13C通量分析揭示蛋氨酸限制下大肠杆菌代谢重排与氨基酸分泌

来源：13C-metabolic flux analysis uncovers rewiring in Escherichia coli ΔmetA metabolism and secretion of amino acids in response to methionine limitation（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：代谢通路设计

导读

营养缺陷型微生物在必需代谢物受限环境中的代谢适应机制尚不完全清楚。本研究以蛋氨酸营养缺陷型大肠杆菌ΔmetA菌株为模型，结合[1,2-13C]葡萄糖与[1,6-13C]葡萄糖双示踪剂平行标记实验和13C代谢通量分析（13C-MFA），系统比较了蛋氨酸过量与限制两种培养条件下的代谢表型差异。研究发现蛋氨酸限制条件下菌株呈现近线性生长，TCA循环通量显著上调，氧化磷酸戊糖途径通量降低，并分泌谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸和甘氨酸。关键发现是13C-MFA模型必须引入此前被忽视的蛋氨酸甲基化循环，才能获得统计学上可接受的拟合结果。

研究背景

营养缺陷型微生物在自然环境中常面临必需氨基酸和维生素等营养物受限的局面，需通过微生物间的交叉喂养获取必需营养物。在必需营养物饥饿条件下，细菌可激活多种调控途径以重排代谢、提升存活几率。氨基酸作为蛋白质合成的原料，其匮乏会直接阻断蛋白质合成并诱发广泛的代谢变化。蛋氨酸具有双重特殊地位：它既是蛋白质翻译的起始氨基酸，又通过S-腺苷甲硫氨酸参与甲基化反应。然而，关于蛋氨酸可用性如何影响营养缺陷型菌株整体代谢网络的研究仍不充分。本研究利用蛋氨酸营养缺陷型大肠杆菌ΔmetA菌株，考察蛋氨酸供应水平对该菌株生理表型和代谢通量的影响。

研究方法

4.1 菌株与材料

所有营养缺陷型大肠杆菌菌株均购自Keio敲除文库（GE Healthcare Dharmacon），该文库通过一步基因失活法在E. coli K-12 BW25113背景中构建。化学品与M9基础培养基购自Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）。所有培养基和储备液均经过滤除菌。13C示踪剂购自Cambridge Isotope Laboratories（Tewksbury, MA）：[1,2-13C]葡萄糖（99%）、[1,6-13C]葡萄糖（99%）、[U-13C]葡萄糖（99%）、[U-13C]蛋氨酸（99%）和[U-13C]藻类氨基酸（99%）。所有示踪剂的标记丰度均通过GC-MS验证。

【数据】菌株：E. coli K-12 BW25113 ΔmetA（Keio文库）；示踪剂丰度：99%；培养基：M9基础培养基

4.2 培养条件

13C示踪实验中，预培养在含1 mM未标记葡萄糖、3%（v/v）LB培养基和50 μg/mL卡那霉素的M9培养基中进行，于37°C摇床过夜培养。随后，取100 μL预培养液接种至10 mL含10 mM葡萄糖示踪剂和50 μg/mL卡那霉素的M9基础培养基中，置于150 mL带挡板锥形瓶中培养。蛋氨酸限制条件：每小时补加100 μL浓度为100 μM的蛋氨酸溶液，对应蛋氨酸补加速率为1 μM/h。蛋氨酸过量对照：实验开始时一次性加入1 mM蛋氨酸。

【数据】接种量：100 μL/10 mL；葡萄糖浓度：10 mM；卡那霉素：50 μg/mL；培养容器：150 mL带挡板锥形瓶；蛋氨酸补加速率：1 μM/h；蛋氨酸过量浓度：1 mM；温度：37°C

4.3 分析方法

通过分光光度计（Eppendorf BioPhotometer）测定600 nm处光密度（OD600）监测生长。生长速率由ln(OD600)对时间的斜率计算。OD600值使用先前确定的大肠杆菌OD600-细胞干重换算系数1.0 OD600 = 0.3 gDW/L转换为细胞干重浓度，假设干生物量分子量为24.6 gDW/C-mol。每个时间点收集上清液样品用于GC-MS分析葡萄糖、乙酸盐和氨基酸。细胞沉淀在指数中期收获，用无葡萄糖M9培养基洗涤，于−20°C保存以备后续GC-MS分析。

