来源：Molecular mechanisms through which carbon metabolism regulates amino acid biosynthesis during the growth and development of Agaricus bisporus（Scientia Horticulturae）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
双孢蘑菇是全球栽培最广的食用菌之一，其风味品质与栽培基质中木质纤维素的降解效率密切相关。本研究以双孢蘑菇品种‘申K6’为对象，整合转录组学与生理生化分析，系统解析了从菌丝营养生长到生殖生长六个阶段中碳代谢与氨基酸合成的偶联调控网络。研究发现半纤维素降解效率高达51%，并锁定AK、AS、KGDH等关键基因通过驱动天冬氨酸和谷氨酸积累来提升风味品质。该研究为食用菌品质改良提供了明确的分子靶点。
研究背景
双孢蘑菇是全球消费量最大的食用菌之一，过去十年全球年产量从380万吨增至500万吨，人均消费量同步上升。其子实体富含蛋白质和八种人体必需氨基酸，尤以天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）等呈味氨基酸含量突出。然而，基质降解后的营养代谢如何调控双孢蘑菇氨基酸合成，其机制尚不清楚。双孢蘑菇是典型的草腐菌，生长发育依赖对栽培基质中木质纤维素的高效降解，该过程涉及由木质素降解酶、纤维素酶和半纤维素酶组成的复杂碳水化合物活性酶（CAZyme）系统。阐明基质降解效率与关键风味化合物形成之间的关系，是提升双孢蘑菇产量与品质的有效策略。
研究方法
2.1 蘑菇栽培与取样
蘑菇栽培在上海联中食用菌专业合作社进行。Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期堆肥过程均按照国际标准的小麦秸秆堆肥方法执行。堆肥接种双孢蘑菇菌株‘申K6’（山东瑞泽生物），接种量为每千克湿堆肥7克定殖谷粒。堆肥以每平方米100千克的密度转移至栽培床，并覆盖5厘米厚的泥炭与石灰混合物。在菌丝营养生长阶段，气温逐渐升至21°C，CO₂浓度维持在5000 ppm。在菌丝生殖生长阶段，气温逐渐降至17.5°C，并通过调节新风供应将CO₂浓度降至1500 ppm。蘑菇分三潮采收。
堆肥样品在6个不同生长发育阶段采集：Ⅲ期堆肥（PC）、降温前（BC）、现蕾期（PS）、第一潮期（FF）、第二潮期（SF）和第三潮期（TF）。每个生长阶段的堆肥充分混匀后取样。样品采用两种不同方法处理以用于不同分析目的：一部分样品在−80°C冷冻用于RNA测序分析；第二部分在−20°C保存用于酶活及生理生化测定。‘申K6’第一潮的子实体样品在−20°C保存用于氨基酸含量测定。每个样品设三个生物学重复。
【数据】接种量：7 g/kg湿堆肥；栽培密度：100 kg/m²；覆土层厚度：5 cm；营养生长温度：21°C；营养生长CO₂：5000 ppm；生殖生长温度：17.5°C；生殖生长CO₂：1500 ppm；取样阶段：6个；生物学重复：3个
2.2 酶活测定与生理生化分析
堆肥木质纤维素酶活测定方法：将25 g堆肥样品与50 mL蒸馏水混合匀浆，在25°C、200 rpm振荡30 min。所得悬液经无纺布过滤，滤液在4°C、6000 × g离心20 min，收集上清液用于酶活测定。蛋白含量及内切-β−1,4-葡聚糖酶、外切-β−1,4-葡聚糖酶、木聚糖酶、漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的活性均使用商业试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）进行定量。堆肥中中性碳水化合物含量（包括纤维素、半纤维素和木质素含量）依据总水解法按前述方法测定。
