来源：Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for de novo biosynthesis of isoorientin（aBIOTECH）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
黄酮碳苷类化合物异荭草苷具有抗肿瘤、心脏保护和肠道保护等多种生物活性，还可作为天然生物农药和抗菌剂。然而，其在植物中含量极低，限制了规模化生产。本研究以酿酒酵母为底盘细胞，通过代谢工程策略系统优化萘啶酚合成途径、筛选高效P450酶组合、强化辅因子供应和内质网微环境，最终实现了异荭草苷的从头合成。研究团队将整个途径划分为三个模块逐一攻克，为糖基化天然产物的微生物生产提供了可借鉴的技术框架。
研究背景
黄酮类化合物是植物生态适应所必需的特殊代谢物，具有抗氧化、抗炎等多种药理特性。异荭草苷作为一种独特的黄酮C-糖苷，展现出显著的心脏保护作用、对肝母细胞瘤细胞的DNA损伤活性以及缓解神经病理性疼痛的能力。此外，异荭草苷在代谢性疾病和感染性疾病治疗方面也显示出潜力——具有抗呼吸道合胞病毒活性，可用于治疗II型糖尿病和肥胖症，并对肠道屏障具有双重保护功能。在农业应用方面，异荭草苷对蚜虫和微生物具有抑制活性，有望开发为"绿色"农药。
异荭草苷的生物合成途径已在多种植物中阐明，包括水稻、玉米、毛竹和龙胆等。其生物合成始于糖代谢中的磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸缩合形成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸，随后进入莽草酸途径产生酪氨酸和苯丙氨酸，酪氨酸再经系列酶催化转化为黄酮核心中间体萘啶酚。然而，植物中异荭草苷含量极低，制约了其大规模生产和工业开发。利用合成生物学手段在微生物中重构该途径，成为可持续获取异荭草苷的重要替代方案。
研究方法
4.1 菌株、质粒与生化试剂
酿酒酵母菌株Zi-NAR由季加辰教授惠赠，作为异荭草苷生产的宿主菌株。基因克隆在大肠杆菌DH5α菌株中进行。EasyClone-MarkerFree CRISPR/Cas9试剂盒购自Addgene。pESC-URA和pRS423质粒保存于本实验室。寡核苷酸和基因由上海生工生物技术有限公司合成。所有引物、密码子优化基因、质粒和工程菌株的详细信息见表S4–S7。
本研究所用生化试剂均为分析纯或更高纯度。萘啶酚、对香豆酸、芹菜素、圣草酚、木犀草素、异荭草苷、抗生素及其他化学品购自上海源叶生物技术有限公司。KOD FX Neo DNA聚合酶购自上海东洋纺生物技术有限公司，Taq聚合酶购自北京康为世纪生物技术有限公司。DNA凝胶纯化试剂盒和质粒提取试剂盒购自北京天根生物技术有限公司。
【数据】菌株：Zi-NAR（酿酒酵母）、DH5α（大肠杆菌）；试剂级别：分析纯或更高
4.2 培养条件
酵母培养和感受态细胞制备使用YPD培养基（20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖）、YPD-30 g/L培养基（20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、30 g/L葡萄糖）或YPD-40 g/L培养基（20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、40 g/L葡萄糖）。合成缺陷型（SD）培养基成分为：6.7 g/L无氨基酸酵母氮源碱、20 g/L葡萄糖和50 mg/L相应的氨基酸缺陷混合物（按需补充）。大肠杆菌在LB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）中培养。
