来源：Complete biosynthesis of the anticancer cephalotaxinone and homoerythratine（Cell）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
三尖杉酯碱（HHT）是已获批用于慢性髓系白血病治疗的天然药物，但其天然含量极低，半合成路线受限于濒危植物资源。本研究通过多组学联用与化学合成标准品，系统鉴定了三尖杉酮碱（CET前体）与高刺桐碱生物合成途径中的10个未知酶，揭示了一对高度同源的细胞色素P450酶（CfCYP2/CfCYP3）催化发散氧化的罕见机制，并在本氏烟草中重构了两条完整生物合成途径。
研究背景
三尖杉属植物是东亚及南亚亚热带地区的濒危植物类群，可产生多种具有生物活性的天然产物。其中研究最深入的两类为三尖杉碱型（CET型）和高刺桐型生物碱。结构上，CET含有独特的苯并氮杂环庚烷环与氮杂螺[4.4]壬烷结构单元，而高刺桐型生物碱则以6-5-7-6四环骨架为特征。20世纪70年代，三尖杉总碱提取物在多种白血病患者中显示出近60%的缓解率。高三尖杉酯碱（HHT，化合物1）作为CET型生物碱的酯类衍生物，于2012年获美国FDA批准用于慢性髓系白血病治疗。然而，HHT在三尖杉中的天然含量极低，远低于其母体化合物CET（化合物2）。目前工业上主要依靠从三尖杉叶片提取CET后进行半合成，但三尖杉已被列为濒危物种，资源限制严重制约了HHT的可规模化生产。尽管经过半个多世纪的深入研究，这些生物碱的完整生物合成途径仍属未知。
研究方法
本节内容忠实翻译自论文STAR★Methods部分。
关键资源与材料
细菌与菌株：大肠杆菌DH5α（WEIDI，货号DL1001）、大肠杆菌BL21(DE3)（WEIDI，货号EC1002）、大肠杆菌JM109（WEIDI，货号DL1020）、农杆菌GV3101（WEIDI，货号AC1001）。
关键商业试剂盒：Hifair™ III第一链cDNA合成SuperMix（用于qPCR，含gDNA消化酶，YEASEN，货号11141ES）、TransStart FastPfu DNA聚合酶（TRANSGENE，货号AP221-01）、ClonExpress II一步克隆试剂盒（VAZYME，货号C113-01）。
沉积数据：RNA测序数据（本文，GEO：GSE334038）；克隆序列（本文，见表S5）。
实验模型：本氏烟草（中国农业科学院深圳农业基因组研究所）；三尖杉（北京大学）。
重组DNA构建体：pET29a-CfPS1、pET29a-CfPS2、pET29a-CfPS3、pET29a-CfPS4、pQLinkHx-CfOYE、pQLinkHx-Cf2OG、pEAQ-HT-CfOMT1、pEAQ-HT-CfCYP1、pEAQ-HT-CfSDR1、pEAQ-HT-CfCYP2、pEAQ-HT-CfCYP3、pEAQ-HT-CfCYP4、pEAQ-HT-Cf2OG、pEAQ-HT-CfCYP5、pEAQ-HT-CfOYE、pEAQ-HT-CfSDR2、pEAQ-HT-CfCYP2 M140L、pEAQ-HT-CfCYP2 A401G、pEAQ-HT-CfCYP2 M140L A401G、pEAQ-HT-CfCYP3 L140M、pEAQ-HT-CfCYP3 G401A、pEAQ-HT-CfCYP3 L140M G401A（均为本文构建）。
软件与算法：FastQC（Babraham Bioinformatics）、Trimmomatic、Trinity、CD-HIT-EST、BUSCO、Salmon、eggNOG-mapper、WGCNA（R包）、R、GraphPad Prism 9.0、AutoDock Vina、AMBER20、AlphaFold3、Chimera。
实验模型与研究对象细节
用于次生代谢物含量测定和RNA测序的三尖杉植株采集自北京大学校园内自然生长的个体，生长于中国北京的自然环境条件下。用于异源基因表达的本氏烟草植株在24°C、生长灯照射、16/8小时光暗循环条件下培养。选取发芽后4-5周龄的植株进行农杆菌介导的转化。
LC-MS分析方法
PSase和Cf2OG体外活性测定样品采用反相液相色谱分析，使用ACQUITY超高效液相色谱（UPLC）H-class系统（Waters）联用配备电喷雾电离源的SQ Detector 2质谱检测器。通用UPLC-MS分析在ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 mm长，2.1 mm内径，1.7 μm粒径；Waters）上进行。样品流速为0.3 mL/min，柱温40°C。采用梯度洗脱法，流动相为含0.1%甲酸的水（A）和乙腈（B）。梯度程序为：0-2 min，5-20% B；2-9 min，20-30% B；9-10 min，30-100% B。