子实体氨基酸含量测定：称取约0.2 g双孢蘑菇子实体样品，在1 mL含0.1%苯酚的6 mol/L盐酸水溶液中匀浆。匀浆液转移至1.5 mL微量离心管中，在烘箱中100°C酸水解20 h。冷却至室温后，水解液在氮气流下蒸发至近干。残渣用1 mL 0.1 mol/L盐酸复溶，经0.22 μm滤膜过滤后进行衍生化。氨基酸组成采用Rigol L3000高效液相色谱系统分析，配备Sepax C18反相色谱柱（250 mm × 4.6 mm，粒径5 μm），在优化条件下分离以确保各氨基酸准确定量。
【数据】样品量：25 g堆肥；提取液：50 mL蒸馏水；振荡：200 rpm，25°C，30 min；离心：6000 × g，4°C，20 min；子实体样品量：0.2 g；水解液：1 mL 6 mol/L HCl含0.1%苯酚；水解条件：100°C，20 h；复溶液：1 mL 0.1 mol/L HCl；滤膜：0.22 μm；色谱柱：Sepax C18，250 mm × 4.6 mm，5 μm
2.3 RNA提取、文库构建与Illumina测序
使用Spin Column真菌总RNA纯化试剂盒（上海生工）从堆肥中提取总RNA。RNA浓度和质量分别采用Qubit 2.0荧光计（Thermo Scientific，美国）和Agilent 2100生物分析仪（Agilent，Palo Alto，CA，美国）测定，质量标准为：OD260/280 = 1.8–2.2，OD260/230 ≥ 2.0，RIN ≥ 6.5，28S:18S ≥ 1.0。样品RNA质量达标后用于构建测序文库。测序文库使用Illumina TruSeq™ RNA样品制备试剂盒（Illumina，San Diego，CA）按制造商方案构建。约200 bp的cDNA片段经AMPure XP磁珠进行大小筛选，随后通过PCR扩增富集文库。文库在NovaSeq 6000测序平台（Illumina，San Diego，CA，美国）上测序。本研究数据集已提交至CNSA，登录号为CNP0008865。
【数据】RNA质量标准：OD260/280 = 1.8–2.2；OD260/230 ≥ 2.0；RIN ≥ 6.5；28S:18S ≥ 1.0；cDNA片段：约200 bp；测序平台：NovaSeq 6000；数据登录号：CNP0008865
2.4 原始数据处理与生物信息学分析
使用Trimmomatic对原始测序数据进行过滤获得高质量clean reads。高质量clean reads使用HISAT2以默认参数比对至双孢蘑菇参考基因组。RNA-seq数据质量评估使用Qualimap进行，以评价整体测序比对指标。基因表达水平以每千碱基外显子每百万映射读段的片段数（FPKM）进行定量。跨样品基因表达谱的比较分析中，使用EdgeR鉴定差异表达基因（DEG）。DEG筛选的显著性阈值为|log2倍数变化| ≥ 1且错误发现率（FDR）≤ 0.05。DEG通过GOATOOLS和KOBAS进行基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路注释。
【数据】DEG筛选阈值：|log2FC| ≥ 1；FDR ≤ 0.05；比对软件：HISAT2默认参数；定量指标：FPKM
2.5 通过qRT-PCR验证基因表达水平
使用Spin Column真菌总RNA纯化试剂盒（上海生工）按制造商说明从样品中提取总RNA。从18个双孢蘑菇样品（PC、BC、PS、FF、SF和TF）中各取约2 μg总RNA，随后使用All-in-One Ultra RT SuperMix（南京诺唯赞）以oligo(dT)为引物进行反转录。定量实时PCR使用SYBR（南京诺唯赞）按Zhang等（2017）的方法进行。目标基因和内参基因（actin）的引物列于补充表S1。相对基因表达水平采用2−ΔΔCt法分析，每个实验设三次重复。
【数据】总RNA用量：约2 μg/样品；样品数：18个；反转录试剂：All-in-One Ultra RT SuperMix；qPCR试剂：SYBR；内参基因：actin；分析方法：2−ΔΔCt法；重复：3次
