来源：Engineering a versatile Aspergillus niger platform for efficient and scalable biosynthesis of polyketides（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
聚酮类天然产物具有广泛的药理活性和工业价值，但异源表达平台效率不足限制了其规模化生物合成。本研究系统评估多种微生物宿主，筛选出黑曲霉HL-1作为高效真菌底盘。通过亚细胞区室化分析、前体代谢流强化、多拷贝整合等策略，单萜素J和三乙酸内酯（TAL）在摇瓶中分别达到1.68 g/L和7.50 g/L，在1.5-L生物反应器中进一步提升至2.61 g/L和25.08 g/L。研究还建立了通用型III型聚酮合酶表达平台，实现十种异源PKS的功能表达，柚皮素摇瓶产量达384.91 mg/L。
研究背景
聚酮天然产物因其多样的生物活性和结构复杂性，在制药工业和生物基化学品生产中具有显著商业价值。这些天然产物主要通过细菌、真菌和植物中的聚酮合酶（PKS）途径，利用酰基辅酶A和丙二酰辅酶A等前体合成，是药物发现的丰富资源库。迄今已有雷帕霉素、洛伐他汀、阿维菌素等多种聚酮衍生药物获FDA批准用于治疗多种疾病。此外，聚酮还可作为通用分子骨架，用于生物合成胭脂红酸、氨基醇衍生分子等一系列高附加值化合物。
鉴于聚酮类化合物的重大价值，以及天然生产菌株遗传操作困难、产量低等问题，研究者越来越多地探索异源表达系统用于产物发现和规模化生产。随着合成生物学快速发展，细菌、酵母和丝状真菌等多种表达平台已被广泛探索用于聚酮生物合成。黑曲霉作为一种丝状真菌，在有机酸发酵、蛋白质分泌和次级代谢产物生物合成方面具有多功能能力，在制药和食品工业中占据重要地位。
研究方法
2.1 菌株与培养基
大肠杆菌Mach1 T1用作质粒构建的宿主菌。含质粒的Mach1 T1菌株在液体LB培养基中于37°C、220 rpm条件下培养。必要时向培养基中添加100 μg/mL氨苄青霉素以维持质粒稳定性。所有黑曲霉菌株在DPY液体培养基（葡萄糖20 g/L、酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L）中于30°C、220 rpm条件下培养以收集菌丝体用于后续实验。察氏半固体培养基（葡萄糖20 g/L、NaNO₃ 3 g/L、KCl 2 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、FeSO₄·12H₂O 0.1 g/L、琼脂0.005 g/L）用于种子培养，于30°C静置培养。发酵培养基含5%（w/v）玉米淀粉、3%（w/v）玉米浆和2%（w/v）豆粕粉，用于黑曲霉的摇瓶发酵。本研究中使用的所有黑曲霉和大肠杆菌菌株均在−80°C下保存于细胞与18%甘油的混合物中。所有黑曲霉菌株见补充材料。
【数据】培养基：LB、DPY、察氏半固体、玉米淀粉发酵培养基；温度：37°C（大肠杆菌）、30°C（黑曲霉）；转速：220 rpm；氨苄青霉素浓度：100 μg/mL；甘油浓度：18%；保存温度：−80°C
2.2 质粒构建
所有表达质粒均使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit（NEB，美国伊普斯威奇）构建。所有待表达的异源基因均针对黑曲霉进行密码子优化，随后由GenScript（中国南京）合成。pMD18/19/20T系列载体（Takara，日本）作为基础骨架载体。使用KOD One™ PCR Master Mix（TOYOBO，日本）PCR扩增必要表达元件（如启动子、终止子和选择标记），在片段末端设计20-bp同源重叠区。通过引物嵌入重叠区将attB/attP位点整合到载体中。重叠区的GC含量优化至40–60%以确保高效同源重组。所有质粒和引物见补充材料。
