来源：Aspergillus-Enterobacteriaceae dynamics and branched-chain amino acid metabolism in fermented fish sauce（International Journal of Food Microbiology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
鱼露作为传统发酵水产调味品，其风味形成涉及复杂的微生物互作与代谢网络。本研究以36天发酵周期为窗口，整合理化分析、微生物多样性测序、非靶向代谢组学、挥发性风味物质检测及蛋白质组学技术，揭示了三阶段发酵特征。研究证实Aspergillus与Enterobacteriaceae的协同关系——前者主导大分子底物降解，后者通过Ehrlich途径代谢支链氨基酸生成关键风味前体。挥发性物质呈现"醛→醇酮→酯"的时序演替规律，3-甲基-1-丁醇与庚酸乙酯被锁定为核心风味标志物。该框架为传统鱼露品质优化提供了分子层面的调控靶点。
研究背景
鱼露是东南亚地区历史悠久的传统发酵水产调味品，凭借独特的鲜味强度和复杂风味轮廓获得全球认可。其生产依赖高盐条件（通常为20%–30% w/w盐）下的自发发酵，严苛环境筛选出耐盐微生物群落，这些微生物分泌的酶将蛋白质、脂质和碳水化合物等大分子营养素分解转化，为鱼露独特风味奠定基础。尽管已有研究量化了游离氨基酸、挥发性醛类等有限风味化合物，但未能将这些观察与潜在生物学过程关联。近年来，高通量测序与组学技术的进步深化了对发酵食品微生物群落结构和代谢动态的认识，然而鱼露风味的形成机制仍未完全阐明。
研究方法
2.1 材料与发酵流程
成熟米曲制备：大豆浸泡12小时，清洗后蒸煮2小时，冷却至室温。冷却大豆与10%（w/w）小麦粉和0.2%（w/w）米曲霉（Aspergillus oryzae）3.042混合，在30°C、80–90%相对湿度条件下培养3天，获得密集孢子。
小黄鱼（Larimichthys polyactis）购自中国辽宁省大连市前河市场。全鱼浸泡于20%（w/v）盐水中10分钟，沥干后机械粉碎。碎鱼肉与10%（w/w）食盐和8%（w/w）米曲混合形成均匀混合物。混合物转移至无菌发酵罐，覆盖四层无菌纱布，于45°C发酵6天（低温保温阶段）。随后将盐浓度调整至25%（w/w），启动为期30天的"日晒夜露"发酵。混合物每日搅拌两次以确保光照均匀。样品采集时间点为H36、D6、D11、D16、D21、D26、D31和D36，采集后立即储存于−80°C供后续分析。
用于理化分析的化学试剂均为分析纯或色谱纯，购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯），包括有机酸和氨基酸标准品。分子生物学试剂如DNA提取试剂盒（Omega Bio-tek，美国佐治亚州诺克罗斯）、PCR酶和蛋白质提取缓冲液均按制造商说明使用。C7–C30正构烷烃系列和环己酮（HS-SPME-GC–MS分析内标）亦购自Sigma-Aldrich。
【数据】大豆浸泡：12h；蒸煮：2h；米曲霉接种量：0.2%（w/w）；培养温度：30°C；相对湿度：80–90%；培养时间：3d；盐水浓度：20%（w/v）；浸泡时间：10min；食盐添加量：10%（w/w）；米曲添加量：8%（w/w）；低温保温发酵：45°C、6d；后期盐浓度：25%（w/w）；发酵总时长：36d；样品储存温度：−80°C
2.2 理化性质测定
鱼露pH值使用数字pH计（Mettler Toledo，瑞士苏黎世）测量，每次测量前用标准缓冲液重新校准。总糖含量使用商业检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国南京）测定。总糖在酸性条件下水解为还原糖，水解产物与DNS试剂在碱性加热条件下反应形成橙红色产物。使用微孔板读数仪（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）在500 nm处测量产物吸光度，总糖含量基于葡萄糖标准曲线计算。
【数据】pH计品牌：Mettler Toledo；总糖试剂盒来源：南京建成生物工程研究所；检测波长：500nm；检测仪器：微孔板读数仪（Thermo Fisher Scientific）
2.3 有机酸检测