【数据】OD600-干重换算系数：1.0 OD600 = 0.3 gDW/L；生物量分子量：24.6 gDW/C-mol；保存温度：−20°C

4.4 气相色谱-质谱联用

GC-MS分析在Agilent 7890B GC系统上进行，配备DB-5MS毛细管柱（30 m，0.25 mm内径，0.25 μm膜厚；Agilent J & W Scientific），连接Agilent 5977B质谱仪，电子轰击（EI）电离能量为70 eV。氦气流速维持在1 mL/min。离子源温度230°C，MS四极杆温度150°C，接口温度280°C，进样口温度250°C。TBDMS衍生的蛋白源氨基酸GC-MS分析按Long和Antoniewicz（2019a）所述方法进行。TBDMS衍生的胞外氨基酸GC-MS分析按Naik等（2024）所述方法进行，以10 mg/mL [U-13C]藻类氨基酸溶液作为内标。胞外乙酸盐通过培养上清液与4 mM [4-2H]乙酸盐内标1:1混合后衍生化定量，方法如前所述。葡萄糖消耗采用盐酸羟胺和丙酸酐对培养上清液与[U-13C]葡萄糖1:1混合物进行衍生化后测定，遵循已建立方案。所有质谱数据以单离子监测（SIM）模式记录，每个离子驻留时间4 ms，积分确定总离子计数。质量同位素分布经自然同位素丰度校正。

【数据】GC-MS系统：Agilent 7890B + 5977B；色谱柱：DB-5MS（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；电离能：70 eV；氦气流速：1 mL/min；离子源温度：230°C；四极杆温度：150°C；接口温度：280°C；进样口温度：250°C；SIM驻留时间：4 ms；内标：[U-13C]藻类氨基酸（10 mg/mL）、[4-2H]乙酸盐（4 mM）

4.5 13C代谢通量分析

用于13C-MFA的基线代谢网络模型已在先前文献中描述。该模型包含大肠杆菌中心代谢的所有主要反应，以及氨基酸生物合成、一碳代谢、氧化还原代谢的合并途径和合并生物量形成反应。模型中添加了蛋氨酸摄取反应。对于蛋氨酸限制条件，额外修改包括添加甲基化循环以及谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸和甘氨酸的氨基酸分泌反应。基因缺失破坏的途径在模型中保留完整，以排除其他酶可能产生非零通量的混杂活性。模型还考虑了来自未标记（大气）CO2的胞内标记稀释。所有13C-MFA计算均使用Metran软件进行，该软件基于基本代谢物单元（EMU）框架。通量通过最小化实验测量值与模型预测的外部速率和生物量氨基酸质量同位素分布之间的方差加权残差平方和（SSR）来估计，采用非线性最小二乘回归。对于平行标记实验的综合分析，数据集同时拟合至单一通量模型。通量估计至少重复20次，每次以随机初始值开始，以寻找全局解。收敛后，通过评估最小化SSR对通量变化的敏感性，计算所有估计通量的精确95%置信区间。为描述代谢物的分数标记，13C-MFA中包含G值参数——G值代表标记实验期间产生的代谢物池的分数，而1−G代表自然标记（即来自接种物）的分数。默认情况下，每个数据集中每个测量代谢物包含一个G值参数。可逆反应建模为独立的正向和反向通量。净通量和交换通量确定如下：vnet = vf − vb；vexch = min(vf, vb)。

【数据】通量估计重复次数：≥20；置信区间：95%；软件：Metran；模型框架：EMU

4.6 拟合优度分析

为确定拟合优度，13C-MFA拟合结果接受χ2统计检验。简言之，假设模型正确且数据无重大测量误差，最小化SSR是服从χ2分布的随机变量。自由度等于拟合测量数n减去估计独立参数数p。SSR值的可接受范围介于χ2α/2(n−p)和χ21−α/2(n−p)之间，其中α为选定的阈值，例如0.05对应95%置信区间。