【数据】同源重叠区长度：20-bp；GC含量：40–60%；质粒构建试剂盒：NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit；PCR酶：KOD One™ PCR Master Mix
2.3 黑曲霉的遗传转化
黑曲霉HL-1在液体CD培养基中预培养以产生种子培养物。将种子培养物以2–5%（v/v）接种量接种到DPY培养基中，于30°C、220 rpm条件下培养72小时。随后收集菌丝体用于原生质体制备。黑曲霉的遗传转化通过PEG/CaCl₂介导的原生质体转化进行。使用Cas-Design在线服务器设计单导向RNA（sgRNA）。核糖核蛋白复合物（RNP）按先前描述在体外组装，随后用于靶向基因敲除和着陆垫整合。必要时，引入两侧带有loxP位点的选择标记，使其可通过多西环素诱导的Cre重组酶进行受控切除。着陆垫系统促进了多种PKS的表达。
【数据】接种量：2–5%（v/v）；培养时间：72 h；培养温度：30°C；转速：220 rpm；转化方法：PEG/CaCl₂介导的原生质体转化；基因编辑：CRISPR-Cas9 RNP；标记切除：多西环素诱导Cre重组酶
2.4 RNA提取、实时定量PCR和转录组测序
黑曲霉菌株在玉米淀粉发酵培养基中培养72小时，随后收集菌丝体用于后续分析。将菌丝体在液氮中研磨成细粉后，使用HiPure Fungal RNA Kit（Magen，中国广州）按照制造商方案提取总RNA并纯化。纯化后的RNA使用Evo M-MLV RT Kit（ Accurate Biotechnology，中国）反转录为cDNA，该试剂盒整合了gDNA去除和优化试剂，实现一步合成。所得cDNA随后用于常规反转录PCR（RT-PCR）和实时定量PCR（qPCR）分析。gpdA基因（An16g01830）作为qPCR分析的内参。宿主菌株和工程菌株在玉米淀粉发酵培养基中于30°C、220 rpm振荡培养72小时。为宿主菌株和工程菌株构建文库，每个样本两个生物学重复。转录组文库测序由Azenta（中国苏州）完成。带有不同索引的文库进行多重混合，并在Illumina HiSeq/Illumina NovaSeq/MGI2000仪器上进行2×150双端（PE）测序。通过DESeq2（版本1.26.0）鉴定差异表达基因（DEGs）。筛选显著差异表达的阈值设定为p值<0.05且倍数变化>2。
【数据】培养时间：72 h；温度：30°C；转速：220 rpm；生物学重复：2个；测序平台：Illumina HiSeq/NovaSeq/MGI2000；测序模式：2×150 PE；差异表达阈值：p<0.05，倍数变化>2；内参基因：gpdA（An16g01830）
2.5 黑曲霉发酵与生物反应器
工程菌株在玉米淀粉发酵培养基中，使用500-mL摇瓶、100 mL工作体积，于30°C、220 rpm振荡条件下培养7天。目标代谢物的放大生产使用1.5-L生物反应器（Parallel Bioreactor，中国），工作体积500 mL。接种量维持在5–10%（v/v）。
【数据】摇瓶规格：500-mL；工作体积：100 mL（摇瓶）、500 mL（反应器）；发酵时间：7天；温度：30°C；转速：220 rpm；接种量：5–10%（v/v）
2.6 测定方法
对于不产孢的黑曲霉菌株（HL-1和SH-2），培养基以5%（v/v）液体菌丝体接种。对于产孢黑曲霉菌株（CBS 513.88、ATCC 13496、ATCC 1015和ATCC 11414），使用50 mL DPY培养基中10⁸个新鲜孢子进行接种。培养72小时后，收集菌丝体并干燥48小时以测定干细胞重量。
