来源：In-line extraction coupled with selective ion-exchange resin enhances lactate-driven caproate biosynthesis: Alleviating undissociated caproate stress and stabilizing microbial functional cooperation（Journal of Environmental Chemical Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
己酸是一种高价值平台化学品，微生物链延长（CE）可利用乳酸作为电子供体将其从乙酸和丁酸合成。然而，产物积累引发的反馈抑制长期制约着这一生物合成路线的效率。本研究构建了一套耦合选择性离子交换树脂（GC08）的在线萃取系统，将未解离己酸浓度从对照组的8.61–12.44 mM降至2.11 mM，使己酸选择性从45.47%提升至75.66%，产率最高达4.33 mmol·L⁻¹·d⁻¹（较对照组最高提升6.23倍）。宏基因组分析揭示了在线萃取如何重塑微生物群落结构与功能协作，为富含乳酸有机废弃物的资源化利用提供了新策略。
研究背景
己酸是一种高价值平台化学品，在可再生生物燃料生产中应用广泛，其能量密度和分离特性优于甲烷和短链脂肪酸。微生物链延长通过逆β-氧化（RBO）和脂肪酸生物合成（FAB）途径，以乳酸为电子供体将乙酸和丁酸转化为己酸。除纯乳酸外，富含乳酸的有机废物流也可通过链延长实现己酸生产——例如，果蔬废弃物酸化发酵液中39.77%的产物为己酸。与常规化学合成相比，该生物技术路线更具可持续性，有助于碳中和废弃物资源化和减排。
然而，乳酸驱动的己酸生物合成面临两大关键挑战。其一，丙烯酸途径和Wood-Werkman循环的竞争会将乳酸导向奇数碳羧酸盐（如丙酸和戊酸），尤其在高乳酸负荷条件下更为显著。当乳酸补充量超过7.69 g COD/L时，约三分之一的电子（33.39%）被分流至奇数碳羧酸盐，而非己酸（仅占23.13%）。其二，己酸产物积累本身对产己酸微生物产生毒性抑制，导致链延长效率下降甚至系统崩溃。本研究针对上述瓶颈，探索了在线萃取耦合选择性离子交换树脂对乳酸驱动己酸生物合成的调控效果。
研究方法
2.1 接种物与化学试剂
本研究所用接种物取自某奶牛场的牛粪处理系统。采集的样品经2 mm不锈钢筛网过滤以去除大颗粒。含微生物的液体部分转移至配备双层涡轮搅拌桨的连续搅拌釜反应器中（80 rpm，35 ± 1°C）。反应器填充含微晶纤维素（20 g/L）和胰蛋白胨（10 g/L）的混合培养基，并在严格厌氧条件下进行长期富集。乙醇（纯度>99.5%）、乳酸（>99.5%）、乙酸（>99.5%）、丁酸（>99.0%）和己酸（>99.0%）购自上海麦克林生化科技有限公司。除非另有说明，所有试剂均为分析纯。
【数据】接种物来源：奶牛场牛粪处理系统；筛网孔径：2 mm；搅拌转速：80 rpm；温度：35 ± 1°C；微晶纤维素：20 g/L；胰蛋白胨：10 g/L；试剂纯度：>99.0%–>99.5%
2.2 产物抑制对己酸生物合成影响的实验
为评估羧酸产物对己酸生物合成的抑制作用，在耦合在线生产萃取系统之前构建了己酸积累系统，步骤如下：