发酵过程中，工程酵母菌株首先在2 mL无菌管中加入0.3 mL缺乏尿嘧啶和亮氨酸的SD培养基，于30°C、220 rpm条件下培养12 h获得种子培养物。随后将种子培养物以初始OD600为0.1接种于50 mL锥形瓶中的10 mL YPD、YPD-30 g/L或YPD-40 g/L培养基中。发酵条件为30°C、220 rpm，持续96 h。质粒构建时，大肠杆菌在含100 μg/mL抗生素（必要时添加）的LB培养基中于37°C、200 rpm条件下培养。固体培养基添加10 g/L琼脂。
【数据】YPD培养基：20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖；YPD-30 g/L：30 g/L葡萄糖；YPD-40 g/L：40 g/L葡萄糖；SD培养基：6.7 g/L YNB、20 g/L葡萄糖、50 mg/L氨基酸缺陷混合物；LB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl；种子培养：0.3 mL SD培养基、30°C、220 rpm、12 h；发酵：10 mL培养基、初始OD600=0.1、30°C、220 rpm、96 h；大肠杆菌培养：37°C、200 rpm、100 μg/mL抗生素
4.3 遗传操作
酵母中所有基因过表达或敲除的染色体整合均使用CRISPR/Cas9系统完成。靶向各基因组位点的gRNA N20序列使用CHOPCHOP在线工具设计，列于表S4中，相应的供体DNA质粒也列于该表。各修饰的具体整合位点见表S4和S5。简要来说，ScARO1-EcAROL表达盒整合于XII-4位点；ScARO2-ScARO3整合于XII-5；BbXpfk整合于TRP2；Ckpta整合于PHA2；AtPAT-MtncADH整合于II-1；ALD6整合于XI-5；ACC1 S659A/S686A/S1157A整合于XI-5；SeACS L641P整合于XII-4；RtCIT1-slc25A1整合于X-4；MnACL整合于PAD位点；At4CL1整合于XI-2；SbFBH2-ATR2整合于X-3和int14；CYP93G1-ATR1整合于XII-2、int16和delt15；Tyr1-aro8整合于XII-1；GND1整合于VIII-1；IDP1整合于II-1；HEM1 I213K整合于XIII-1；INO2整合于IX-1；ICE2整合于VII-1；GyCGT1整合于II-1；YNK1整合于TRP2；URA6整合于PHA2。
启动子、终止子和靶位点片段从酿酒酵母BY4742中克隆。异源表达基因和引物由上海生工生物技术有限公司合成。供体DNA质粒通过infusion克隆组装，供体DNA片段使用KOD FX Neo DNA聚合酶从这些质粒中扩增并经凝胶提取纯化。阳性克隆通过Taq聚合酶进行菌液PCR鉴定后测序确认。
酵母细胞采用醋酸锂介导的转化方法，操作如下：细胞培养至OD600为1.0，离心收集（3214 rcf，5 min，4°C），依次用冰预冷无菌水洗涤（5 mL、2.5 mL、1 mL，最后100 μL）。洗涤后的细胞重悬于转化混合液中，含有276 μL PEG/LiAc（40% PEG 3350、100 mM醋酸锂、10 mM Tris-HCl pH 7.5、1 mM EDTA）、10 μL鲑鱼精DNA（10 mg/mL）、0.5 μg gRNA质粒、0.5 μg供体DNA片段，加水至终体积360 μL。混合物于42°C孵育40 min。随后离心收集细胞，重悬于1 mL YPD中，于30°C振荡培养2 h进行恢复。最后将细胞涂布于SD-URA-LEU+G418平板，于30°C培养2–3天。酵母转化子在含20 g/L琼脂的SD-URA-LEU+G418+NTC培养基上筛选，随后用Taq聚合酶进行PCR验证。验证后的菌落划线于含20 g/L琼脂的SD-URA-LEU+G418培养基上培养以去除gRNA质粒。
【数据】转化条件：OD600=1.0、离心3214 rcf/5 min/4°C；PEG/LiAc：40% PEG 3350、100 mM醋酸锂、10 mM Tris-HCl pH 7.5、1 mM EDTA；鲑鱼精DNA：10 mg/mL；gRNA质粒：0.5 μg；供体DNA：0.5 μg；热激：42°C、40 min；恢复：30°C、2 h；筛选培养：30°C、2–3天
