来源：Modified β-glucans promote saponin and fucosylated chondroitin sulfate biosynthesis in sea cucumber Apostichopus japonicus in association with activation of the TLR-MAPK signaling pathway（Fish & Shellfish Immunology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
刺参（Apostichopus japonicus）富含皂苷和岩藻糖基化硫酸软骨素（FCS）等特征性生物活性成分，是亚洲市场珍视的高价值海产品。如何提升这些活性成分的含量以改善刺参品质，是产业界关注的核心问题。本研究以三种酵母β-葡聚糖（天然β-葡聚糖、超声降解低分子量β-葡聚糖及羧甲基化β-葡聚糖）作为膳食补充剂，开展为期28天的投喂实验，系统考察了改性β-葡聚糖对刺参体壁皂苷与FCS生物合成的促进作用及其调控机制。结果显示，改性β-葡聚糖不仅改善了刺参的生长性能和免疫应答，还显著提高了体壁中皂苷和FCS的积累量，其机制与TLR-MAPK信号轴介导的免疫-代谢交叉调控密切相关。
研究背景
刺参因其药用与营养价值而备受亚洲市场青睐，其品质特征主要归因于多种生物活性化合物。三萜皂苷和FCS是两类结构独特且功能关键的代谢产物：三萜皂苷作为主要次生代谢产物构成化学防御基础，FCS则是海参特有的硫酸化多糖。受海洋环境影响，这两类化合物的结构不同于陆生皂苷和软骨素硫酸盐，因而具有多样而强效的药理活性。这些特性推动了加工技术、功能食品和医药产品的开发。因此，调控皂苷和FCS生物合成以提升海参品质的策略值得深入探索。通过趋同进化，刺参获得了类似植物的三萜皂苷生物合成能力——甲羟戊酸（MVA）途径提供必需前体，随后进行下游角鲨烯后修饰。值得注意的是，刺参皂苷生物合成途径酶编码基因与植物直系同源基因具有高度同源性。在植物中已有充分文献记载，MVA途径及下游修饰步骤受多种信号通路调控。然而，刺参中皂苷和FCS生物合成的调控机制尚待阐明。本研究旨在探究三种膳食酵母β-葡聚糖对刺参皂苷和FCS生物合成的影响及潜在机制。
研究方法
2.1 动物伦理
本研究的动物实验获得山东大学动物实验伦理科学委员会批准（批准号：MC-20240612），并符合欧盟指令2010/63/EU的要求。
2.2 酵母β-葡聚糖及其衍生物的制备
纯度为88.16%的酵母β-葡聚糖来源于干酵母Saccharomyces cerevisiae（安琪酵母股份有限公司，中国宜昌），制备方法参照Bai等（2014）[23]的描述。β-葡聚糖的羧甲基化依照Bai等（2014）[23]的方法进行。简言之，在300 g/L氢氧化钠水溶液与异丙醇的混合物中，将酵母β-葡聚糖悬浮并剧烈搅拌形成均匀悬浮液，随后与氯乙酸钠溶液混合。所得混合物在70°C下孵育2小时，然后中和过量氢氧化物。使用Sigma-Aldrich透析膜（货号D2272，MWCO 2000 Da）对去离子水透析去除盐分，保留液经冻干后于4°C储存。
低分子量β-葡聚糖通过超声降解制备，参照Wang等（2025）[24]报道的方案。以去离子水配制0.2%（w/v）酵母β-葡聚糖悬浮液，随后使用探头超声仪（1200 W，24秒开/6秒关循环）在冰浴冷却条件下处理8小时。β-葡聚糖的溶解度和羧甲基β-葡聚糖的取代度（DS）依照Bai等（2014）[23]的方法测定。羧甲基β-葡聚糖的DS测定值为0.34。此外，低分子量β-葡聚糖、羧甲基β-葡聚糖和天然β-葡聚糖的溶解度分别为68.72%、36.04%和2.93%。
【数据】β-葡聚糖纯度：88.16%；羧甲基化反应：70°C、2h；透析膜MWCO：2000 Da；超声降解：0.2% w/v、1200 W、24s开/6s关、8h、冰浴；DS：0.34；溶解度：低分子量68.72%、羧甲基化36.04%、天然2.93%
2.3 实验饲料与投喂试验