鱼露样品用超纯水稀释10倍，经0.22 μm有机相滤膜过滤。有机酸分析采用配备Ultimate AQ-C18色谱柱（4.6 × 150 mm，5 μm）的HPLC系统（LC-16，Shimadzu，日本东京）。流动相由20 mM磷酸铵缓冲液（pH 2.5，A相）和甲醇（B相）组成，流速设定为0.7 mL/min。柱温维持在30°C，进样体积10 μL，采用UV检测器在210 nm处检测。使用纯标准品制备外标曲线，对八种有机酸（乙酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、甲酸和丙二酸）进行定性和定量。
【数据】稀释倍数：10倍；滤膜孔径：0.22μm；色谱柱：Ultimate AQ-C18（4.6×150mm，5μm）；流动相A：20mM磷酸铵缓冲液（pH 2.5）；流动相B：甲醇；流速：0.7mL/min；柱温：30°C；进样量：10μL；检测波长：210nm；有机酸种类：8种
2.4 游离氨基酸与总氨基酸分析
鱼露中游离氨基酸和总氨基酸的测定采用2,4-二硝基氯苯（CDNB）柱前衍生化结合反相高效液相色谱-紫外检测法。
游离氨基酸测定：1 mL鱼露与α-氨基丁酸内标溶液混合，用水超声提取30分钟。离心后取200 μL上清液，依次与pH 9.0碳酸盐缓冲液和3% CDNB衍生化试剂混合，于95°C避光反应150分钟。反应混合物冷却后，用10%乙酸中和，过滤后进样。
总氨基酸测定：3 mL鱼露与含0.2%苯酚的12 mol/L HCl混合，在氮气保护下于110°C水解24小时。水解产物转移后，取等分试样在真空下蒸发至干。残留物用0.1 mol/L HCl复溶，按游离氨基酸相同程序衍生化。
色谱分离在Waters symmetry C18柱（250 × 4.6 mm，4.6 μm）上进行，柱温40°C，流动相由乙腈（A）和乙酸钠-乙酸-三乙胺缓冲液（B）组成，流速1.5 mL/min。梯度程序为：0 min，18% A；6.5 min，18% A；10 min，20% A；20 min，34% A；23 min，45% A；25 min，55% A；27 min，18% A；30 min，18% A；总运行时间48分钟。检测波长360 nm，进样体积5 μL。采用单点内标法进行定量。
【数据】衍生化试剂：3% CDNB；游离氨基酸衍生化温度：95°C；衍生化时间：150min；总氨基酸水解酸：12mol/L HCl（含0.2%苯酚）；水解温度：110°C；水解时间：24h；色谱柱：Waters symmetry C18（250×4.6mm，4.6μm）；柱温：40°C；流速：1.5mL/min；梯度总时长：48min；检测波长：360nm；进样量：5μL
2.5 挥发性化合物HS-SPME-GC–MS分析
鱼露中挥发性化合物采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）分析，方法基于前期研究（Zhang et al., 2025）略作修改。4 mL鱼露样品置于20 mL顶空瓶中，加入10 μL环己酮内标。样品瓶用PTFE内衬硅胶隔垫密封，在50°C平衡10分钟。采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维在50°C萃取40分钟。热解吸在GC进样口250°C下进行5分钟，采用不分流模式。
GC-MS分析在Agilent 7890B GC系统耦合5977A MSD（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）上进行，配备HP-5MS毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）。柱温箱程序设定为：初始35°C保持3分钟，以5°C/min升温至250°C，最终250°C保持10分钟。进样口、检测器和离子源温度分别设定为250°C、250°C和230°C。高纯氦气为载气，流速维持在1.0 mL/min。电子轰击电离（70 eV），四极杆温度维持在150°C，质谱采集范围m/z 40–400。保留指数使用C7–C30正构烷烃系列校准。挥发性化合物通过与NIST 14质谱库比对并结合保留指数进行鉴定。