【数据】统计检验：χ2检验；置信区间：95%（α = 0.05）

研究结果

2.1 ΔmetA菌株在蛋氨酸过量与限制条件下的生理特征

为研究ΔmetA菌株的生理与代谢，使用[1,2-13C]葡萄糖和[1,6-13C]葡萄糖作为同位素示踪剂进行平行标记实验。这两种示踪剂先前已被鉴定为大肠杆菌胞内代谢通量高分辨率定量的最优选择。由于大肠杆菌ΔmetA为蛋氨酸营养缺陷型，细胞生长需要补充蛋氨酸。本研究旨在考察蛋氨酸的可用性是否影响生长生理和胞内代谢。因此，细胞在两种不同条件下培养：1）蛋氨酸过量条件——实验开始时一次性添加1 mM蛋氨酸至培养基；2）蛋氨酸限制条件——培养基不含蛋氨酸，而是以每小时添加1 μM蛋氨酸的速率缓慢补加。图1显示了两种实验条件下的生长曲线以及葡萄糖和乙酸盐浓度随时间的变化。

在蛋氨酸过量条件下，E. coli ΔmetA以0.81 ± 0.02 h−1的生长速率指数生长，与野生型大肠杆菌相似。在蛋氨酸限制条件下，观察到随时间近线性生长曲线，平均生长速率约为0.10 ± 0.01 h−1。该生长速率与E. coli ΔmetA与其他营养缺陷型菌株共培养时常观察到的生长速率一致。两种条件下菌株均在生长过程中分泌乙酸盐。蛋氨酸过量条件下，葡萄糖产乙酸盐的产量显著更高（每摩尔葡萄糖消耗产生0.72 ± 0.06摩尔乙酸盐），而蛋氨酸限制条件下为0.49 ± 0.04摩尔/摩尔。

为定量代谢通量，在OD600约0.5时收集平行标记实验的细胞，使用GC-MS测量水解蛋白质中氨基酸的同位素标记。将测得的质量同位素分布拟合至包含胞外蛋氨酸摄取反应的大肠杆菌代谢模型。蛋氨酸过量条件下获得了统计学上可接受的拟合，13C-MFA最佳拟合的方差加权残差平方和（SSR）为62，在假设所有质量同位素数据测量误差为0.4 mol%时的可接受范围内。然而，缓慢蛋氨酸补加条件下的平行标记实验未能获得可接受拟合，最佳拟合的SSR值为605，显著高于最大可接受SSR值209。这表明标记数据存在重大测量误差，或用于通量分析的代谢模型缺少重要反应。将样品在GC-MS上重新运行后，排除了重大测量误差的存在。因此，必须重新评估并调整代谢模型直至获得可接受拟合。

【数据】蛋氨酸过量生长速率：0.81 ± 0.02 h−1；蛋氨酸限制生长速率：0.10 ± 0.01 h−1；乙酸盐产率（过量）：0.72 ± 0.06 mol/mol葡萄糖；乙酸盐产率（限制）：0.49 ± 0.04 mol/mol葡萄糖；SSR（过量）：62；SSR（限制）：605；最大可接受SSR：209；测量误差假设：0.4 mol%

2.2 ΔmetA菌株在蛋氨酸限制条件下蛋氨酸循环的证据

导致拟合不佳的最大贡献者是蛋氨酸的质量同位素分布，提示用于13C-MFA的代谢模型未正确捕获一碳代谢的所有重要方面。图2A显示了大肠杆菌一碳代谢相关反应的示意图。在有氧生长条件下，细胞生长所需的大部分一碳单位来源于丝氨酸转化为甘氨酸和5,10-亚甲基-THF，额外的一碳单位来源于甘氨酸转化为二氧化碳和5,10-亚甲基-THF。在前一反应中，葡萄糖的第1和第6位碳原子成为一碳单位；而在后一反应中，葡萄糖的第2和第5位碳原子成为一碳单位。