步骤1：己酸积累实验。 将总计0.6 L接种物加入工作体积为1.8 L的厌氧发酵反应器中，培养基含乳酸和丁酸，分别作为电子供体（ED）和电子受体（EA）（见表S1）。所有反应器接种物体积相同以确保组间可比性。反应器以半连续模式运行，分为阶段I和阶段II。为促进己酸积累，有机负荷从阶段I的275.00 mM C提高至阶段II的458.33 mM C。相应地，乳酸和丁酸的补充量分别从75.00 mM和12.50 mM提高至101.85 mM和38.19 mM。根据乳酸消耗动力学，阶段I水力停留时间（HRT）设为6天，阶段II设为10天，以实现乳酸完全转化并减少己酸损失。其他培养基组分包括（每升）：0.25 g NH₄Cl、0.20 g MgSO₄·7H₂O、0.20 g CaCl₂、0.80 g NaCl、0.25 g L-半胱氨酸、0.23 g KH₂PO₄、0.31 g K₂HPO₄、10 g 2-溴乙基磺酸钠（2-BES）、1 mL维生素溶液和1 mL微量元素溶液。反应器在35 ± 1°C下培养，配备搅拌装置，搅拌速度设为120 rpm，每15分钟搅拌5分钟。反应器初始pH调至5.5，每次更换培养基后用N₂气（>99.99%）吹扫5分钟以创造厌氧环境。下次操作前暂停搅拌30分钟使悬浮固体沉降。产物积累期间定期测定羧酸浓度。
步骤2：产物抑制实验。 将富含己酸的富集接种物转移至工作体积为0.2 L的厌氧血清瓶中。初始羧酸浓度如下（mM）：乙酸9.66；丙酸4.99；丁酸46.99；戊酸16.42；己酸41.75。乳酸以20或40 mM添加，丁酸维持在20 mM。所有其他培养基组分与上述相同。系统以序批模式运行，定期取样进行羧酸分析。每组设三次重复。当乳酸完全消耗后，更换新鲜培养基，继续运行至少三个连续周期。
【数据】接种物体积：0.6 L；反应器工作体积：1.8 L；阶段I有机负荷：275.00 mM C；阶段II有机负荷：458.33 mM C；阶段I乳酸/丁酸：75.00/12.50 mM；阶段II乳酸/丁酸：101.85/38.19 mM；HRT：6天（阶段I）/10天（阶段II）；温度：35 ± 1°C；搅拌：120 rpm，每15 min搅拌5 min；初始pH：5.5；N₂吹扫：5 min；沉降时间：30 min；2-BES浓度：10 g/L；血清瓶工作体积：0.2 L；初始羧酸浓度（mM）：乙酸9.66、丙酸4.99、丁酸46.99、戊酸16.42、己酸41.75；乳酸添加量：20或40 mM；丁酸维持浓度：20 mM；重复次数：3
2.3 离子交换树脂在线产物萃取对己酸生物合成的调控
为评估在线产物萃取对己酸生物合成的调控效果，构建了己酸生产-萃取耦合系统（图1）。前期研究评估了四种阴离子交换树脂：季胺型强碱树脂（D201）、叔胺型弱碱树脂（D301）、大孔弱碱树脂（GC08）和乙醇胺型强碱树脂（ND922）。对比结果显示，羟基型GC08在pH 5.5下对己酸具有最高选择性，选择性系数达71.30%。D201、D301和ND922的己酸选择性系数分别为38.90%、57.80%和48.20%。因此，GC08被选为最优吸附剂。使用真实发酵液的进一步验证确认了其可靠性能：羟基型GC08的平衡己酸吸附容量达115.80 mg/g，选择性为83.70%（图S1）。0.1 M碱性乙醇溶液被确定为最有效的解吸剂（己酸解吸容量：88.80 mg/g；选择性：82.80%）。
按第2.2节所述制备的厌氧瓶与含GC08树脂的在线萃取单元耦合。每瓶添加乳酸（26.66 mM）和丁酸（10.00 mM），其他培养基组分与前述相同。在设定时间间隔收集上清液样品进行羧酸定量。反应器以半连续模式运行，HRT在不同运行阶段动态调整为2天、3天和5天。当乳酸耗尽时，从反应器中取出40 mL发酵液，以2000 rpm离心2分钟。上清液替换为等体积新鲜培养基，离心后的生物质沉淀返回反应器。在线萃取过程间歇运行，萃取处理在每个HRT周期中点实施，早于每个周期结束时的培养液更换。每次萃取操作中，反应器样品首先以2000 rpm离心2分钟。随后，将50 mL上清液与GC08树脂一起转移至萃取柱中进行2小时己酸吸附。吸附后，处理液返回瓶中。负载树脂随后使用含0.1 M NaOH的乙醇溶液解吸，并测定解吸液中的羧酸浓度。树脂再生后回收用于后续萃取。经过两个操作周期后，树脂用量增加至3 g，随后增加至5 g，以评估树脂装载量对己酸生物合成的影响。不进行在线萃取的对照实验在相同条件下进行。
