛选标准：PF00067注释、蛋白长度>280 aa；比对软件：MAFFT v7.52（G-INS-i）；建树软件：IQ-TREE v1.6.12；替代模型：Q.PLANT+I+G4；自举重复：1000次；可视化工具：tvBOT v2.6.1
2.5 候选SsCYPs的克隆与功能验证
cDNA从五味子组织总RNA逆转录合成，方法参照Duan et al.（2025）。候选SsCYPs的开放阅读框（ORF）使用特异性引物（表S1）进行PCR扩增。PCR产物克隆至酵母表达载体pYES2的BamHI位点，随后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。序列确认后，提取重组质粒（pYES2-CYPs）并转化至酿酒酵母WAT11菌株。转化空pYES2载体的WAT11菌株作为阴性对照。阳性转化子在含2%葡萄糖的缺尿嘧啶合成完全培养基（SC-U）平板上筛选。随后将筛选到的转化子于30°C振荡培养于液体SC-U培养基中，直至OD600达到2.0–3.0。细胞经4000 rpm离心10 min收集，用ddH2O洗涤三次以去除残留葡萄糖，重悬于含2%半乳糖的SC-U培养基中，于30°C孵育8–12 h诱导蛋白表达。活性筛选时，将各底物（gomisin J或gomisin L2）分别加入不同酵母培养物中至终浓度200 μM，随后于29°C孵育12 h。含空载体的WAT11菌株作为对照。细胞用100%甲醇提取，超声两次，每次30 min。所得上清作为酵母提取物进行HPLC分析。HPLC分析采用水-乙腈流动相（15:85，v/v），流速1.0 mL/min，柱温30°C，进样量5 μL，检测波长230 nm。酵母功能实验至少进行两次。
【数据】表达载体：pYES2；克隆位点：BamHI；宿主菌：酿酒酵母WAT11；筛选培养基：SC-U+2%葡萄糖；诱导培养基：SC-U+2%半乳糖；诱导条件：30°C，8–12 h；OD600：2.0–3.0；离心：4000 rpm，10 min；底物浓度：200 μM；催化条件：29°C，12 h；提取：100%甲醇，超声2×30 min；HPLC条件：水/乙腈=15:85（v/v），1.0 mL/min，柱温30°C，进样5 μL，检测230 nm；实验重复：≥2次
2.6 酶-底物复合物的构建
SsCYP719F3–Compound I复合物使用基于AI的全原子折叠模型Boltz2构建，其中Compound I代表催化活性的氧合铁物种。核心评估参数包括pTM = 0.938、ipTM = 0.989和pLDDT = 0.919，表明预测模型具有高精度。底物使用AutoDock（v4.2.6）对接至酶的活性位点。选择适当的催化构象进行后续分子动力学（MD）模拟，以使酶–Compound I–底物复合物结构松弛。
【数据】建模工具：Boltz2；pTM：0.938；ipTM：0.989；pLDDT：0.919；对接软件：AutoDock v4.2.6
2.7 分子动力学模拟
分子动力学模拟使用AMBER模拟软件包在立方体盒子中周期性边界条件下进行。蛋白质使用ff19SB力场参数化，水分子采用TIP3P模型描述，配体参数由General AMBER Force Field（GAFF）生成，并分配AM1-BCC电荷。初始坐标和拓扑文件使用AMBER中的tleap模块制备。能量最小化分三个阶段进行：首先，所有溶质原子被约束5000步；其次，蛋白质主链被约束5000步；最后，整个系统无约束最小化10000步。能量最小化后，每个系统在NVT系综下于100 ps内从0 K升温至300 K，在NPT系综下于300 K和1.0 atm条件下平衡另100 ps，随后在NVT条件下进行50 ns生产模拟。
【数据】软件：AMBER；力场：ff19SB（蛋白）、TIP3P（水）、GAFF（配体）；电荷：AM1-BCC；能量最小化：5000步约束溶质→5000步约束主链→10000步无约束；升温：0→300 K，100 ps（NVT）；平衡：300 K、1.0 atm，100 ps（NPT）；生产模拟：50 ns（NVT）
2.8 统计分析
数据使用GraphPad Prism 10.0（GraphPad Inc.，La Jolla，CA，USA）进行单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Duncan多重比较事后检验。P值<0.05被认为具有统计学显著性。
【数据】统计方法：one-way ANOVA + Duncan多重比较；软件：GraphPad Prism 10.0；显著性阈值：P<0.05
研究结果
3.1 转录组测序与从头组装
转录组数据可用于鉴定编码新生化活性的基因，是解析药用植物次生代谢途径的重要资源。本研究利用Illumina测序获得了雌雄五味子植株七个不同组织的转录组。质量过滤后，共获得1238,407,216条clean reads（185.1 Gb）（表1）。Q分数≥30的碱基百分比为98.47%，GC含量为45.98%。所有clean reads组装后生成74,213个unigene，平均长度为1075 bp，N50为1484 bp。样品相关性热图证明了转录组数据的可靠性（图2A）。总体而言，这些结果表明转录组数据集质量高，适用于下游分析。