对照基础饲料（CON）约含25%粗蛋白和60%粗碳水化合物，配方参照本团队前期工作[25]。随后将天然β-葡聚糖、低分子量β-葡聚糖和羧甲基β-葡聚糖分别掺入基础饲料中制备三种实验饲料。根据先前对刺参幼参和改性β-葡聚糖的研究[19,20,26]，所有β-葡聚糖的添加水平均设为0.2%，以等量替代贝壳粉。这些饲料分别标记为GLU、LMGLU和CMGLU。原料经细粉碎（<75 μm），按配方充分混合后挤压成5毫米颗粒。60°C烘箱干燥后，颗粒饲料储存于4°C。饲料配方及常规成分见表1。
幼参采集自中国威海当地养殖场。所有个体来自同一受精批次（1龄、性成熟前、初始体重：24.2 ± 0.6 g），在山东大学海洋科学与技术创新中心（威海）进行驯化。在商业饲料条件下驯化14天后，禁食48小时，随后将刺参随机分配至循环水养殖系统（上海海圣，中国）中的十二个600 L玻璃纤维水箱。每个饲料处理设三个重复水箱，每箱30头（每个处理共90头刺参）。在28天投喂试验期间，每日20:00按体重的3%投喂一次。为减少应激，在投喂前1小时于暗光条件下虹吸清除残饵和粪便，其余时间保持完全黑暗。水质控制在15-16°C、盐度30-31‰、pH 7.7-8.0，每天更换三分之一经砂滤的海水。
【数据】饲料蛋白：约25%；碳水化合物：约60%；β-葡聚糖添加量：0.2%；颗粒粒径：5mm；干燥温度：60°C；初始体重：24.2 ± 0.6 g；驯化：14天+48h禁食；水箱：600L×12；密度：30尾/箱；试验周期：28天；投喂：每日20:00、3%体重；水温：15-16°C；盐度：30-31‰；pH：7.7-8.0
2.4 样品采集
投喂试验结束后，对所有刺参逐一称重以计算增重率（WGR）和特定生长率（SGR）。从每个水箱中随机选取18头进行样品采集。具体而言，6头刺参的体壁组织立即在液氮中冷冻并保存于−80°C，用于后续qRT-PCR、Western blot和抗氧化酶活性测定。通过解剖从6头刺参采集体腔液，与抗凝剂（0.02 mol/L EGTA、0.019 mol/L KCl、0.068 mol/L Tris-HCl、0.48 mol/L NaCl）按1:1体积比混合[19]，用于测定总体腔细胞数（TCC）、吞噬活性和呼吸爆发活性。其余6头刺参的体壁样品经冻干后储存于−80°C，用于定量皂苷和FCS含量。
【数据】抗凝剂：0.02 mol/L EGTA、0.019 mol/L KCl、0.068 mol/L Tris-HCl、0.48 mol/L NaCl；体腔液:抗凝剂=1:1；储存温度：−80°C
2.5 免疫参数测定
TCC使用血球计数板测定，以cells/ml表示。吞噬活性和呼吸爆发活性参照Zhao等（2011）的方法分析。吞噬试验采用中性红摄取法。简言之，体腔液（100 μL）在25°C孵育30分钟。去除上清液后，加入0.029%中性红溶液（100 μL），再于25°C孵育30分钟。PBS洗涤三次后，加入裂解液（乙酸:乙醇=1:1，v/v，100 μL）裂解细胞20分钟。吞噬活性以每10⁶细胞的540 nm吸光度表示，使用酶标仪（Thermo，美国）定量。
呼吸爆发活性采用氮蓝四唑（NBT）法测定。简言之，将体腔液（100 μL）加入0.2%多聚赖氨酸预包被的96孔板中，随后于300 × g（4°C，10分钟）离心。细胞先用1 μg/mL佛波醇1,2-肉豆蔻酸酯1,3-乙酸酯（PMA；100 μL）处理，然后与0.3% NBT溶液（100 μL）孵育。加入无水甲醇终止反应，用70%甲醇洗涤三次并风干。随后加入2 M KOH（120 μL）和二甲基亚砜（DMSO；140 μL），用酶标仪（Thermo，美国）读取630 nm吸光度，以KOH/DMSO混合物作为空白。结果以每10⁶细胞的吸光度计算。体壁SOD和CAT活性使用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定（南京，中国；产品编号分别为A001-3-1和A007-2-1）。
【数据】吞噬试验：25°C、30min×2；中性红浓度：0.029%；裂解液：乙酸:乙醇=1:1、20min；检测波长：540nm；呼吸爆发：PMA 1 μg/mL、0.3% NBT、300×g离心4°C 10min；KOH：2M 120μL；DMSO：140μL；检测波长：630nm