【数据】样品量：4mL；内标：10μL环己酮；平衡温度：50°C；平衡时间：10min；萃取纤维：50/30μm DVB/CAR/PDMS；萃取温度：50°C；萃取时间：40min；解吸温度：250°C；解吸时间：5min；色谱柱：HP-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；升温程序：35°C保持3min→5°C/min→250°C保持10min；离子源温度：230°C；电离电压：70eV；质谱范围：m/z 40–400
2.6 Illumina MiSeq测序微生物群落分析
微生物多样性分析按照优化方案（Wang et al., 2020）执行。使用DNA试剂盒（Omega Bio-tek，美国佐治亚州诺克罗斯）按制造商方案从鱼露样品中提取基因组DNA。DNA质量和浓度使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）评估，并通过1%琼脂糖凝胶电泳验证。
细菌16S rRNA基因V3–V4高变区用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）扩增。真菌ITS区域用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）扩增。每个20 μL PCR反应包含4 μL 5×FastPfu Buffer、各0.8 μL引物（10 μM）、2 μL dNTPs（各2.5 mM）、0.4 μL FastPfu聚合酶和10 ng模板DNA。
16S rRNA基因PCR扩增条件：95°C初始变性3分钟，27个循环（95°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒），最终72°C延伸10分钟。ITS区域PCR条件类似，扩增循环数为30个。PCR产物用DNA凝胶提取试剂盒（Axygen Biosciences，美国加利福尼亚州尤宁城）纯化，Qubit 3.0荧光计定量，按照Illumina MiSeq指南构建双端测序文库。测序在Illumina MiSeq PE300平台（上海美吉生物医药科技有限公司，中国上海）上进行。细菌ASVs使用Silva 138数据库进行分类。
【数据】DNA提取试剂盒：Omega Bio-tek；16S rRNA引物：338F/806R；ITS引物：ITS1F/ITS2R；PCR体系：20μL（含5×FastPfu Buffer 4μL、引物各0.8μL、dNTPs 2μL、FastPfu聚合酶0.4μL、模板DNA 10ng）；16S扩增循环数：27；ITS扩增循环数：30；测序平台：Illumina MiSeq PE300；细菌数据库：Silva 138
研究结果
3.1 核心微生物驱动的三阶段发酵理化与营养动态
鱼露发酵呈现与理化变化、营养代谢及核心微生物活动紧密关联的明显三阶段特征。这三个阶段——初始底物降解期（H36–D6）、中期前体积累期（D11–D26）和后期风味成熟期（D31–D36）——被整合多组学数据一致验证。
初始阶段以底物快速分解和微生物定殖为特征。pH在H36时为6.2（图1A）。酸化主要由乳酸驱动，乳酸在H36时达到峰值19.41 mg/mL（图1C）。Aspergillus以99.95%的相对丰度主导真菌群落（图4A）。其分泌的细胞外淀粉酶和蛋白酶降解鱼肉碳水化合物和蛋白质，释放可发酵糖。这些糖为乳酸菌提供养料，导致乳酸积累和初始pH降低。此阶段总糖含量从0.90 mg/mL急剧下降至0.82 mg/mL（图1B），微生物群落上调了碳水化合物代谢相关酶（图5M）。糖消耗为微生物增殖提供ATP和碳骨架，进一步强化了Aspergillus和早期细菌类群的定殖。
中期阶段以代谢活动加剧和前体积累为特征。总酸度从D11的44.52 mg/mL激增至D21的75.98 mg/mL（图1C），由多种有机酸同步积累驱动。苹果酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸浓度分别为21.10、11.84、11.43、4.30和8.48 mg/mL（图1C）。酸谱的转变与细菌群落演替相关——Enterobacteriaceae成为优势科，占细菌总数的78.11%–79.97%（图4D）。Enterobacteriaceae利用Aspergillus介导降解的产物，通过糖酵解、TCA循环和混合酸发酵合成有机酸。Aspergillus丰度在D21暂时下降至70.06%（图4A），使Trichoderma等次要类群达到4.22%，但仍保留底物降解角色。游离氨基酸在D21达到峰值64.82 mg/mL，鲜味氨基酸（Asp、Glu、Gly、Ala和Lys）从15.04 mg/mL（H36）增至26.38 mg/mL（D21），提供丰富风味前体。
