定向进化与半理性设计改造火球菌Argonaute

来源：Integrated directed evolution and semirational design of Pyrococcus furiosus Argonaute for ultrasensitive tetracycline detection（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

基于原核Argonaute（pAgo）的生物传感器正成为CRISPR核酸检测的重要补充。本研究采用"定向进化+半理性设计"的分阶段策略，对火球菌Argonaute（PfAgo）进行系统改造。定向进化筛选出含四个氨基酸替换的M2A4突变体，其催化效率较野生型提高5.93倍；随后基于AlphaFold3预测的三种功能态结构，对关键位点I623进行饱和突变，最终获得催化效率提升8.85倍、可溶性表达提高3.8倍的M2A4-M突变体。将其与TetR–EXPAR联用，四环素检测限达10 fmol·L⁻¹。

研究背景

基于原核Argonaute（pAgo）的生物传感器近年来受到广泛关注，被视为CRISPR核酸酶在生物传感领域的有力补充。pAgo的优势包括：不依赖PAM序列，靶标选择更广；使用短单链DNA（ssDNA）向导，化学稳定性好、合成成本低；作为多周转核酸酶，可在一个反应中同时检测多个靶标；切割精度高（向导第10–11位核苷酸之间），支持SNP和点突变鉴别；嗜热pAgo（如PfAgo和TtAgo）在65–99°C下活性稳定，可兼容PCR和LAMP扩增流程。然而，与Cas12/13效应蛋白相比，多数pAgo的催化效率偏低，限制了其实际应用。经典结构导向的蛋白工程依赖高分辨率结构信息，AI辅助设计虽扩展了序列探索空间，但对依赖激活偶联组装步骤的酶而言，单靠随机突变或结构预测难以精准锁定关键决定因素。本研究将定向进化与半理性设计分阶段结合，以系统提升PfAgo的催化性能。

研究方法

PfAgo突变体文库的设计与构建

以pET28a-PfAgo质粒为模板，通过易错PCR（epPCR）扩增PfAgo基因。反应体系中含0.2 mmol·L⁻¹ dNTP、各0.5 mmol·L⁻¹ dCTP和dTTP、5 U EasyTaq DNA聚合酶（北京全式金生物技术有限公司）、5 μL 10×Buffer、各1 μmol·L⁻¹引物及0.3 mmol·L⁻¹ MnCl₂。5′端引物Error-F（5′-GGGAATTCCATATGAAGGCGAAAGTGGTT-3′）和3′端引物Error-R（5′-TCCGCTCGAGTTACACAAAGTACAGGAAG-3′）分别与NdeI和XhoI酶切位点两侧的载体区域互补。epPCR程序：98°C初始变性3 min；30个循环（95°C 20 s，58°C 30 s，72°C 2 min）；72°C终延伸10 min。PCR产物经DpnI限制性内切酶37°C消化2 h去除模板。预期2.3 kb片段经琼脂糖凝胶电泳确认后，用PCR清洁试剂盒纯化，再用NdeI和XhoI于37°C酶切3 h。酶切片段纯化后连接至经NdeI和XhoI双酶切的pET-28a表达载体。连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含50 μg·mL⁻¹卡那霉素的LB琼脂平板，37°C培养。

【数据】模板：pET28a-PfAgo；dNTP：0.2 mmol·L⁻¹；dCTP/dTTP：各0.5 mmol·L⁻¹；MnCl₂：0.3 mmol·L⁻¹；聚合酶：5 U EasyTaq；变性：98°C 3 min；循环数：30；退火：58°C 30 s；延伸：72°C 2 min；DpnI消化：37°C 2 h；片段大小：2.3 kb；卡那霉素：50 μg·mL⁻¹

突变体文库筛选

将携带pET28a-PfAgo的大肠杆菌BL21(DE3)转化子接种于含50 μg·mL⁻¹卡那霉素的200 μL LB培养基中，于96孔深孔培养板中37°C培养。母板培养物以10%甘油保存于−80°C。取20 μL过夜培养物转接至含600 μL LB培养基（50 μg·mL⁻¹卡那霉素）的新96孔板中，加入0.2 mmol·L⁻¹异丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG），28°C诱导培养6 h。向每孔加入20 μL T7噬菌体，22°C孵育2–3 h至培养液变清。将96孔深孔板转移至75°C水浴处理30 min去除杂蛋白。活性验证反应体系（20 μL）：10 μL裂解液、1 μL gDNA、3 μL ssDNA-FQ、5 μL 2×PfAgo反应缓冲液（40 mmol·L⁻¹ Tris、200 mmol·L⁻¹ NaCl、0.25 mmol·L⁻¹ MgCl₂，pH=8.0）和1 μL去离子水，95°C孵育30 min。gDNA序列：5′-P-GAGGTCCTCGAGGTATG-3′；ssDNA-FQ序列：5′-6FAM-CATACCTCGAGGACCTC-BHQ1-3′。用荧光微板读数器测量荧光强度，激发波长485 nm、发射波长520 nm。每块96孔板设置多个表达野生型PfAgo的孔作为内参，建立参考活性分布。荧光信号扣除背景后，以同板野生型均值为基准归一化，以减少板间差异。初筛阳性定义为荧光信号超过同板野生型均值3个标准差（mean + 3σ）以上的变体。所有初筛阳性克隆进行独立复筛（≥3个生物学重复），仅保留活性提升可重复且可溶性表达水平相当的变体用于测序（上海桑尼生物科技有限公司）及后续动力学表征。