2.6 体壁皂苷和FCS含量测定
皂苷定量采用香草醛-高氯酸比色法，参照Yin等（2020）[27]的方法，以人参皂苷Re作为参考标准。冻干组织粉末用20%乙醇水溶液超声辅助提取（240 W，60分钟）。提取液离心（3000×g，10分钟），使用D101大孔树脂柱纯化，以70%乙醇（v/v）洗脱并干燥。用5%香草醛-乙醇溶液和高氯酸溶解干燥残留物，随后60°C孵育10分钟。冰上冷却后加入乙酸，使用酶标仪（Thermo，美国）在560 nm处读取吸光度。
FCS含量依照Zhu等（2018）[28]的方法测定。冻干组织粉末用木瓜蛋白酶（>3500 U/mg）在60°C消化24小时，然后8000×g离心20分钟。上清液与三倍体积乙醇混合以沉淀粗多糖，沉淀用三氟乙酸水解以释放软骨素二糖和岩藻糖。硫酸软骨素含量采用二甲基亚甲蓝（DMMB）分光光度法测定，以鲨鱼软骨硫酸软骨素作为标准品。根据Zhu等（2018）[28]的研究，刺参FCS中硫酸软骨素的质量比为0.41，最终计算使用公式：FCS（mg/g，干重）= 硫酸软骨素含量/0.41。
【数据】皂苷提取：20%乙醇、240W超声、60min；离心：3000×g、10min；洗脱：70%乙醇；显色：5%香草醛-乙醇+高氯酸、60°C、10min；检测波长：560nm；FCS消化：木瓜蛋白酶>3500 U/mg、60°C、24h；离心：8000×g、20min；硫酸软骨素质量比：0.41
2.7 qRT-PCR分析
使用TRIzol™试剂（Invitrogen，美国）从体壁组织提取总RNA，总RNA的...
（后续qRT-PCR步骤原文节选未完整提供，以下按原文已给出内容继续）
...质量通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度法评估。第一链cDNA合成使用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，日本）依照制造商说明书进行。定量实时PCR使用TB Green™ Premix Ex Taq™ II（TaKaRa，日本）在LightCycler® 96系统（Roche，瑞士）上运行。反应条件为：95°C预变性30秒，随后95°C变性5秒、60°C退火延伸30秒，共40个循环。以β-actin作为内参基因，基因相对表达量采用2^−ΔΔCt法计算。
【数据】qRT-PCR反应条件：95°C 30s预变性；95°C 5s、60°C 30s×40循环；内参基因：β-actin；分析方法：2^−ΔΔCt法
研究结果
3.1 生长性能、免疫参数及体壁皂苷和FCS含量
不同β-葡聚糖的膳食添加影响了刺参的生长性能和免疫参数（表2）。所有组存活率均为100%。与CON组相比，LMGLU组表现出显著更高的WGR和SGR（P < 0.05）。总体腔细胞数（TCC）在所有处理组间无显著差异（P > 0.05）。低分子量β-葡聚糖和羧甲基β-葡聚糖的补充增强了几项免疫参数。与CON组相比，LMGLU和CMGLU组的呼吸爆发活性和SOD活性显著升高（P < 0.05），且这些组的吞噬活性和CAT活性相对其他组显著提高（P < 0.05）。
对于生物活性化合物（图1），膳食低分子量β-葡聚糖和羧甲基β-葡聚糖显著提高了皂苷含量，其中LMGLU组观察到的水平最高（P < 0.05）。与CON组相比，LMGLU和CMGLU组的FCS含量也显著增加（P < 0.05）。
【数据】存活率：100%；WGR和SGR：LMGLU组显著高于CON组（P<0.05）；TCC：各组无显著差异（P>0.05）；呼吸爆发和SOD：LMGLU和CMGLU组显著高于CON组（P<0.05）；吞噬和CAT：LMGLU和CMGLU组显著高于其他组（P<0.05）；皂苷：LMGLU组最高（P<0.05）；FCS：LMGLU和CMGLU组显著高于CON组（P<0.05）
3.2 皂苷和FCS生物合成基因的表达谱