【数据】树脂类型：D201（季胺强碱）、D301（叔胺弱碱）、GC08（大孔弱碱）、ND922（乙醇胺强碱）；GC08己酸选择性系数：71.30%；D201/D301/ND922选择性系数：38.90%/57.80%/48.20%；GC08平衡吸附容量：115.80 mg/g；GC08选择性：83.70%；解吸剂：0.1 M碱性乙醇；解吸容量：88.80 mg/g；解吸选择性：82.80%；乳酸添加量：26.66 mM；丁酸添加量：10.00 mM；HRT：2/3/5天（动态调整）；取样体积：40 mL；离心：2000 rpm，2 min；萃取上清液体积：50 mL；吸附时间：2 h；树脂用量：初始→3 g→5 g
2.4 分析方法
乳酸使用高效液相色谱（HPLC，e2695，Waters，美国）定量，配备示差折光检测器（2414 RID）。取10 μL过滤后上清液，在Aminex HPX-87H色谱柱（300 mm × 7.8 mm，9 μm粒径，Bio-Rad，美国）上分离。流动相为50 mM硫酸溶液，流速0.5 mL/min。乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸使用配备火焰离子化检测器的气相色谱（GC-FID，9790 Plus，福立，中国）分析。取1 μL过滤后上清液注入DB-FFAP色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，Agilent，美国）。进样口和检测器温度均维持在220°C。柱温箱初始温度100°C保持2 min，以15°C/min升温至200°C并保持4 min。氩气作为载气，流速20 mL/min，进样采用分流模式（分流比1:30，吹扫0.5 min）。FID以氢气和合成空气运行，流速分别为30和300 mL/min。
【数据】HPLC系统：e2695，Waters；检测器：2414 RID；进样量：10 μL；色谱柱：Aminex HPX-87H（300 mm × 7.8 mm，9 μm）；流动相：50 mM硫酸；流速：0.5 mL/min；GC系统：9790 Plus，福立；进样量：1 μL；色谱柱：DB-FFAP（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；进样口/检测器温度：220°C；柱温程序：100°C保持2 min→15°C/min升至200°C保持4 min；载气：氩气，20 mL/min；分流比：1:30；FID氢气/空气流速：30/300 mL/min
2.5 计算方法
为评估耦合在线萃取系统对己酸生物合成的影响，按式(1)计算己酸选择性：
羧酸选择性 = EC6 / (EC3+C5) × Es
其中EC6和EC3+C5分别表示己酸和奇数碳羧酸盐的摩尔电子数。
【数据】选择性计算公式：EC6/(EC3+C5)×Es（原文式(1)）
研究结果
3.1 产物积累对己酸生产的抑制作用
通过30天的高乳酸负荷运行构建了己酸积累系统。在阶段I（0–8天），牛粪接种物以75.0 mM乳酸和12.5 mM丁酸供给，HRT为6天。如图2a所示，乳酸在6天内完全消耗，丁酸从38.99 mM降至33.80 mM。这一变化与其他羧酸盐的形成同步发生。乙酸略有增加（从32.72至34.47 mM），而已酸产量从1.76 mM急剧上升至15.77 mM，选择性达61.31%，产率为3.49 mmol·L⁻¹·d⁻¹（图S2）。丙酸和戊酸也大量积累，其综合选择性和产率分别达25.35%和2.26 mmol·L⁻¹·d⁻¹。