后期阶段以代谢稳态和风味成熟为标志。pH稳定在5.8左右，总酸度维持在64.53 mg/mL（图1A、C），为酯化反应创造有利条件。微生物群落重新稳定，Aspergillus丰度在D36恢复至90.57%，酿酒酵母属（Saccharomyces，5.46%）和枝孢属（Cladosporium，1.66%）出现（图4A）。这些后期微生物促进醇类产生和酯化反应。非靶向代谢组学显示差异代谢物减少——D26与D31间仅88个，D31与D36间仅21个（图3B），表明系统趋于平衡。游离氨基酸在D36达到最终峰值70.38 mg/mL，鲜味和甜味氨基酸增强咸鲜与醇厚口感。
【数据】初始pH：6.2（H36）；乳酸峰值：19.41mg/mL（H36）；Aspergillus初始相对丰度：99.95%；总糖变化：0.90→0.82mg/mL；总酸度：D11为44.52mg/mL→D21为75.98mg/mL；苹果酸：21.10mg/mL；酒石酸：11.84mg/mL；乙酸：11.43mg/mL；柠檬酸：4.30mg/mL；琥珀酸：8.48mg/mL；Enterobacteriaceae占比：78.11%–79.97%；Aspergillus最低丰度：70.06%（D21）；Trichoderma丰度：4.22%；游离氨基酸峰值：64.82mg/mL（D21）；鲜味氨基酸：15.04→26.38mg/mL；后期pH：约5.8；后期总酸度：64.53mg/mL；Aspergillus恢复丰度：90.57%（D36）；Saccharomyces：5.46%；Cladosporium：1.66%；差异代谢物数：D26-D31为88个，D31-D36为21个；游离氨基酸最终峰值：70.38mg/mL（D36）
3.2 核心微生物演替：Aspergillus-Enterobacteriaceae协同与功能分工
鱼露发酵的微生物群落高度特化——Aspergillus主导真菌群落，Enterobacteriaceae主导细菌群落。其动态演替和协同代谢是风味发展的核心驱动力。
真菌群落分析确认Aspergillus在整个发酵过程中为绝对优势属。其相对丰度在初始阶段（H36–D16）保持99.95%–97.36%的高水平，D21时小幅下降至70.06%，随后在中期后段（D26–D31）恢复至97.03%–98.91%，最终在D36稳定于90.57%（图4A）。这种波动反映了对pH降低和有机酸积累等环境变化的适应。Aspergillus在初始底物降解中发挥关键作用，通过分泌细胞外蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶实现。蛋白质组学数据证实初始阶段与外肽酶活性、蛋白质消化和脂质代谢相关蛋白高表达（图5C、L）。这些酶高效地将鱼肉蛋白分解为肽和游离氨基酸，脂质分解为脂肪酸，碳水化合物分解为可发酵糖，支持其他微生物生长。
在后期阶段，Saccharomyces（5.46%）和Cladosporium（1.66%）出现（图4A），促进醇类产生和酯化反应，增强果香和醇厚风味。ITS被广泛用作真菌主要条形码，但对若干Aspergillus类群的种和株水平区分能力有限。真菌ITS数据集证实Aspergillus属的持续优势，但未将检出的ASVs鉴定为米曲霉3.042。更高分辨率的归属通常需要钙调蛋白、β-微管蛋白、RPB2、cyp51A等次级或株特异性标记，或全基因组方法。米曲霉3.042在米曲中的接种使其成为Aspergillus信号的可能贡献者，但现有证据仅支持Aspergillus相关的水解功能，而非确认株水平的持续存在。因此，外肽酶活性、蛋白质消化和脂质代谢的蛋白质组学证据被用作底物降解的功能支持，而非接种菌株的分类学证明（图5）。