4.4 内质网染色与分析
使用荧光染料DiOC6(3)对内质网进行可视化染色。具体操作：取1 mL对数中期酵母细胞，离心（3214 rcf，5 min，4°C），PBS洗涤后，用1 μM DiOC6(3)工作液染色，于37°C孵育30 min，PBS洗涤三次。样品在双光子激光扫描共聚焦显微镜（FV1000MPE，奥林巴斯公司，日本）下观察。使用483 nm激发激光和501 nm发射滤光片检测荧光强度。
【数据】染色浓度：1 μM DiOC6(3)；孵育：37°C、30 min；激发波长：483 nm；发射波长：501 nm
4.5 产物提取、分析与定量
发酵样品采用高效液相色谱（HPLC）或液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析。黄酮代谢物提取方法：取700 μL细胞培养液转移至2 mL离心管中，加入等体积甲醇（700 μL），于220 rpm振荡30 min，随后在超声波清洗器中超声提取30 min。提取液于118,514 rcf离心10 min。上清液经0.22 μm有机滤膜过滤去除不溶性杂质后进行HPLC分析。
HPLC使用Agilent 1260系统（Agilent，美国），配备Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）。柱温维持在30°C，流速0.8 mL/min，进样量50 μL。检测波长：353 nm（芹菜素、木犀草素和异荭草苷）或280 nm（对香豆酸、萘啶酚和圣草酚）。流动相为溶剂A（含0.1%甲酸的水）和溶剂B（甲醇）。线性梯度如下：0–5 min为5–20% B，5–20 min为20–40% B，20–30 min为40–70% B，30–42 min为70–100% B。
LC-MS使用Agilent 6540系统（Agilent，美国），配备Agilent SB-C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）。柱温维持在35°C，流速0.3 mL/min，进样量5 μL。流动相为溶剂A（含0.1%甲酸的水）和溶剂B（含0.1%甲酸的乙腈）。线性梯度如下：0–1 min为5–10% B，1–10 min为10–20% B，10–15 min为20–30% B，15–20 min为30–50% B，20–23 min为50–100% B，23–28 min为100% B，28–30 min返回5% B。质谱采用正离子模式，全扫描范围m/z 50–1000，参数设置：毛细管电压3.5 kV，喷嘴电压480 V，离子源温度325°C，脱溶剂气温度325°C，鞘气流量10 L/h，脱溶剂气流量11 L/h。
血红素提取按先前报道方法进行。取500 mL细胞培养液离心收集（112,857 rcf，10 min），用冰预冷蒸馏水洗涤两次。细胞沉淀重悬于100 mL 2%（v/v）酸性丙酮中，在超声波清洗器中超声处理30 min。裂解液与1 mL 1 M HCl混合（原文此处中断）。
【数据】提取：700 μL培养液+700 μL甲醇、220 rpm振荡30 min、超声30 min、离心118,514 rcf/10 min、0.22 μm滤膜过滤；HPLC：柱温30°C、流速0.8 mL/min、进样50 μL、检测波长353 nm/280 nm；LC-MS：柱温35°C、流速0.3 mL/min、进样5 μL、正离子模式、m/z 50–1000、毛细管电压3.5 kV、喷嘴电压480 V、离子源温度325°C；血红素提取：500 mL培养液、离心112,857 rcf/10 min、2%酸性丙酮、超声30 min
研究结果
2.1 增强萘啶酚生物合成