胞内乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A/NAD⁺/NADPH定量：在DPY液体培养基中培养的黑曲霉菌丝体被收集，去除多余水分，在液氮中快速冷冻后研磨成细粉。随后加入RIPA裂解缓冲液（R0010，Solarbio，中国北京）裂解细胞并提取胞内代谢物。提取裂解液中的胞内乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、NAD⁺或NADPH水平分别使用乙酰辅酶A检测试剂盒（D751001，Sangon Biotech，中国上海）、丙二酰辅酶A ELISA试剂盒（KT20428，MSKBio，中国武汉）或NADP⁺/NADPH检测试剂盒（WST-8）（Beyotime，中国上海）按照制造商说明进行定量。
单萜素J的定量参照我们先前研究的方法进行。
三乙酸内酯定量：TAL通过配备UV检测器的HPLC（1220 Infinity LC，Agilent Technologies，美国圣克拉拉）进行定量。具体而言，发酵液以12,000 × g离心10分钟去除细胞。所得上清液用去离子水适当稀释制备测定样品。样品注入HPLC，使用C18色谱柱（Phenomenex Kinetex 10 μL C18，Phenomenex Inc.，美国托伦斯）在40°C下分离。TAL在280 nm处检测。使用由90% A相（含1%乙酸的水）和10% B相（含1%乙酸的乙腈）组成的流动相进行等度洗脱，流速维持在1 mL/min。TAL标准品（CAS: 3749-51-7）购自Macklin，用于制备标准曲线。
（2S）-柚皮素的HPLC分析：取500 μL发酵液与等体积（500 μL）无水乙醇混合提取。混合物剧烈涡旋5分钟确保充分匀质，随后室温下12,000 rpm离心5分钟。上清液经0.22 μm有机相滤膜过滤后进行分析。HPLC分析使用Agilent Technologies 1220系统。分离在Phenomenex C18色谱柱（5 μm，4.6 × 250 mm）上于40°C进行。流动相由溶剂A（含0.1%三氟乙酸的水）和溶剂B（含0.1%三氟乙酸的乙腈）组成。流速设定为1.0 mL/min，进样体积为10 μL。梯度洗脱程序如下：0–10分钟10–40% B，10–15分钟40–60% B，15–18分钟60–10% B，18–25分钟10% B。（2S）-柚皮素使用UV检测器在290 nm处检测。
【数据】接种量：5%（v/v）液体菌丝体或10⁸孢子/50 mL；干燥时间：48 h；离心：12,000 × g 10 min或12,000 rpm 5 min；HPLC柱温：40°C；TAL检测波长：280 nm；流速：1 mL/min；柚皮素检测波长：290 nm；进样体积：10 μL；梯度：10–40% B（0–10 min）、40–60% B（10–15 min）、60–10% B（15–18 min）、10% B（18–25 min）
2.7 显微镜观察
研究结果
3.1 具有工业潜力的高性能黑曲霉菌株筛选
高性能底盘细胞是代谢化合物高效生物合成的基础。为此，选取了六株用于有机酸和蛋白质生产的工业相关黑曲霉菌株。根据表型、稳健性和胞内代谢前体水平的差异，确定适合后续代谢物合成的底盘细胞。黑曲霉具有强大的代谢和蛋白质分泌能力。具体而言，黑曲霉菌株ATCC 1015和ATCC 11414主要用于工业柠檬酸生产，而菌株ATCC 13496、CBS 513.88、SH-2和HL-1用于葡糖淀粉酶生产。在固体培养基上呈现紧凑菌落形态的菌株（HL-1、SH-2、CBS 513.88）在含刚果红的平板上也表现出减少的生长，提示可能存在细胞壁完整性缺陷。与此观察一致，这些菌株在液体培养中呈现均匀、分散的菌丝生长，形成大菌丝球的倾向降低。相反，具有高度扩散、蓬松菌落的菌株（ATCC 13496、ATCC 11414、ATCC 1015）在液体培养中形成大而紧密的菌丝球，表明形态可控性较差（图1A和B）。虽然ATCC 1015和ATCC 11414是有机酸生产的工业主力，但大多数其他菌株也表现出有机酸生产和分泌能力，SH-2除外（可能因其CexA基因表达沉默；数据未显示）。在液体培养72小时后的干细胞重量方面，HL-1和ATCC 13496实现了最高的生物量积累，而SH-2积累最低（图1C）。在六株菌株中，最大DCW在72小时或96小时达到。值得注意的是，HL-1生长最快，在72小时达到峰值，随后在96小时后发生营养耗竭诱导的自溶（图S1）。代谢物谱分析显示，HL-1和SH-2积累了较高水平的胞内乙酰辅酶A和NADPH，因其丰富的前体和还原力而被确定为代谢工程的有前景候选菌株（图1D、E、F）。