细菌群落动态由肠杆菌属（Enterobacter）主导——H36时为64.68%，D6达峰值83.55%，此后稳定在76.29%–81.03%（图4D）。这种快速激增和稳定反映了高盐环境中不耐盐细菌被淘汰。属水平上，Enterobacter和unclassified_f_Enterobacteriaceae是核心类群，占细菌总数的64.68%–83.55%（图4D）。Enterobacter在D6达到峰值42.14%，而unclassified_f_Enterobacteriaceae在D11达到43.51%（图4D）。这些类群通过氨基酸代谢和混合酸发酵合成有机酸、醇类和挥发性化合物等关键代谢物。其他细菌属包括寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）和沙门氏菌属（Salmonella），维持稳定但较低的丰度。芽孢杆菌属（Bacillus）丰度从H36的9.8%下降至D6后的≤0.5%，表明其在发酵中后期作用有限。魏斯氏菌属（Weissella）在后期出现，但丰度≤0.5%，确认乳酸菌增殖极少。
Aspergillus与Enterobacteriaceae之间的协同互作是微生物代谢效率的关键。Aspergillus通过将大分子营养素降解为可利用前体提供底物基础。Enterobacteriaceae随后驱动这些前体向风味活性化合物的转化。
【数据】Aspergillus初始阶段丰度范围：99.95%–97.36%（H36–D16）；D21丰度：70.06%；D26–D31丰度：97.03%–98.91%；D36丰度：90.57%；Saccharomyces：5.46%；Cladosporium：1.66%；Enterobacter初始丰度：64.68%（H36）；峰值：83.55%（D6）；稳定范围：76.29%–81.03%；Enterobacter峰值：42.14%（D6）；unclassified_f_Enterobacteriaceae峰值：43.51%（D11）；Bacillus丰度：9.8%（H36）→≤0.5%（D6后）；Weissella丰度：≤0.5%
讨论与解读
本研究构建了整合多组学框架，用于解读36天发酵过程中鱼露的风味形成机制。鱼露发酵遵循清晰的三阶段模式，每个阶段由核心微生物活动和代谢通路协同塑造。属水平上，Aspergillus在整个发酵过程中主导真菌群落，与细胞外蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性相关，这些酶降解鱼肉蛋白质、脂质和碳水化合物，释放游离氨基酸（包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等支链氨基酸）、脂肪酸和可发酵糖。Enterobacteriaceae作为优势细菌类群，伴随Ehrlich途径酶的上调，该途径与支链氨基酸分解代谢相关，生成醛类、醇类和酸类等基础风味化合物。风味轮廓呈现有序转变——醛类主导初始阶段，醇类和酮类主导中期，酯类主导后期。3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁醛和庚酸乙酯等关键风味标志物与支链氨基酸分解代谢和微生物协同密切相关。蛋白质组学分析证实外肽酶活性、支链氨基酸降解和酯代谢相关酶显著上调，为风味转化提供分子基础。
编译者解读
该研究的技术路线值得称道——将传统发酵工艺与五重组学手段（理化、扩增子、代谢组、挥发性组、蛋白质组）系统耦合，避免了单一组学"盲人摸象"的局限。三阶段划分和Aspergillus-Enterobacteriaceae功能分工的提出，为定向调控提供了清晰靶点。不过，文中亦坦诚指出ITS测序无法区分株水平——接种的米曲霉3.042是否真正持续存活仍存疑问。未来若引入株特异性标记或宏基因组组装，将能更精确锁定功能微生物。从应用角度看，BCAA代谢节点的确认提示可通过调控前体供给或接种特定菌株来强化特征风味，这对工业化鱼露的品质一致性控制具有直接参考价值。
参考来源
Fu, B. (2026). Aspergillus-Enterobacteriaceae dynamics and branched-chain amino acid metabolism in fermented fish sauce. International Journal of Food Microbiology. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2026.111945
DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2026.111945