为建立异荭草苷生产的酵母平台，研究首先聚焦于增强萘啶酚——异荭草苷生物合成途径中的关键黄酮中间体——的供应。亲本菌株Zi-NAR通过敲除PDC5和ARO10（减少竞争性副产物形成）并异源表达HaTAL（来源于橙色滑柱菌）、At4CL1（来源于拟南芥）、PhCHS（来源于矮牵牛）和MsCHI（来源于紫花苜蓿）构建而成，可产生约20 mg/L萘啶酚，作为进一步工程改造的底盘菌株。
为缓解莽草酸途径关键酶供应不足的问题，研究在Zi-NAR菌株中过表达了来源于酿酒酵母的莽草酸途径基因ScARO1、ScARO2和ScARO3以及来源于大肠杆菌的EcAROL，构建了菌株STN2。STN2菌株产萘啶酚75.68 mg/L，较Zi-NAR提高了3倍（图2B）。
莽草酸途径始于磷酸烯醇式丙酮酸与赤藓糖-4-磷酸的缩合反应。然而，磷酸戊糖途径中E4P供应不足形成了代谢瓶颈，限制了酪氨酸——萘啶酚生产所必需的芳香族氨基酸前体——的生物合成。为进一步提高萘啶酚产量，研究在STN2菌株中采用了四种此前已验证的策略来增强E4P供应：引入由短双歧杆菌BbXpfk和克吕沃尔氏梭菌Ckpta组成的异源磷酸酮醇酶途径，以及分别过表达TAL1、TKL1和ENO2，由此构建了菌株STN4至STN7。这些修饰预期将碳通量导向E4P，增加莽草酸途径的前体供应，最终提高萘啶酚产量。
然而出乎意料的是，这些修饰均未提高萘啶酚滴度，所有工程菌株的萘啶酚产量均有所下降。其中STN6和STN7菌株表现出明显的生长抑制（图2B），尽管此前研究表明修饰这些基因可增加芳香族氨基酸或黄酮类化合物的产量。研究推测STN2菌株中PEP/E4P比例已接近平衡状态，通过过表达或异源途径人为扰动这一平衡会破坏细胞稳态。该假说与近期的一篇报道相符。
为进一步增强酪氨酸通量，超越内源优化途径的能力，研究向STN2菌株引入了来源于植物的arogenate途径，包括来源于拟南芥的预苯酸氨基转移酶基因和来源于蒺藜苜蓿的arogenate脱氢酶基因，此组合此前已被证明可提高酿酒酵母中酪氨酸及其衍生物的滴度。所得菌株STN8的萘啶酚产量较STN2提高了45.46%，达到110.17 mg/L（图2B）。
萘啶酚生物合成需要三分子丙二酰辅酶A和一分子香豆酰辅酶A。丙二酰辅酶A缺乏是微生物黄酮生产的關鍵瓶颈。在酿酒酵母中，胞质丙二酰辅酶A来源于丙酮酸，依次由丙酮酸脱羧酶、乙醛脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶和乙酰辅酶A羧化酶催化生成（图2C）。因此，为改善胞质丙二酰辅酶A的供应，研究从STN2出发共表达了来源于肠道沙门氏菌的SeACS L641P、ALD6和ACC1 S659A/S686A/S1157A，构建了菌株STN11。所得菌株STN11的萘啶酚滴度为116.75 mg/L（图2D），证实丙二酰辅酶A的可及性是限制因素，增加其供应可提高萘啶酚产量。
随后，研究将基于植物的酪氨酸途径引入STN11以提高酪氨酸滴度，构建了菌株STN12。然而，STN12的萘啶酚滴度未见显著提高（图2D）。因此，研究选择STN11作为进一步改造的底盘菌株。
接下来，研究旨在优化乙酰辅酶A——丙二酰辅酶A的前体——的供应，以进一步增强丙二酰辅酶A的可及性，从而提高萘啶酚产量。然而，乙酰辅酶A在酿酒酵母中分布于胞质、线粒体、过氧化物酶体和细胞核等多个区室。由于乙酰辅酶A的两亲性和较大分子尺寸，其难以穿越生物膜。这些特性限制了胞质中乙酰辅酶A的浓度，导致亚细胞区室间的碳通量损失，对需要大量前体（如丙二酰辅酶A）的胞质生物合成途径构成重大挑战。
为克服这一限制，研究尝试将线粒体碳通量导向胞质，以增强胞质乙酰辅酶A的可及性，进而提高丙二酰辅酶A的供应（图2C）。一种有前景的策略是引入非经典三羧酸循环，该策略此前已被证明可使乙酰辅酶A来源的化合物germacrene A的滴度提高1.4倍。非经典TCA循环途径依赖线粒体柠檬酸/异柠檬酸转运蛋白SLC25A1将线粒体内合成的柠檬酸输出至胞质。ATP柠檬酸裂解酶催化柠檬酸裂解生成乙酰辅酶A和草酰乙酸。草酰乙酸被还原为苹果酸，苹果酸通过SLC25A1穿梭回线粒体，完成柠檬酸-苹果酸穿梭循环（图2C）。