丝状真菌具有强大的初级和次级代谢能力，这赋予其生产代谢化合物的显著优势。天然产物的合成，特别是聚酮化合物，不仅需要乙酰辅酶A作为前体，还需要大量丙二酰辅酶A供应。为直观评估不同菌株的胞内丙二酰辅酶A水平，我们使用RppA——一种来自灰色链霉菌的III型PKS——作为生物传感器。该酶将五分子丙二酰辅酶A转化为一分子黄素醌（红色），产生比色输出。结果表明HL-1具有最高的胞内丙二酰辅酶A含量（图S2A）。另一方面，黑曲霉内源次级代谢物合成的核心基因分为11类，共124个核心基因，主要包括T1PKS（I型聚酮合酶）、T3PKS（III型聚酮合酶）、Betalactone、Fungal-RiPP-like、Indole、NI-siderophore、NRPS、NRPS-like、PKS-NRPS、RiPP-like和Terpene。我们的数据进一步表明，在液体发酵条件下，内源核心次级代谢物基因保持转录沉默（图S2B和C），从而最大限度地减少了对异源代谢物表达的干扰。
综上，黑曲霉HL-1可能因细胞壁完整性受损而呈现较短菌丝和更可控的表型特征，非常适合工业应用中的高密度发酵。此外，其高水平的胞内关键代谢前体表明代谢能力强劲，使其成为聚酮生物合成的理想底盘细胞。
【数据】菌株数量：6株；核心次级代谢基因：11类124个；HL-1达到最大DCW时间：72 h；SH-2：有机酸生产缺陷（CexA沉默）
3.2 区室化增强聚酮生物合成
细胞质是细胞内大多数酶表达和代谢反应的主要场所。相比之下，过氧化物酶体主要参与脂质代谢和β-氧化，这些过程产生大量乙酰辅酶A，可用于代谢化合物的合成。为评估这两个区室用于聚酮生物合成的潜力，我们首先对过氧化物酶体靶向信号（PTS）进行了筛选和表征。黑曲霉基因组包含14,057个蛋白质编码基因。生物信息学分析显示，4,648个基因（33.06%）编码主要定位于细胞质的蛋白质，使其成为主要区室，而仅有177个基因（1.25%）编码靶向过氧化物酶体的蛋白质（图S3）。蛋白质导入不同细胞器需要特定的靶向序列。据报道，过氧化物酶体靶向信号主要分为PTS1（C端）和PTS2（N端）两种类型。过氧化物酶体蛋白C端12个氨基酸的多序列比对证实，最C端的三肽（A/S）（K/R）L是过氧化物酶体导入的关键决定因素（图2A）。
基于此，我们将meGFP融合到大丁草来源的T3PKS GhPS的N端，并在其C端附加候选PTS1序列。过氧化物酶体膜蛋白PEX11与mCherry融合以标记过氧化物酶体腔。通过荧光显微镜评估候选信号的靶向效率，考察GhPS-meGFP荧光模式与mCherry-PEX11信号的共定位。结果表明，含有C端SKL或AKL基序的GhPS融合蛋白表现出明显的点状荧光模式，与mCherry-PEX11信号重叠，表明高效靶向过氧化物酶体（图S4）。
为评估不同亚细胞区室的代谢能力，我们将GhPS靶向细胞质或过氧化物酶体。GhPS催化一分子乙酰辅酶A和两分子丙二酰辅酶A缩合形成三乙酸内酯（TAL）（图2B）。我们通过发酵液样品的HPLC分析确认了目标化合物TAL的产生（图2C）。在细胞质表达GhPS的菌株中，绿色荧光信号在整个菌丝中观察到，而在过氧化物酶体靶向菌株中，观察到明显的点状荧光（图2D）。这表明GhPS成功定位于不同细胞区室。虽然由相同启动子控制的GhPS表达水平在细胞质和过氧化物酶体之间无显著差异（图2E），但细胞质中的TAL滴度达到4.39 g/L，显著高于过氧化物酶体中观察到的0.74 g/L（图2F）。此外，使用不同碳源（包括淀粉、葡萄糖、甘油和油酸）培养菌株的结果一致表明，TAL在细胞质中的合成效率高于过氧化物酶体（图S5）。我们还使用基于RppA的生物传感器测量了两个区室中的丙二酰辅酶A水平（图2G）。与表达RppA-SKL的过氧化物酶体靶向菌株相比，在细胞质中表达RppA的菌株在平板上呈现更深的红色。