在阶段II（10–30天），乳酸和丁酸补充量显著增加至101.85和38.19 mM，HRT延长至10天。在此条件下，己酸进一步积累，第30天达到71.32 mM。己酸选择性和产率初期升至73.57%和4.08 mmol·L⁻¹·d⁻¹，但到阶段II结束时下降至52.56%和2.76 mmol·L⁻¹·d⁻¹。丙酸和戊酸呈现相似趋势，分别达到35.70和28.27 mM。奇数碳羧酸盐的最大产率（5.82 mmol·L⁻¹·d⁻¹）超过己酸，其总选择性峰值达43.83%，随后降至21.36%。这些结果证实高乳酸负荷可激活丙烯酸途径，增强奇数碳羧酸盐的形成。丁酸也出现积累，而乙酸相对阶段I下降，可能归因于通过磷酸丁酰转移酶或链延长反应将乙酸转化为丁酸。总体而言，己酸在整个过程中始终是主要产物，表明己酸生物合成系统成功建立。
尽管如此，己酸生产效率在高乳酸负荷下下降，提示产物积累减弱了己酸生物合成。基于上述观察，本研究进一步探究：持续供给乳酸时，产物积累是否会导致己酸生物合成受抑甚至崩溃？为此，系统额外监测27天，乳酸和丁酸补充量均降至20 mM。如图2b所示，己酸形成高效运行至第19天，期间乳酸完全消耗，己酸浓度从40.07 ± 0.15 mM增加至90.15 ± 3.30 mM。然而第20天后，乳酸开始积累（11.62–16.74 mM）。在此期间，己酸生产停止，浓度低于丁酸，表明乳酸驱动的己酸生物合成受到抑制。在整个27天培养期间，pH仅轻微波动（5.51 ± 0.00–5.87 ± 0.03）。
值得注意的是，未解离己酸浓度持续上升，第15天达到9.86 ± 0.29 mM。已有研究报道，3.3 mM的未解离己酸即可降低丁酸向己酸的延伸效率，而≥7.5 mM的浓度可能因产物对微生物的毒性而抑制链延长反应。这表明抑制效应可能在该时期已经开始，尽管己酸生产直至第20天仍相对稳定——链延长相关微生物可能能够暂时耐受升高的未解离己酸并维持稳定的代谢活性。第20天后，未解离己酸达到最大值11.60 ± 0.42 mM，最终导致己酸生物合成受到严重抑制。
【数据】阶段I（0–8天）：乳酸75.0 mM、丁酸12.5 mM、HRT 6天；乳酸完全消耗时间：6天；丁酸变化：38.99→33.80 mM；乙酸变化：32.72→34.47 mM；己酸变化：1.76→15.77 mM；己酸选择性：61.31%；己酸产率：3.49 mmol·L⁻¹·d⁻¹；丙酸+戊酸选择性/产率：25.35%/2.26 mmol·L⁻¹·d⁻¹；阶段II（10–30天）：乳酸101.85 mM、丁酸38.19 mM、HRT 10天；第30天己酸：71.32 mM；选择性峰值→末期：73.57%→52.56%；产率峰值→末期：4.08→2.76 mmol·L⁻¹·d⁻¹；丙酸/戊酸峰值：35.70/28.27 mM；奇数碳羧酸盐最大产率：5.82 mmol·L⁻¹·d⁻¹；奇数碳羧酸盐选择性峰值→末期：43.83%→21.36%；额外27天监测：乳酸/丁酸均20 mM；第19天己酸：90.15 ± 3.30 mM；第20天后乳酸积累：11.62–16.74 mM；pH范围：5.51 ± 0.00–5.87 ± 0.03；第15天未解离己酸：9.86 ± 0.29 mM；未解离己酸最大值：11.60 ± 0.42 mM
3.2 在线萃取对缓解产物抑制和强化己酸生物合成的影响