在本示踪实验中使用了未标记蛋氨酸，因此预期在细胞蛋白质中仅观察到未标记蛋氨酸。确实，在一次性添加过量蛋氨酸的示踪实验中，仅检测到未标记蛋氨酸（图2B）。然而，在缓慢补加蛋氨酸的示踪实验中，观察到显著的M+1标记蛋氨酸丰度——[1,2-13C]葡萄糖示踪实验中约4% M+1，[1,6-13C]葡萄糖示踪实验中约8% M+1。这表明来源于标记葡萄糖碳的一碳单位被掺入蛋氨酸。

为进一步验证，在相同生长条件下重复实验，但改为：1）使用[U-13C]葡萄糖并缓慢补加未标记蛋氨酸；2）使用未标记葡萄糖并缓慢补加[U-13C]蛋氨酸。与假设预期一致，[U-13C]葡萄糖示踪实验中观察到约11% M+1标记蛋氨酸；[U-13C]蛋氨酸示踪实验中同时观察到完全13C标记的M+5蛋氨酸（79%）和M+4标记蛋氨酸（16%）。M+4蛋氨酸的丰度显著高于[U-13C]蛋氨酸示踪剂本身的5% M+4丰度（所用[U-13C]蛋氨酸示踪剂的同位素纯度约为99%）。综合来看，这些数据为E. coli ΔmetA菌株中活性蛋氨酸循环的存在提供了证据（图2A），特别是在缓慢补加蛋氨酸的条件下。

用于13C-MFA的代谢网络模型通常包含一个合并反应来描述蛋氨酸的生物合成，蛋氨酸循环未明确包含在这些模型中。蛋氨酸循环的缺失解释了为何初始代谢模型无法产生统计学上可接受的拟合。为解决此问题，在代谢模型中添加了一个额外反应，以明确捕获通过蛋氨酸循环从葡萄糖到蛋氨酸的标记掺入。

【数据】M+1丰度（[1,2-13C]葡萄糖）：约4%；M+1丰度（[1,6-13C]葡萄糖）：约8%；M+1丰度（[U-13C]葡萄糖）：约11%；M+5丰度（[U-13C]蛋氨酸）：79%；M+4丰度（[U-13C]蛋氨酸）：16%；示踪剂M+4本底：5%；示踪剂同位素纯度：99%

2.3 ΔmetA菌株响应蛋氨酸限制分泌特定氨基酸

为进一步识别两种蛋氨酸可用性条件（蛋氨酸过量与蛋氨酸限制生长）之间的额外差异，对示踪实验的耗竭培养基进行了综合分析。同时分析了野生型大肠杆菌培养物的耗竭培养基作为对照。图3A显示了这些实验测得的氨基酸浓度。野生型大肠杆菌中，在上清液中检测到两种显著水平的氨基酸：谷氨酸（5 μM）和天冬氨酸（6 μM）。蛋氨酸过量培养物中，仅检测到显著水平的天冬氨酸（5 μM）。缓慢蛋氨酸补加培养物中，检测到高水平的谷氨酸（274 μM）、赖氨酸（52 μM）、苏氨酸（25 μM）和甘氨酸（11 μM）（图3A）。这些数据表明ΔmetA菌株分泌特定氨基酸，尤其是当胞外蛋氨酸浓度较低时。

为进一步验证这一假设，首先将ΔmetA菌株在蛋氨酸过量条件下培养至指数生长期结束，然后用M9培养基洗涤细胞三次，将细胞在含10 mM葡萄糖作为唯一碳源（即不添加蛋氨酸）的M9培养基中孵育长达12小时。在孵育2、5和12小时后测量胞外氨基酸浓度，结果如图3B所示。确实观察到多种氨基酸的持续且显著积累，最显著的是谷氨酸（5小时时高达1219 μM）、赖氨酸（12小时时高达286 μM）、甘氨酸（12小时时高达341 μM）和苏氨酸（5小时时高达78 μM）。这些数据证实ΔmetA菌株在无蛋氨酸条件下分泌氨基酸，且这种分泌并不仅仅与生长相关。

【数据】野生型胞外氨基酸：谷氨酸5 μM、天冬氨酸6 μM；蛋氨酸过量胞外氨基酸：天冬氨酸5 μM；蛋氨酸限制胞外氨基酸：谷氨酸274 μM、赖氨酸52 μM、苏氨酸25 μM、甘氨酸11 μM；无蛋氨酸孵育分泌峰值：谷氨酸1219 μM（5h）、赖氨酸286 μM（12h）、甘氨酸341 μM（12h）、苏氨酸78 μM（5h）