不同β-葡聚糖类型的膳食补充改变了皂苷和FCS生物合成基因的表达（图2）。对于皂苷生物合成途径，LMGLU饲料显著上调了hmgcs的表达（与GLU组相比，P < 0.05），并且显著提高了hmgcr、mvk和mvd的表达水平（与所有其他组相比，P < 0.05）。膳食低分子量β-葡聚糖显著上调了sqle的表达（与CON组相比，P < 0.05）。对于FCS生物合成，与CON和GLU组相比，LMGLU和CMGLU组中xylt1的表达显著上调（P < 0.05）。LMGLU组表现出显著高于CON和GLU组的chsy1表达，以及高于CON和CMGLU组的chpf表达（P < 0.05）。
【数据】hmgcs：LMGLU组显著高于GLU组（P<0.05）；hmgcr、mvk、mvd：LMGLU组显著高于所有其他组（P<0.05）；sqle：LMGLU组显著高于CON组（P<0.05）；xylt1：LMGLU和CMGLU组显著高于CON和GLU组（P<0.05）；chsy1：LMGLU组显著高于CON和GLU组（P<0.05）；chpf：LMGLU组显著高于CON和CMGLU组（P<0.05）
3.3 TLR和MAPK通路基因的表达谱
膳食β-葡聚糖补充调节了TLR和MAPK信号通路基因的表达（图3A）。在TLR信号通路中，膳食低分子量β-葡聚糖和羧甲基β-葡聚糖相对于CON组显著上调了tlr、myd88、irak4和traf6的表达（P < 0.05）。tlr3的表达在各组间无显著差异（P > 0.05）。对于MAPK信号通路，与CON和GLU组相比，LMGLU饲料显著上调了tak1、erk和p38的表达（P < 0.05）。相对于CON组，LMGLU和CMGLU组中mkk1的表达也显著上调（P < 0.05）。mkk3、mkk7和jnk的表达水平在各处理间未检测到显著差异（P > 0.05）。
【数据】tlr、myd88、irak4、traf6：LMGLU和CMGLU组显著高于CON组（P<0.05）；tlr3：无显著差异（P>0.05）；tak1、erk、p38：LMGLU组显著高于CON和GLU组（P<0.05）；mkk1：LMGLU和CMGLU组显著高于CON组（P<0.05）；mkk3、mkk7、jnk：无显著差异（P>0.05）
3.4 MAPK通路相关蛋白的表达谱
膳食β-葡聚糖补充改变了关键MAPK通路组分的蛋白表达（图3B）。GLU和LMGLU组的刺参总p38蛋白表达显著高于CON组，其中LMGLU组丰度最高（P < 0.05）。磷酸化p38（p-p38）在GLU、LMGLU和CMGLU组中也显著升高，LMGLU组同样表现出最高水平（P < 0.05）。因此，p-p38/p38比值在LMGLU和CMGLU组中显著升高（P < 0.05）。膳食低分子量β-葡聚糖显著增加了总ERK蛋白的丰度（P < 0.05）。相对于CON组，所有三个β-葡聚糖组的磷酸化ERK（p-ERK）和p-ERK/ERK比值均显著升高，其中LMGLU组水平最高（P < 0.05）。在所有膳食处理中，总JNK、磷酸化JNK（p-JNK）或p-JNK/JNK比值均未观察到显著变化（P > 0.05）。
Mantel检验分析显示MAPK信号通路与皂苷和FCS生物合成基因之间存在显著正相关（图3C–表S2）。p38/ERK MAPK信号通路蛋白的表达水平与皂苷生物合成基因hmgcs（r = 0.21）、hmgcr（r = 0.78）、mvk（r = 0.47）、mvd（r = 0.77）和sqle（r = 0.42），以及FCS生物合成基因xylt1（r = 0.60）、chsy1（r = 0.51）和chpf（r = 0.27）显著正相关（P < 0.05）。
【数据】总p38：GLU和LMGLU组显著高于CON组，LMGLU最高（P<0.05）；p-p38：GLU、LMGLU、CMGLU组显著升高，LMGLU最高（P<0.05）；p-p38/p38：LMGLU和CMGLU组显著升高（P<0.05）；总ERK：LMGLU组显著升高（P<0.05）；p-ERK和p-ERK/ERK：三个β-葡聚糖组均显著升高，LMGLU最高（P<0.05）；JNK/p-JNK：无显著变化（P>0.05）；相关系数：hmgcs r=0.21、hmgcr r=0.78、mvk r=0.47、mvd r=0.77、sqle r=0.42、xylt1 r=0.60、chsy1 r=0.51、chpf r=0.27（均P<0.05）