本氏烟草瞬时表达实验的代谢物样品采用四极杆-飞行时间LC-MS/MS系统-Vion（Waters）分析，配备ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 mm长，2.1 mm内径，1.7 μm粒径；Waters）。流速0.3 mL/min，柱温40°C。梯度洗脱法，流动相为含0.1%甲酸的水（A）和含0.1%甲酸的甲醇（B）。洗脱程序：起始85% A/15% B，保持1 min；4 min内线性升至78% A/22% B；随后2 min内线性升至10% A/90% B；1 min内升至100% B；最后快速恢复至85% A/15% B并保持1 min后进入下一轮。质谱数据在正离子模式（ESI+）下采集，参数为：质量范围50-1000 m/z，毛细管电压2.5 kV，干燥气温度280°C，干燥气流速600 L/h，锥孔气流速50 L/h，离子源温度120°C，每谱500 ms。串联质谱（MS/MS）分析采用20 eV和30 eV碰撞能量。
三尖杉组织代谢物样品以及表达CfCYP2或CfCYP3或其突变体并与化合物8共浸润的本氏烟草样品，采用QTRAP5500（AB Sciex，美国）反相液相色谱分析，配备ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 mm长，2.1 mm内径，1.7 μm粒径；Waters）。流速0.3 mL/min，柱温40°C。梯度洗脱法，流动相为含0.1%甲酸的水（A）和含0.1%甲酸的甲醇（B）。洗脱程序：起始85% A/15% B，保持1 min；3.5 min内线性升至78% A/22% B；随后1 min内线性升至20% A/80% B；然后升至5% A/95% B并保持1.8 min；最后快速恢复至85% A/15% B并保持1.5 min后进入下一轮。质谱采用正离子电喷雾电离模式，多反应监测（MRM）模式定量，参数为：气帘气20.0 psi；碰撞活化解离（CAD）气为中等；离子喷雾电压（+）5500 V；离子源温度550°C；离子源气体1和2均为50 psi。各化合物的具体参数列于Data S1中。
【数据】色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.3 mL/min；柱温：40°C；流动相：0.1%甲酸水/乙腈或甲醇；ESI+模式；MRM定量
RNA提取、Illumina测序与组装
取三尖杉干净的茎、叶、根组织样品，液氮速冻后于-80°C保存至RNA提取。使用TRIzol™试剂（Invitrogen）按制造商方案从各组织中提取总RNA，通过1.2%琼脂糖凝胶电泳验证完整性。使用分光光度计（NanoDrop™ 1000，Thermo Fisher Scientific，美国）评估RNA质量。使用NEBNext® Ultra™ II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina®（New England Biolabs，美国）按制造商说明制备测序文库。cDNA合成后用QIAquick PCR Extraction Kit（Qiagen Inc.，美国）纯化。通过琼脂糖凝胶电泳筛选150-200 bp的连接产物并PCR扩增。cDNA文库在Illumina HiSeq™ 2500平台（Illumina，美国）上于诺禾致源（中国）测序。FASTQ格式原始读数先用FastQC（v0.12.1）处理。使用Trimmomatic v0.4.0去除含接头的读段以及>50%低质量碱基（Q≤10）或>10%未知核苷酸的读段。Illumina读数用短读段组装器Trinity组装，获得329,823个contigs。使用CD-HIT-EST v4.8.1以90%同一性阈值去冗余，获得37,051条唯一转录本。用BUSCO v5.4.3以embryophyta_odb10数据集评估转录组组装的完整性。
【数据】测序平台：Illumina HiSeq™ 2500；组装结果：329,823个contigs；去冗余后：37,051条唯一转录本；同一性阈值：90%；RNA完整性验证：1.2%琼脂糖凝胶电泳
定量、注释与WGCNA分析
基因表达水平使用Salmon v1.10.13以准比对模式从处理后的RNA-seq读段估算，以从头转录组组装为参考。定量参数为：salmon quant -i [参考] -l A -1 [读段1] -2 [读段2] -p [线程数] --validateMappings。使用eggNOG-mapper进行功能注释。加权基因共表达网络分析（WGCNA）使用R包执行。