2.4 ΔmetA菌株在蛋氨酸过量与限制条件下的代谢通量图

图4显示了通过13C-MFA获得的代谢通量图。在中心碳代谢中，蛋氨酸限制条件下观察到的显著变化包括：TCA循环通量显著增加，丙酮酸羧化酶催化的回补通量显著增加，以及氧化磷酸戊糖途径（PPP）通量降低。在一碳代谢中，蛋氨酸限制条件下丝氨酸羟甲基转移酶（glyA）通量降低，而蛋氨酸循环通量增加。

【数据】原文未详述具体通量数值

2.5 归一化与绝对代谢通量的比较

图5比较了野生型大肠杆菌和ΔmetA菌株在蛋氨酸过量与限制条件下的归一化和绝对代谢通量。在中心碳代谢的代表性通量中——糖酵解（G6P→F6P）、氧化磷酸戊糖途径（6PG→Ru5P）、TCA循环（ICit→αKG）和回补途径（PEP→OAA）——蛋氨酸限制条件下氧化PPP通量降低，而TCA循环和回补通量显著增加。在一碳代谢中，蛋氨酸限制条件下观察到从苏氨酸到甘氨酸途径的激活，该途径在正常生长条件下通常处于休眠状态。

【数据】原文未详述具体通量数值

2.6 ΔmetA菌株的碳、电子和能量平衡

图6显示了蛋氨酸过量与限制条件下ΔmetA菌株的碳、电子和能量平衡。根据13C-MFA结果计算了不同代谢途径对辅因子产生和消耗的贡献。在NADPH面板中，“其他”代表由膜结合转氢酶（PntAB）和可溶性转氢酶（UdhA）催化的转氢反应贡献。

【数据】原文未详述具体数值

讨论与解读

本研究系统考察了蛋氨酸可用性对大肠杆菌ΔmetA菌株表型和代谢的影响。在蛋氨酸过量条件下，ΔmetA菌株以与野生型相似的速率指数生长。蛋氨酸限制条件下则观察到依赖于蛋氨酸补加速率的线性生长。预实验中测试了1、5和10 μM/h的蛋氨酸补加速率——5和10 μM/h时生长速率与野生型相似，表明这些条件下未实现蛋氨酸限制；仅1 μM/h时观察到生长减缓。这与大肠杆菌中存在高亲和力蛋氨酸转运蛋白MetNIQ一致，其Km约为0.1 μM。

蛋氨酸限制条件下，13C-MFA揭示多重代谢重排：氧化PPP通量降低、TCA循环通量与回补通量显著增加、从苏氨酸到甘氨酸的通常休眠途径被激活。模型拟合失败促使研究者发现13C-MFA模型中一个长期被忽视的关键环节——蛋氨酸甲基化循环。该循环的纳入对于获得统计学上可接受的拟合至关重要。此外，蛋氨酸限制条件下菌株分泌谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸和甘氨酸，且该分泌在非生长条件下依然持续，提示这可能是一种代谢调节策略而非简单的生长偶联副产物。

编译者解读：本研究的方法学价值突出——通过模型拟合失败反向驱动代谢网络模型的修正与完善，展示了13C-MFA在非标准生长条件下的迭代优化路径。将蛋氨酸甲基化循环纳入通量模型为后续营养缺陷型菌株的代谢分析提供了重要参考。从合成生物学应用角度，ΔmetA菌株在蛋氨酸限制下分泌多种氨基酸的现象，提示营养缺陷型菌株互养共培养体系中氨基酸交叉喂养的复杂性——代谢通量分析揭示的分泌行为可能影响共培养体系的稳定性和产量。该工作为理解微生物群落的代谢互作以及优化氨基酸生产菌株提供了新的代谢层面视角。

参考来源

Cai Y. 13C-metabolic flux analysis uncovers rewiring in Escherichia coli ΔmetA metabolism and secretion of amino acids in response to methionine limitation. Metabolic Engineering, 2027. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102544

DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102544