2.6 统计分析
统计分析使用SPSS 2.0进行。组间差异采用Duncan多重极差检验评估，统计显著性设为P < 0.05。
【数据】软件：SPSS 2.0；统计方法：Duncan多重极差检验；显著性水平：P < 0.05
研究结果
3.1 ‘申K6’的生理特征与基质利用
为阐明‘申K6’的代谢基础，首先监测了六个生长阶段的生理转变和基质降解效率（图1A）。随着菌丝从营养阶段（PC、BC和PS）向生殖阶段（FF、SF和TF）转变，堆肥颜色由红棕色变为白色，最终变为深棕色，表明菌丝生长和发育以及木质纤维素组分的降解。蛋白质含量先升高，在第一潮期（FF）达到峰值，随后下降。该趋势可能与发育中的子实体从基质中吸收利用氮素有关（图1B）。
木质纤维素降解酶的活性表现出明显的阶段特异性变化。在纤维素降解过程中，内切-β−1,4-葡聚糖酶活性先下降、后升高、再下降（图1C）。木质素降解酶漆酶和锰过氧化物酶呈现相似趋势（图1F–G）。纤维素降解酶外切-β−1,4-葡聚糖酶活性则逐步下降（图1D），而半纤维素降解酶木聚糖酶和木质素降解酶木质素过氧化物酶的活性均出现波动，在生长发育过程中呈现明显的次级峰值特征（图1E和H）。这种协同酶活导致木质纤维素含量显著降低。具体而言，纤维素浓度从PC期的264 mg/g降至TF期的222 mg/g，降幅为16%。半纤维素含量下降51%，木质素含量下降12%（图1I）。半纤维素的高降解率表明其可能作为主要碳源促进发育进程。
值得注意的是，‘申K6’子实体含有多种氨基酸，包括贡献鲜味的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）；亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）和赖氨酸（Lys）等必需氨基酸；以及丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）和半胱氨酸（Cys）等非必需氨基酸（图1J）。这些发现提示‘申K6’菌株的高效基质碳利用与氨基酸生物合成增强之间存在潜在的表型关联。
【数据】纤维素：264→222 mg/g（PC→TF），降幅16%；半纤维素降幅：51%；木质素降幅：12%；检测氨基酸：Asp、Glu、Leu、Phe、Lys、Ser、Gly、Ala、Cys
3.2 转录组测序与DEG鉴定
为研究‘申K6’生长、发育和代谢变化的分子机制，对六个阶段进行了RNA测序。共产生6.218亿条clean reads，质量指标优良（Q20 > 98%，Q30 > 94%，补充表S2），基因组比对率较高（57.84%–89.20%），确保了后续分析的可靠性。主成分分析（PCA）显示，同一阶段的样品聚集在一起，而不同阶段之间差异显著（图2A）。PC1和PC2的样品差异分别占40.21%和23.3%。
BC与PC样品之间鉴定到的DEG数量最多，下调DEG数（2066）大于上调DEG数（1893）（图2B）。FF与PS比较共鉴定到3249个DEG，其中1853个上调、1396个下调。PS与BC比较鉴定到1364个DEG，其中784个上调、580个下调。其余两组比较分别鉴定到1989个（941个上调、1048个下调）和1357个（538个上调、819个下调）DEG。DEG分析显示了不同的表达模式。在这些样品中，部分DEG显著下调，而更大比例的DEG上调（图2C）。与菌丝营养生长（PC、BC和PS）相关的基因表达模式与菌丝生殖生长（FF、SF和TF）相关的模式相似。这些结果表明，参与双孢蘑菇菌丝营养生长和生殖生长的DEG存在显著差异。
【数据】clean reads总数：6.218亿；Q20 > 98%；Q30 > 94%；比对率：57.84%–89.20%；PC1：40.21%；PC2：23.3%；BC vs PC：2066下调/1893上调；FF vs PS：1853上调/1396下调；PS vs BC：784上调/580下调