为评估选择性产物去除能否缓解己酸生物合成中的抑制，将上述己酸积累反应器与大孔弱碱树脂（GC08，羟基型，3–5 g）在线萃取装置集成。系统性能与不进行萃取的半连续运行22天的对照反应器进行比较。报告浓度仅对应反应器液体中溶解的羧酸盐，不含解吸过程中回收的树脂捕获己酸（净己酸产量见图S3）。
如图3a和3d所示，对照反应器表现出高度不稳定的己酸生产。己酸生物合成在前7天内初步恢复，从28.48 mM增至49.92 mM。相应地，己酸选择性和产率从第3天的26.58%和1.21 mmol·L⁻¹·d⁻¹提升至第7天的58.51%和2.85 mmol·L⁻¹·d⁻¹。乙酸和戊酸同步积累，而丙酸和丁酸下降。然而，己酸生产在第8至10天之间突然停止。在此期间，未解离己酸浓度达到10.28 mM（图3c），超过了此前报道的链延长微生物抑制阈值，可能造成急性毒性。尽管己酸生产后来恢复，但性能仍显著减弱。第14至16天，己酸选择性和产率降至14.03%和0.71 mmol·L⁻¹·d⁻¹，至第17至22天仅部分恢复（55.12%和0.70 mmol·L⁻¹·d⁻¹）。后期阶段，乳酸不再被完全消耗（剩余7.85 mM），表明乳酸氧化活性受损。乙酸和丙酸下降，而丁酸和戊酸分别积累至71.43和12.45 mM。高丁酸水平表明乙酸向丁酸的转化仍在进行，但后续向己酸的延伸受到抑制。这与该阶段持续存在的未解离己酸高水平（8.61–12.44 mM）一致。
这些趋势表明，己酸积累导致己酸生物合成逐步恶化。根据式(3)，持续的己酸积累增加了总羧酸浓度，而pH在5.5附近的轻微波动有利于己酸以未解离形式存在。这促进了未解离己酸的积累，最终抑制了己酸生物合成。
相比之下，将己酸积累反应器与在线萃取装置耦合后，整个运行期间己酸生物合成持续且稳步改善。己酸浓度从第0天的33.90 mM增加至第19天的55.37 mM（图3b），伴随高且不断上升的选择性（45.47%–75.66%）和产率（2.49–4.33 mmol·L⁻¹·d⁻¹）。与对照相比，己酸选择性在0–3天、4–7天、14–16天和17–19天运行区间分别提高120.76%、4.59%、224.11%和37.26%。产率提升更为显著，分别达到2.16倍、1.02倍、3.48倍和6.23倍。乙酸适度积累（7.38–19.56 mM），表明部分来自乳酸的还原当量被分流至乙酸形成。然而，丁酸维持在较低水平（23.19–31.16 mM），远低于对照观察到的水平，凸显了抑制胁迫解除后丁酸向己酸延伸的高效性。奇数碳羧酸盐也有所增加，但其最大选择性（27.31%）低于对照（34.72%），表明在抑制减轻条件下丙烯酸途径的竞争活性减弱。
GC08用量本身并非应用在线萃取系统时己酸生产效率的决定因素。GC08装载量与己酸产率（Pearson’s r = 0.7569）和选择性（Pearson’s r = 0.4665）之间未发现显著线性相关（图S4）。观察到的改善更可能归因于……
【数据】对照反应器运行时间：22天；己酸变化（0–7天）：28.48→49.92 mM；选择性变化（第3天→第7天）：26.58%→58.51%；产率变化（第3天→第7天）：1.21→2.85 mmol·L⁻¹·d⁻¹；第8–10天未解离己酸：10.28 mM；第14–16天选择性/产率：14.03%/0.71 mmol·L⁻¹·d⁻¹；第17–22天选择性/产率：55.12%/0.70 mmol·L⁻¹·d⁻¹；残余乳酸：7.85 mM；丁酸/戊酸积累：71.43/12.45 mM；未解离己酸水平：8.61–12.44 mM；在线萃取组：己酸变化（第0天→第19天）：33.90→55.37 mM；选择性范围：45.47%–75.66%；产率范围：2.49–4.33 mmol·L⁻¹·d⁻¹；选择性提升：120.76%/4.59%/224.11%/37.26%（各区间）；产率提升倍数：2.16/1.02/3.48/6.23倍；乙酸积累：7.38–19.56 mM；丁酸水平：23.19–31.16 mM；奇数碳羧酸盐最大选择性：27.31%（对照34.72%）；Pearson相关系数：产率r = 0.7569、选择性r = 0.4665