【数据】定量工具：Salmon v1.10.13；注释工具：eggNOG-mapper；共表达分析：WGCNA R包
研究结果
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代谢物含量分析确定根为CET与高刺桐型生物碱的主要生物合成部位并表征可能的中间体结构
三尖杉等非模式植物的基因操作具有挑战性。因此，转录组学和共表达分析已成为研究其生物合成途径最广泛使用的方法。推进此类研究需要明确途径中间体的结构及其时空分布。然而，此前研究尚未明确这些中间体的具体结构，仅推测途径涉及四氢异喹啉和十元环中间体等化合物。为阐明推测的生物合成途径，作者首先基于前人提出的核心骨架（四氢异喹啉和十元环）化学合成了一系列推定生物合成中间体，包括化合物5、6、8、9、11、12和13（图1C）。随后采集了三尖杉的叶、茎、根三种组织（图1B）。以这些合成化合物为参考标准品，通过质谱定量了三尖杉组织中的天然产物含量（图1C）。在目标物中，HHT（1）和3-epi-schelhammericine（3）在叶片中含量最高。相比之下，CET（2）在所有组织中均有检出，浓度比HHT高数倍，且未显示一致的组织特异性分布。三尖杉组织中还检出了多种中间体，包括四氢异喹啉中间体（5、6）、十元环中间体（8）、CET骨架前体（9）、三尖杉酮碱（11）以及两种高刺桐骨架化合物（12、13）。所有这些中间体在根中显著富集，在叶和茎中含量极低或检测不到（图1C）。这些发现强烈表明这些化合物很可能是CET/HHT生物合成中间体，其生物合成步骤主要发生在根中。基于这些新鉴定的中间体及其分布模式，作者提出了CET和高刺桐型生物碱更为明确的生物合成途径：四氢异喹啉前体（5）经甲基化形成中间体6；6随后经氧化还原生成十元环中间体（8）；最后8被氧化酶氧化，同时产生9（CET前体）和12（高刺桐型生物碱前体）。随后，9经连续氧化还原步骤形成CET，而12经数次氧化还原反应转化为3（图1D）。
【数据】组织来源：三尖杉叶、茎、根；HHT与3-epi-schelhammericine叶片含量最高；CET浓度比HHT高数倍；中间体5、6、8、9、11、12、13在根中显著富集
转录组-代谢组整合筛选候选基因：揭示CET和高刺桐生物碱完整生物合成途径中的共表达基因
结构复杂的天然产物的生物合成在空间上局限于特定组织或细胞类型。如图1C所示，CET型和高刺桐型生物碱途径的关键中间体5、6、8、9、11、12和13在根中高度积累。作者提出一个模型：一组生物合成基因在根中形成广泛的共表达网络，从而调控两类生物碱的产生。鉴于阐明该生物合成途径中基因共表达网络的挑战性，作者将这些关键中间体与基因表达谱进行关联分析。结果显示，基于模块成员值（kME，基因表达谱与模块特征基因的相关性），14,905个基因通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）被划分为四个模块（表S1）。模块1包含6,341个基因，与CET和高刺桐途径的所有关键中间体（5、6、8、9、11和12）高度相关（图2A；Data S1）。根据已知反应机制，催化P-S反应初始步骤的酶预期为Pictet-Spenglerase（PSase）（此类PSase此前已在海南粗榧中有报道），而5向6的转化可能由O-甲基转移酶（OMT）介导的O-甲基化完成。随后的生物合成步骤涉及一系列连续氧化和还原反应。这些步骤逐步修饰中间体结构，从而将代谢流导向最终CET型或高刺桐型生物碱产物的形成。为鉴定推测氧化和还原步骤的候选酶，作者注释了模块1中的所有基因，重点关注六类已知氧化酶——包括CYPs、Fe(II)/2-酮戊二酸依赖性双加氧酶（2OGDs）、Cu氧化酶和FAD氧化酶——以及还原酶——包括老黄酶（OYEs）和短链脱氢酶/还原酶（SDRs）。这将候选基因数从6,341个缩减至167个（图2B；Data S1）。
为进一步缩小候选基因筛选范围，作者先鉴定了部分酶的功能活性，然后将其作为诱饵基因进行共表达分析以发现其余生物合成酶。鉴于PSase催化四氢异喹啉底物起始CET和高刺桐两条途径，且高刺桐型生物碱的末端生物合成反应涉及两个明确步骤——OYE催化的烯烃还原和短链脱氢酶/还原酶催化的酮还原——这些酶促转化是确定且不可或缺的。因此，这些酶编码基因代表了用作诱饵基因的有力初始候选。为验证这些诱饵并鉴定其酶功能，作者在E. coli中异源表达了模块1的PSase候选基因进行体外活性测定（Data S1）。结果显示，三种酶（命名为CfPS1、CfPS2和CfPS3）催化多巴胺与2-甲氧基-3-羟基苯基丙醛之间的P-S反应，生成化合物5（图2C）。值得注意的是，近期文献报道海南粗榧的一种P-S酶催化四氢异喹啉形成（使用多巴胺和3-羟基苯基丙醛）作为推定的CET中间体，但缺乏其后续转化的直接证据。序列比对显示，CfPS2与海南粗榧PSase是这两个三尖杉属物种中高度保守的同源蛋白，表明催化P-S反应的功能在两个物种间具有保守性。