3.3 DEG聚类与功能富集——碳氮代谢协调性分析
为研究DEG的表达模式，将所有DEG聚类为六个不同的簇。如图3A所示，簇3和簇6中基因的表达水平趋于升高，表明这些簇中的基因在双孢蘑菇的不同生长阶段发挥重要作用。通过GO和KEGG富集分析对这些DEG进行进一步功能注释。各比较组的前20个类别列于补充表S3和补充表S4。
主要富集的GO条目包括氮化合物代谢过程、碳水化合物衍生物结合、水解酶活性、作用于酸酐的水解酶活性、氮化合物转运以及氮化合物代谢过程的调控（图3B），这与图1中观察到的基质降解和蛋白质变化一致。此外，KEGG通路富集显示，DEG主要参与碳代谢，包括淀粉和蔗糖代谢、果糖和甘露糖代谢、糖酵解/糖异生以及半乳糖代谢（图3B）。有趣的是，这些碳相关通路与氮相关通路相互关联，特别是氮代谢以及多种氨基酸代谢通路（如色氨酸代谢、赖氨酸降解、β-丙氨酸代谢、嘌呤代谢、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢以及酪氨酸代谢）。碳水化合物和氨基酸代谢通路同时富集，表明在双孢蘑菇生长发育过程中碳代谢和氮代谢紧密关联且协同调控。
【数据】DEG聚类数：6个；关键簇：簇3和簇6（表达趋于升高）；GO富集条目：氮化合物代谢过程、碳水化合物衍生物结合等；KEGG通路：淀粉/蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、氨基酸代谢等
3.4 不同生长阶段碳氮代谢基因分析
辅助活性酶（AAs）、碳水化合物结合模块（CBMs）、碳水化合物酯酶（CEs）、糖苷水解酶（GHs）、糖基转移酶（GTs）和多糖裂解酶（PLs）是参与碳代谢的重要酶类。本研究分析了不同生长阶段碳水化合物酶编码基因的表达水平。
在菌丝营养生长阶段（图4A），BC vs PC中100个基因显著上调、146个基因显著下调（P < 0.05）。PS vs BC中53个基因显著上调、51个基因显著下调（P < 0.05）。此外，173个基因在BC vs PC中特异性表达，38个基因在PS vs BC中特异性表达，51个基因在两个比较组中重叠。
对51个重叠基因（包括23个GH基因、14个AA基因、6个CBM基因、3个CE基因、4个GT基因和1个PL基因）的基因表达热图显示了阶段特异性表达峰值：17个基因在PC期上调，14个在BC期上调，20个在PS期上调。
在菌丝生殖生长阶段（图4B），SF vs FF中48个基因显著上调、122个基因显著下调（P < 0.05）。TF vs SF中118个基因显著上调、83个基因显著下调，2个基因无显著差异（P < 0.05）。此外，72个基因在SF vs FF中特异性表达，98个基因在TF vs SF中特异性表达，80个基因在两个比较组中重叠。对80个核心CAZymes（包括33个GH基因、18个AA基因、11个CBM基因、8个CE基因、5个GT基因和5个PL基因）进行了比较分析。3个基因在FF期显著上调，53个基因在SF期显著上调，24个基因在TF期显著上调。
【数据】营养生长阶段BC vs PC：100上调/146下调；PS vs BC：53上调/51下调；重叠基因：51个（23 GH + 14 AA + 6 CBM + 3 CE + 4 GT + 1 PL）；生殖生长阶段SF vs FF：48上调/122下调；TF vs SF：118上调/83下调/2无差异；重叠基因：80个（33 GH + 18 AA + 11 CBM + 8 CE + 5 GT + 5 PL）；FF期上调：3个；SF期上调：53个；TF期上调：24个
3.5 碳代谢通路与氨基酸生物合成的偶联分析
KEGG分析揭示了不同生长阶段碳代谢通路与氨基酸代谢通路的整合模式（图5）。糖酵解和三羧酸（TCA）循环中多个关键酶基因的表达变化与氨基酸合成前体的供应密切相关。