3.3 微生物群落结构分析
（注：原文结果部分后续内容涉及微生物群落组成分析、功能基因丰度分析等。图4–图7分别展示了属水平和种水平微生物群落组成、CE细菌丰度、乳酸氧化或SCFA产生协作菌丰度、产物积累下应激耐受菌丰度、乳酸衍生己酸和SCFA产生途径及基因相对丰度、物种水平功能聚类统计分析等结果。）
【数据】微生物群落分析：属/种水平组成见图4；CE细菌丰度见图4c；乳酸氧化/SCFA产生协作菌见图4d；应激耐受菌见图4e；途径与基因丰度见图5；物种水平功能聚类Z-score热图见图6
讨论与解读
本研究证明，选择性在线产物萃取可有效缓解产物抑制并强化乳酸驱动的生物己酸生产。通过将基于离子交换树脂的萃取系统耦合至受抑反应器，未解离己酸浓度显著降至2.11 mM，而对照组为8.61–12.44 mM。较低产物胁迫使己酸生产在19天内保持稳定且持续改善。己酸选择性从45.47%提升至75.66%，产率达4.33 mmol·L⁻¹·d⁻¹，较对照选择性提高4.59%–224.11%，产率提高1.02–6.23倍。微生物群落分析显示，在线萃取促进了链延长和乳酸氧化细菌的富集，而对照反应器在己酸积累条件下更有利于应激耐受型类群。宏基因组结果进一步揭示，乳酸氧化和乙酰辅酶A生成相关基因丰度增强，支持高效的乙酰辅酶A供应。RBO和FAB两条途径在早期被激活，尽管总体基因丰度后期下降，微生物功能仍保持稳定。值得注意的是，在线萃取反应器中的关键微生物功能集中于核心类群，尤其是Caproicibacterium lactatifermentans和Sphaerochaeta sp.。相比之下，对照反应器的功能贡献更为分散，反映了微生物协作的弱化。
编译者解读： 该研究以"产物抑制—原位解除—群落重构"为主线，将化工分离思维嵌入生物发酵过程，方法设计具有鲜明的合成生物学系统整合特征。选择GC08树脂的核心逻辑在于其对己酸的选择性吸附系数（71.30%）显著优于其他商用树脂，且0.1 M碱性乙醇可实现温和解吸和树脂回用，为连续化生产提供了工程可行性。值得关注的是，在线萃取不仅降低了未解离己酸浓度，更通过改变选择性压力重塑了微生物互作网络——功能基因集中于核心菌种而非分散于整个群落，这一发现提示"生态位工程"可能比单纯基因改造更能维持复杂发酵系统的稳定性。然而，树脂的长期使用寿命、解吸液的后处理成本以及放大过程中的传质效率仍待进一步验证。从应用角度看，该策略为高浓度有机废水（如食品加工废水和乳品厂废水）的定向酸化-链延长耦合工艺提供了可直接借鉴的原型方案。
参考来源
Zhuo M. In-line extraction coupled with selective ion-exchange resin enhances lactate-driven caproate biosynthesis: Alleviating undissociated caproate stress and stabilizing microbial functional cooperation. Journal of Environmental Chemical Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.jece.2026.124839
DOI: 10.1016/j.jece.2026.124839