综上，这些结果表明细胞质比过氧化物酶体支持更高的聚酮生产效率。
【数据】黑曲霉基因总数：14,057；细胞质定位基因：4,648（33.06%）；过氧化物酶体定位基因：177（1.25%）；PTS1关键基序：（A/S）（K/R）L；细胞质TAL滴度：4.39 g/L；过氧化物酶体TAL滴度：0.74 g/L；碳源测试：淀粉、葡萄糖、甘油、油酸
3.3 胞内前体（乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A）优化增强高效聚酮合成
丙二酰辅酶A在微生物代谢中发挥关键作用，是脂肪酸和聚酮代谢物生物合成的关键前体。在细胞质中，柠檬酸被ATP-柠檬酸裂解酶（acl）转化为乙酰辅酶A。乙酰辅酶A随后被乙酰辅酶A羧化酶羧化为丙二酰辅酶A。
（本节后续结果内容因原文节选截断，以下为已提供部分的忠实翻译）
【数据】（本节后续数据因原文节选截断，原文未详述）
3.4 多策略驱动III型聚酮TAL的高效生物合成
（本节结果内容因原文节选截断，以下为已提供部分的忠实翻译）
【数据】（本节后续数据因原文节选截断，原文未详述）
3.5 拷贝数优化增强黑曲霉中TAL生物合成
（本节结果内容因原文节选截断，以下为已提供部分的忠实翻译）
【数据】（本节后续数据因原文节选截断，原文未详述）
3.6 黑曲霉中通用型III型聚酮合酶表达平台
（本节结果内容因原文节选截断，以下为已提供部分的忠实翻译）
【数据】（本节后续数据因原文节选截断，原文未详述）
讨论与解读
黑曲霉作为一种丝状真菌，凭借其在有机酸发酵、蛋白质分泌和次级代谢产物生物合成方面的多功能能力，具有重要的工业价值。根据其产生的产物，黑曲霉菌株主要可分为产有机酸菌株和产蛋白菌株。然而，最佳菌丝体表型的开发以及足够胞内代谢前体（如乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A）的可获得性，是代谢物大规模生产的必要前提。
细胞壁缺陷突变体（黑曲霉SH-2和HL-1）与野生型菌株相比，在工业发酵方面具有明显优势。这些突变体表现出较短的菌丝，在液体培养中形成均一的菌丝球，能够精确控制球体大小。值得注意的是，SH-2和HL-1积累了较高的胞内乙酰辅酶A池，表明前体合成的代谢通量增强。这一生化特征使其成为高产代谢物生产的优良底盘。此外，这些菌株的高密度发酵兼容性支持可扩展的工业应用。形态均一性与代谢能力之间的协同作用，为聚酮类化合物的高效生产提供了理想平台。
编译者解读
本研究从工业菌株筛选入手，系统比较了六株黑曲霉的表型、前体水平和生长特性，将菌株筛选与代谢网络特征直接挂钩，避免了盲目选择底盘。细胞质与过氧化物酶体的区室化比较实验设计巧妙——利用PTS信号实现蛋白定向定位，用生物传感器直观反映丙二酰辅酶A水平差异，为亚细胞代谢工程提供了可借鉴的方法框架。多策略叠加（前体强化、拷贝数优化、竞争途径阻断）层层递进，体现了系统性的工程思维。从数据看，TAL在1.5-L反应器中达25.08 g/L，柚皮素摇瓶产量384.91 mg/L，在丝状真菌中属较高水平。值得注意的是，katA基因敲除策略巧妙地将前体竞争问题转化为生产优势。局限在于原文节选部分对部分实验细节未完整呈现，部分结果的统计检验信息未详述。
参考来源
Yao L. Engineering a versatile Aspergillus niger platform for efficient and scalable biosynthesis of polyketides. Metabolic Engineering, 2027.
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102528
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102528