【数据】Clean reads：1,238,407,216条（185.1 Gb）；Q30：98.47%；GC含量：45.98%；Unigene数：74,213个；平均长度：1075 bp；N50：1484 bp
3.2 功能注释
为进一步了解组装的unigene涉及的生物学过程和分子功能，对照Nr、KEGG、KOG、TrEMBL和Swiss-Prot数据库进行了功能注释。共有43,886个unigene（59.14%）在这些数据库中获得注释。其中，分别有43,361（58.43%）、30,302（40.83%）、35,953（48.45%）、42,221（56.89%）和42,963（57.89%）个unigene根据Nr、Swiss-Prot、KOG、KEGG和TrEMBL数据库获得注释（图2B）。GO分析将64,820个unigene分为三类：生物学过程（19,171个unigene，29.5%）、细胞组分（8,437个unigene，13.0%）和分子功能（37,212个unigene，54.7%）（图2C）。在分子功能方面，432个unigene被注释为单加氧酶活性（GO:0004497），暗示其可能与五味子次生代谢中的氧化环化过程相关。KEGG分析将30,346个unigene分配到209条KEGG通路中，覆盖七个主要KEGG类别。排名前50的KEGG通路如图2D所示。由于DBCOD木脂素通过苯丙烷途径合成，154个unigene被分配到该代谢途径中，在已注释的次生代谢通路中相对丰度较高。这些结果为鉴定五味子DBCOD木脂素生物合成的候选基因提供了有价值的框架。
【数据】功能注释unigene数：43,886（59.14%）；Nr：43,361（58.43%）；Swiss-Prot：30,302（40.83%）；KOG：35,953（48.45%）；KEGG：42,221（56.89%）；TrEMBL：42,963（57.89%）；GO分类：64,820个unigene（生物学过程19,171个/29.5%；细胞组分8,437个/13.0%；分子功能37,212个/54.7%）；单加氧酶活性unigene：432个；KEGG通路：209条（30,346个unigene）；苯丙烷途径unigene：154个
3.3 参与五味子丙素生物合成的SsCYP候选基因挖掘
联苯环辛二烯木脂素已被证明仅在五味子科植物中积累。为探究五味子丙素的生物合成，作者首先检测了七个五味子组织中参与推测生物合成途径的关键DBCOD木脂素（gomisin J、gomisin L2和五味子丙素）的水平（图1E）。此外，还关注了五味子酯甲的积累——它是一种含有MDB结构的代表性DBCOD木脂素，被用作五味子总木脂素含量的重要指标（Wei et al., 2010）。
在这四种目标DBCOD木脂素中，gomisin L2在所检测的组织中未被检出。如图3A所示，gomisin J、五味子酯甲和五味子丙素的含量在七个组织间差异显著。总体上，三种被检DBCOD木脂素在根和果实中的含量均显著高于其他组织。这些化合物组织特异性积累特征提示，参与同一代谢途径的基因可能在这些组织中高表达。在大多数组织中，三种木脂素的相对丰度呈基本一致的趋势：gomisin J含量最高，其次为五味子酯甲和五味子丙素。相关性分析进一步表明，不同组织中gomisin J与五味子丙素水平呈强正相关（Pearson's r = 0.90）（图S1），提示五味子中gomisin J与五味子丙素之间存在密切的生物合成关系。
亚甲二氧桥结构在DBCOD木脂素中普遍存在，其形成因此代表了DBCOD木脂素生物合成中的关键步骤。植物次生代谢中的MDB形成已被证明由CYP酶催化（Mizutani and Sato, 2011）。在五味子转录组中，共注释到252个CYP基因。为鉴定参与五味子丙素MDB形成的基因，作者寻找了在其他物种中已被表征催化类似MDB形成的CYP（CYP719As和CYP81Qs）。随后使用这些代表性CYP的蛋白序列通过系统发育分析筛选五味子中的同源基因（表S2和S3）。经ORF分析去除不完整CDS后，鉴定到6个候选SsCYP719As和2个候选SsCYP81Qs（图3B）。不同物种CYP719As和CYP81Qs的多序列比对分别显示约60%和80%的序列一致性。全部8个候选SsCYPs均含有真核生物保守的CYP区域（图S2）。在保守的I-螺旋区域，典型氨基酸基序为[(A/G)GX(D/E)T(T/S)]，其中苏氨酸（Thr）残基被认为对氧激活至关重要（Durst and Nelson, 1995）。值得注意的是，不同亚家族在该区域已有特征性替换的报道：在CYP719As中，亮氨酸（Leu）替换保守的丙氨酸/甘氨酸（Ala/Gly），丝氨酸（Ser）替换Thr（Mizutani and Sato, 2011）。在催化芝麻素生物合成中MDB形成的CYP81Qs中，I-螺旋Thr始终被丙氨酸（Ala）替换（Ono et al., 2006）。氨基酸序列比对进一步揭示，6个候选SsCYP719As（SsCYP137、SsCYP152、SsCYP193、SsCYP154、SsCYP114和SsCYP080）共享相同的特征性氨基酸替换，而2个候选SsCYP81Qs（SsCYP120和SsCYP201）未表现出相应的Ala替换。