过表达来源于小鼠的MnACL并结合敲除苯丙烯酸脱羧酶基因PAD1，此前已可提高酿酒酵母中萘啶酚的产量。基于这些报道，研究将非经典TCA循环引入菌株STN11以增强胞质丙二酰辅酶A通量。在此工程策略中，过表达了SLC25A1、MnACL和来源于红冬孢酵母的RtCIT1，同时敲除PAD1。所得菌株STN14的萘啶酚滴度达到138.52 mg/L，较亲本菌株STN11提高了18.64%（图2D）。这一显著提升证明，通过线粒体乙酰辅酶A穿梭增强胞质丙二酰辅酶A可及性，是缓解乙酰辅酶A区室化导致的碳通量损失、大幅提高萘啶酚产量的有效策略。
然而，研究观察到STN14菌株中积累了大量的对香豆酸（图S1），提示4CL步骤可能存在限制。因此，研究将4CL拷贝数增加至两个，构建了菌株STN15。该菌株的萘啶酚产量提高至160.94 mg/L，对香豆酸积累较STN14降低了13.51%（图2F，图S1）。为进一步增强萘啶酚合成通量，研究还将CHS和CHI的拷贝数均加倍，构建了菌株STN16。然而，STN16的萘啶酚产量并未提高，表明CHS和CHI的活性在该途径中并非限制因素（图2F）。因此，研究选择前体增强菌株STN15进行后续改造。
【数据】Zi-NAR萘啶酚产量：约20 mg/L；STN2：75.68 mg/L（3倍提高）；STN8：110.17 mg/L（较STN2提高45.46%）；STN11：116.75 mg/L；STN14：138.52 mg/L（较STN11提高18.64%）；STN15：160.94 mg/L（对香豆酸降低13.51%）
2.2 筛选F3′H和FNS用于木犀草素合成
萘啶酚转化为木犀草素通过两条途径介导：（1）F3′H和FNS的依次作用，生成圣草酚和木犀草素；或（2）FNS先作用再由F3′H作用，以芹菜素为中间体（图1）。微生物系统中化合物生物合成的效率通常因基因的植物来源不同而有所差异，凸显了选择最优基因组合的重要性。因此，筛选具有更高活性的酶对于木犀草素生产至关重要。研究首先使用质粒在第一途径中筛选酶，并将其转化至酿酒酵母中。
【数据】原文未详述该部分具体筛选数值
（注：原文结果部分在该处截断，后续筛选详细数据及异荭草苷合成结果未包含在提供节选范围内。）
讨论与解读
本研究将异荭草苷的从头生物合成途径划分为三个模块逐步推进。首先通过增加胞质乙酰辅酶A供应、阻断竞争途径和过表达限速酶编码基因，构建了高效的萘啶酚合成平台。随后通过一系列优化的P450依赖性反应将萘啶酚转化为木犀草素，最后引入黄酮6-C-糖基转移酶完成一步糖基化生成异荭草苷。研究先采用质粒筛选策略评估两条木犀草素生物合成途径，确认均可行后，考虑到质粒表达系统固有的遗传不稳定性和传代丢失问题，将最优酶组合的编码基因整合至酵母基因组，实现了异荭草苷的稳定从头合成。P450酶的微生物功能表达是植物天然产物生物合成的核心挑战之一，其往往因辅因子供应不足和电子传递效率低下而成为瓶颈。
编译者解读： 本研究最值得借鉴之处在于将复杂的植物天然产物途径"模块化"拆解，逐层攻克前体供应、P450催化效率和糖基化三个关键节点。特别是针对P450这一"老大难"问题，从辅因子（NADPH、血红素）和内质网形态两个维度协同优化，体现了对酶催化微环境的系统性思考。从合成生物学应用角度看，该策略为其他依赖P450的植物次生代谢产物的微生物异源生产提供了可迁移的工程范式。局限在于过程较为繁琐，部分步骤的代谢通量分配机制尚未完全阐明，产业化放大仍需进一步优化。
参考来源
Song Z. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for de novo biosynthesis of isoorientin. aBIOTECH, 2026. DOI: 10.1016/j.abiote.2026.100085
DOI: 10.1016/j.abiote.2026.100085