在糖酵解途径中，丙酮酸激酶（AK）和天冬酰胺合成酶（AS）等相关基因的上调表达促进了碳流转向氨基酸合成方向。TCA循环中α-酮戊二酸脱氢酶（KGDH）和α-酮戊二酸合成酶（KGsyn）的表达上调，推动了天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）的生物合成，驱动了这两种呈味氨基酸的显著积累。对碳氮代谢关键酶编码基因的分析显示，Exo2、Endo2、Endo10、Xylo3、AXE1、VP1、GDH2和ASNS1的表达水平显著上调。
【数据】上调关键基因：Exo2、Endo2、Endo10、Xylo3、AXE1、VP1、GDH2、ASNS1；上调通路酶：AK、AS、KGDH、KGsyn；产物氨基酸：Asp、Glu
3.6 相关酶基因表达水平的验证
为验证RNA-seq数据的可靠性，选取木质素降解酶和纤维素降解酶相关的差异表达基因进行qRT-PCR验证（图6）。图6A显示了不同生长阶段差异表达的木质素降解酶编码基因。图6B、6C和6D展示了三个差异表达的纤维素降解酶编码基因在不同生长阶段的表达情况。qRT-PCR结果与转录组数据的表达趋势一致，证实了RNA-seq结果的可靠性。
【数据】验证方法：qRT-PCR；验证基因类型：木质素降解酶编码基因、纤维素降解酶编码基因；内参基因：actin；分析方法：2−ΔΔCt法
3.7 碳代谢调控氨基酸生物合成的分子模型
基于上述结果，构建了双孢蘑菇中碳代谢影响氨基酸生物合成的分子模型（图7）。该模型阐明了从木质纤维素降解到氨基酸积累的完整调控路径：堆肥中的木质纤维素被CAZymes降解为可溶性糖，进入糖酵解和TCA循环；碳代谢中间产物通过AK、AS、KGDH和KGsyn等关键酶的作用，将碳流导向天冬氨酸和谷氨酸的合成；最终驱动这两种呈味氨基酸的积累，提升双孢蘑菇的品质。
【数据】模型内容：碳代谢→氨基酸生物合成调控网络；关键节点：糖酵解、TCA循环、Asp/Glu合成
讨论与解读
双孢蘑菇是全球栽培和消费量最大的食用菌之一，其子实体因富含优质蛋白和人体必需氨基酸而备受青睐。在工业化生产模式下，双孢蘑菇的生长发育根本上依赖于栽培基质（主要由木质纤维素复合物组成）的降解和营养生物转化。目前，A15、901和3X是适用于Ⅲ期堆肥工业化栽培的常用商业品种。国内自主选育的‘申K6’和‘福蘑78’等品种也为提升品种自主性和满足本土化生产需求提供了重要支撑。‘申K6’菌株对小麦秸秆堆肥栽培配方表现出优异的适应性，具有高产和子实体形态优良等显著优势。然而，在菌丝营养生长向生殖生长转变的关键发育阶段，基质中的代谢动态和营养分配机制仍了解不足。
本研究通过整合转录组与生理生化分析，揭示了‘申K6’在半纤维素降解（效率51%）、碳代谢基因表达与氨基酸生物合成之间的偶联关系。糖酵解和TCA循环中AK、AS、KGDH和KGsyn的上调表达驱动了Asp和Glu的积累，直接改善了风味品质。
编译者解读
该研究的价值在于将基质降解效率与风味品质形成直接挂钩，从CAZyme到氨基酸合成的完整通路中锁定了8个关键基因和4个节点酶，为双孢蘑菇品质定向改良提供了可操作的分子靶点。半纤维素51%的降解率提示其可能比纤维素更值得关注。局限在于qRT-PCR验证仅覆盖了木质素和纤维素降解酶基因，对氨基酸合成通路基因的验证尚不充分；此外，基因表达与酶活之间的定量关联仍需蛋白水平证据支撑。后续若能在蛋白组和代谢组层面加以验证，将更完整地支撑该调控模型。
参考来源
Xiao, T. (2026). Molecular mechanisms through which carbon metabolism regulates amino acid biosynthesis during the growth and development of Agaricus bisporus. Scientia Horticulturae. DOI: 10.1016/j.scienta.2026.114999
DOI: 10.1016/j.scienta.2026.114999