系统发育分析进一步揭示CYP719As聚为一个分支，并被分为五类（图3B）。第I类CYP719As催化原小檗碱型生物碱A环或D环上的MDB形成（Liu et al., 2023）。第II类负责鬼臼毒素生物合成中的MDB形成（Marques et al., 2013）。第III类CYP719As参与roemerine的MDB形成（Menendez-Perdomo and Facchini, 2023）。第IV类CYP719As参与胡椒碱和卡瓦内酯生物合成中的MDB形成（Pluskal et al., 2019; Schnabel et al., 2021）。然而，候选SsCYP719As均聚集在第V类，提示它们可能具有催化DBCOD木脂素生物合成中MDB形成的潜力。
以DBCOD木脂素在不同组织中的分布模式为指导，作者进一步基于转录组数据对候选基因进行了表达分析（图3C）。分析结果显示，4个SsCYP719A候选基因（SsCYP154、SsCYP137、SsCYP152和SsCYP114）和1个SsCYP81Q候选基因（SsCYP201）在根和果实中表现出相对较高的表达水平。因此，这些基因被选择并克隆至酵母表达载体，用于后续功能表征。
【数据】注释CYP基因数：252个；候选SsCYP719As：6个（SsCYP137、SsCYP152、SsCYP193、SsCYP154、SsCYP114、SsCYP080）；候选SsCYP81Qs：2个（SsCYP120、SsCYP201）；CYP719A序列一致性：约60%；CYP81Q序列一致性：约80%；gomisin J与schisandrin C相关性：Pearson's r = 0.90；高表达候选基因：SsCYP154、SsCYP137、SsCYP152、SsCYP114、SsCYP201
3.4 候选SsCYPs在酵母中的功能表征
为验证候选SsCYPs的功能，将蛋白在WAT11酵母菌株中异源表达。经半乳糖诱导后，每个培养物分为两份。一份与gomisin J孵育，另一份与gomisin L2孵育。最后从每份中提取发酵产物。转化空载体的WAT11菌株作为阴性对照。在5个候选SsCYPs中，仅SsCYP152对gomisin J和gomisin L2均表现出催化活性。当以gomisin J为底物时，检测到一个明显的产物峰，其保留时间与gomisin L2标准品一致。该产物经HPLC-MS进一步确证，m/z值（待原文补充）。
【数据】候选基因数：5个（4个SsCYP719As + 1个SsCYP81Q）；具催化活性基因：SsCYP152（仅1个）；底物：gomisin J、gomisin L2；验证方法：HPLC + HPLC-MS
讨论与解读
五味子在中国传统医学中已有数千年应用历史。联苯环辛二烯木脂素是五味子的主要活性成分。五味子丙素作为一种重要的DBCOD木脂素，具有显著的保肝活性。然而，其天然含量低且化学合成成本高，限制了实际应用。因此，阐明五味子丙素生物合成途径具有重要的医学、经济和生态价值——它可通过合成生物学实现可持续生产。尽管已有大量努力，五味子丙素的生物合成仍不清楚。鉴于五味子丙素含有两个MDB结构，其生物合成被推测涉及连续的MDB形成。与此假设一致，SsCYP719F3被证明可催化五味子丙素生物合成中两个连续的MDB形成反应。与先前表征的催化生物碱和其他木脂素中MDB形成的CYP不同，SsCYP719F3是首个催化DBCOD木脂素中MDB形成的CYP。这一发现也为阐明其他具有生物活性的DBCOD木脂素（如五味子乙素、五味子醇乙和gomisin G）中的MDB形成提供了有用框架。转录组方法拓展了植物基因发现的能力。
编译者解读
该研究以"代谢物分布指导候选基因挖掘"的策略，将转录组数据与组织特异性木脂素积累模式相结合，精准锁定SsCYP719F3——这种"从表型到基因"的筛选路径在植物天然产物研究中具有示范意义。值得注意的是，SsCYP719F3能够在一个活性位点内连续催化两次MDB形成，底物特异性宽但区域选择性精确，这对理解CYP酶催化多功能性提供了新视角。分子动力学模拟揭示的Ser292氢键定位机制也为后续酶工程改造提供了明确的靶点。从合成生物学应用看，该酶的发现使五味子丙素的微生物异源合成成为可能——但距离完整途径重构仍有关键缺口：gomisin J的上游生物合成基因尚待解析。此外，酵母中底物投料浓度（200 μM）提示酶活性可能仍有限，后续蛋白工程优化或底盘细胞改造将是提升产量的可行路径。
参考来源
Fu H. CYP719F3 of Schisandra sphenanthera catalyzes the formation of two methylenedioxy bridges in schisandrin C biosynthesis. Industrial Crops and Products, 2026. DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124027
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124027