3.5 MAPK通路抑制分析
为阐明MAPK信号通路激活与皂苷和FCS生物合成关键基因之间的关联，对饲喂LMGLU饲料（预激活MAPK通路）的刺参施用混合MAPK通路抑制剂（图4）。在初次抑制后24小时，p38和ERK的蛋白丰度及磷酸化水平，以及p-p38/p38和p-ERK/ERK比值均被抑制剂显著降低，验证了有效抑制（图4A；P < 0.05）。MAPK通路抑制也改变了关键生物合成基因的表达（图4B）。与LMGLU + PBS对照组相比，抑制剂处理显著下调了hmgcr和sqle的表达（P < 0.05）。对于FCS生物合成，xylt1和chsy1显著降低（P < 0.05），而chpf表达未受影响（P > 0.05）。
与生物合成基因下调相对应，MAPK抑制减少了体壁中皂苷和FCS的积累（图4C）。抑制7天后，皂苷含量相对对照组显著降低13.6%（P < 0.05），而FCS含量无显著差异（P > 0.05）。到第14天，皂苷和FCS含量分别显著降低21.9%和13.1%（P < 0.05）。
【数据】抑制验证：24h后p38/ERK丰度及磷酸化显著降低（P<0.05）；hmgcr和sqle：显著下调（P<0.05）；xylt1和chsy1：显著降低（P<0.05）；chpf：无显著变化（P>0.05）；7天：皂苷−13.6%（P<0.05）、FCS无显著差异（P>0.05）；14天：皂苷−21.9%、FCS−13.1%（均P<0.05）
讨论与解读
本研究结果表明，膳食β-葡聚糖增强了刺参的生长性能和免疫应答，表现为WGR及免疫参数（呼吸爆发、吞噬活性、SOD和CAT）的升高。这些发现与先前对刺参幼参的研究一致。β-葡聚糖的生长促进和免疫增强效应可能源于其调节肠道微生物群和形态的能力，以及作为病原体相关分子模式（PAMP）触发免疫应答的作用。β-葡聚糖的生物活性受其理化性质（包括溶解度、骨架结构和取代基团）的强烈影响。超声降解通过空化引起的剪切力和氧化还原反应实现解聚并松散三螺旋结构，而羧甲基化通过羧基部分取代羟基来改变螺旋结构。两种修饰均增强了β-葡聚糖的溶解度，并比天然形式发挥更好的免疫调节效果。在本研究中，低分子量β-葡聚糖和羧甲基β-葡聚糖表现出优越的免疫增强效果，这与凡纳滨对虾和大菱鲆中的研究结果相似——改性β-葡聚糖表现出优于未改性形式的生物活性。
在机制层面，本研究的转录组和蛋白水平分析揭示，改性β-葡聚糖激活了TLR-MAPK信号轴，进而上调了皂苷和FCS生物合成途径中的关键基因。Mantel检验进一步确认了MAPK信号通路与这些生物合成基因之间的显著正相关关系。体内MAPK抑制实验证实了因果联系——抑制MAPK通路显著降低了β-葡聚糖诱导的皂苷和FCS积累及相关基因表达。这些发现揭示了一种免疫-代谢交叉调控的新机制：膳食改性β-葡聚糖通过TLR-MAPK信号轴介导的免疫激活，促进刺参体壁中皂苷和FCS的生物合成。
编译者解读： 该研究巧妙地将免疫信号通路与次级代谢产物的生物合成联系起来，为水产功能饲料开发提供了新靶点。改性β-葡聚糖——特别是低分子量形式——凭借更高的溶解度展现出更强的生物活性，提示物理修饰手段在提升多糖类免疫增强剂效果方面具有实用价值。MAPK抑制实验的设计尤为亮眼，从相关分析推进到因果验证，逻辑链条完整。不足之处在于28天的试验周期相对较短，FCS在7天抑制时未显著降低也提示不同代谢产物的响应动力学存在差异。未来若能解析MAPK下游转录因子如何直接调控hmgcr等靶基因，将进一步完善这一免疫-代谢调控网络模型。
参考来源
Qi Z. Modified β-glucans promote saponin and fucosylated chondroitin sulfate biosynthesis in sea cucumber Apostichopus japonicus in association with activation of the TLR-MAPK signaling pathway. Fish & Shellfish Immunology, 2026. DOI: 10.1016/j.fsi.2026.111632.
DOI: 10.1016/j.fsi.2026.111632