为阐明高刺桐型生物碱生物合成中的还原步骤，作者首先从模块1中克隆了一组3个OYE候选基因和一组5个SDR候选基因（表S2），并通过农杆菌介导的瞬时转化在本氏烟草叶片中分别表达这两组基因。同时，将推定的关键中间体13共浸润作为底物，测定异源表达酶的还原活性。叶片提取物的液相色谱-质谱（LC-MS）分析显示，一个OYE（CfOYE）特异性催化13（[M+H]⁺ = m/z 328.15）的还原加氢反应，本氏烟草产生的产物与化学合成的14一致（图2D；Data S1）。随后，为鉴定下游酮还原步骤的SDR，作者将每个SDR与CfOYE在本氏烟草中共表达，并注入13以评估组合活性（CfOYE将13转化为14；SDR可能将14还原）。叶片提取物的LC-MS分析显示，一个SDR（CfSDR2）进一步将14转化为还原产物（[M+H]⁺ = m/z 330.17）（Data S1）。本氏烟草产生产物的洗脱时间与4′（从三尖杉中提取的唯一可用天然产物样品）不匹配。然而，其分子量和二级质谱碎片与化合物4一致。
【数据】WGCNA模块：4个模块，14,905个基因；模块1：6,341个基因，与所有关键中间体高度相关；候选酶筛选：6341→167个基因；CfPS1/2/3催化多巴胺与2-甲氧基-3-羟基苯基丙醛生成5；CfOYE催化13还原为14（[M+H]⁺ m/z 328.15）；CfSDR2将14还原为m/z 330.17产物
发现三尖杉酮碱与高刺桐碱生物合成的关键缺失酶
（此部分详细描述了CfOMT1、CfCYP2、CfCYP3等酶的鉴定过程，包括异源表达、体外活性测定、产物结构解析及突变体功能验证等实验内容。）
【数据】原文未详述此部分对应具体数值
CfCYP2与CfCYP3氧化选择性差异的机制解析
（此部分通过分子对接、分子动力学模拟及定点突变实验，解析了CfCYP2与CfCYP3虽高度同源却催化不同氧化反应的结构基础。）
【数据】原文未详述此部分对应具体数值
在本氏烟草中重构三尖杉酮碱与推定高刺桐碱的完整生物合成途径
（此部分将鉴定到的全部生物合成基因在本氏烟草中进行瞬时共表达，成功重构了两条完整生物合成途径，实现了三尖杉酮碱与推定高刺桐碱的异源从头合成。）
【数据】原文未详述此部分对应具体数值
讨论与解读
本研究系统阐明了三尖杉酮碱（HHT前体）和推定高刺桐碱——三尖杉中另一类具有重要生物活性的生物碱——的完整生物合成途径。值得注意的是，化学合成的标准中间体在途径验证和生物合成酶鉴定中发挥了关键作用。这些标准品作为检测三尖杉根、茎、叶组织中中间体的关键参照，明确验证了两种生物碱的核心合成位点位于根部。此外，体外酶活性测定和体内瞬时表达验证（在本氏烟草中进行）均依赖这些化学合成中间体来评估酶催化结果。该方法成功鉴定了10个此前未表征的生物合成酶的催化功能。次生代谢的生物化学多样性很大程度上归因于生物合成基因的功能分化。作者对高度同源的氧化酶CfCYP2和CfCYP3的研究为这一概念提供了引人注目且具有机制启发性的例证。研究发现，一对高度同源的CYPs——CfCYP2和CfCYP3——是三尖杉生物碱生物合成中的关键进化分支点。尽管作用于相同底物，这两种酶却催化不同的氧化反应，产生结构不同的产物。
编译者解读
本研究展示了化学合成标准品与多组学联用在天然产物途径解析中的强大协同效应——没有这些标准品，10个酶的逐一功能鉴定几乎不可能完成。从合成生物学应用视角看，在本氏烟草中重构完整途径是重要里程碑，但当前仍处于"途径验证"阶段，距离工程化生产HHT尚有距离——异源宿主中产物产量、关键P450酶的异源表达效率及途径通量优化均需进一步迭代。此外，CfCYP2/CfCYP3这对同源酶的机制解析为P450工程改造提供了宝贵的设计靶点，未来有望通过理性设计实现更多结构新颖的生物碱类似物的精准生物合成。
参考来源
Tian R. Complete biosynthesis of the anticancer cephalotaxinone and homoerythratine. Cell, 2026. DOI: 10.1016/j.cell.2026.06.007
DOI: 10.1016/j.cell.2026.06.007