【数据】培养基：LB；卡那霉素：50 μg·mL⁻¹；IPTG：0.2 mmol·L⁻¹；诱导温度/时间：28°C/6 h；T7噬菌体：20 μL/孔；裂解温度/时间：75°C/30 min；反应体系：20 μL；gDNA：1 μL；ssDNA-FQ：3 μL；缓冲液：2×PfAgo反应缓冲液；反应温度/时间：95°C/30 min；激发/发射波长：485/520 nm；筛选阈值：mean + 3σ

PfAgo定点突变

以WT PfAgo质粒为模板，采用寡核苷酸介导的环状PCR生成V142A、Y413C、K417R和I623F单点突变体。PCR条件：95°C 3 min；30个循环（95°C 15 s，58°C 30 s，72°C 4 min）；72°C终延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证，用OMEGA凝胶回收试剂盒纯化，Nanodrop分光光度计定量。使用ClonExpress II一步克隆试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行质粒重组，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。经测序验证的克隆用于蛋白表达和功能分析。

【数据】突变位点：V142A、Y413C、K417R、I623F；变性：95°C 3 min；循环数：30；退火：58°C 30 s；延伸：72°C 4 min；终延伸：72°C 5 min；凝胶：1%琼脂糖

WT PfAgo蛋白及突变体的表达与纯化

WT PfAgo及突变体以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，在含50 μg·mL⁻¹卡那霉素的LB培养基中37°C培养至OD600达0.7。加入0.2 mmol·L⁻¹ IPTG于16°C诱导蛋白表达。诱导20 h后，4°C下7,000×g离心10 min收集菌体。菌体经预冷PfAgo结合缓冲液洗涤重悬后，用高压均质机破碎，12,000×g离心40 min收集上清。重组蛋白用洗脱缓冲液（20 mmol·L⁻¹ Tris、250 mmol·L⁻¹ NaCl、250 mmol·L⁻¹咪唑，pH 8.0）洗脱纯化。超滤脱盐处理后获得目标蛋白。纯化样品经12.5%分离胶和4%浓缩胶SDS-PAGE分析。凝胶用含0.1%考马斯亮蓝R250、50%甲醇和10%冰醋酸的溶液染色，再用含7.5%冰醋酸的溶液脱色。

【数据】宿主：E. coli BL21(DE3)；卡那霉素：50 μg·mL⁻¹；诱导OD600：0.7；IPTG：0.2 mmol·L⁻¹；诱导温度：16°C；诱导时间：20 h；离心：7,000×g 10 min（4°C）；破碎后离心：12,000×g 40 min；洗脱缓冲液：20 mmol·L⁻¹ Tris、250 mmol·L⁻¹ NaCl、250 mmol·L⁻¹咪唑，pH 8.0；凝胶：12.5%分离胶/4%浓缩胶

PfAgo蛋白I623F位点饱和突变

使用AlphaFold3生成三种代表性结构模型：M2A4的游离态（未结合构象）、与gDNA的二元复合物（靶标结合前状态）、以及与gDNA和完全配对靶DNA的三元复合物（催化活化所必需的功能二聚化状态）。每种模型预测5次，选取ipTM和pTM评分最高的蛋白模型。结构图用PyMOL V2.5.0软件生成。使用FoldX 5版本分析I623残基的单点饱和突变对蛋白稳定性的影响。随后以pET28a-PfAgo质粒为模板、含目标突变的一对互补寡核苷酸为引物，按已发表方案通过饱和突变将不同侧链大小和理化性质的氨基酸引入I623F位点。PCR混合物（50 μL）含10 ng模板、各0.2 μmol·L⁻¹突变引物、1单位TransStart® FastPfu DNA聚合酶（北京全式金生物技术有限公司）、1×Phusion HF反应缓冲液和0.2 mmol·L⁻¹ dNTPs。PCR程序：95°C变性3 min；30个循环（95°C 30 s，59°C 30 s，72°C 4 min）；72°C终延伸10 min。DpnI于37°C消化2 h去除质粒模板。产物转化大肠杆菌DH5α进行测序。含目标突变的质粒用于后续蛋白表达和纯化。

【数据】AlphaFold3模型数：3种状态×5次预测；FoldX版本：5；PCR体系：50 μL；模板：10 ng；引物：各0.2 μmol·L⁻¹；聚合酶：1 U TransStart® FastPfu；dNTPs：0.2 mmol·L⁻¹；变性：95°C 3 min；循环数：30；退火：59°C 30 s；延伸：72°C 4 min；终延伸：72°C 10 min；DpnI消化：37°C 2 h

组合突变

为系统阐明V142A、Y413C、K417R和I623F各突变及其组合的贡献，构建了所有可能的单突变、双突变和三突变变体。以pET28a-PfAgo质粒为模板，用含目标突变的一对互补寡核苷酸为引物进行定点突变。PCR混合物含10 ng模板、各0.2 μmol·L⁻¹引物、1单位TransStart® FastPfu DNA聚合酶（北京全式金生物技术有限公司）。

【数据】模板：pET28a-PfAgo（10 ng）；引物：各0.2 μmol·L⁻¹；聚合酶：1 U TransStart® FastPfu

研究结果

定向进化改造PfAgo

如图1A所示，研究采用定向进化策略筛选催化性能提升的PfAgo变体。构建易错PCR文库，共筛选约8,875个独立转化子。WT PfAgo蛋白及突变体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。活性筛选采用T7噬菌体介导的裂解系统偶联荧光切割分析。双标记DNA探针两端分别携带荧光基团和淬灭基团作为底物。活性PfAgo变体依赖向导切割底物后，荧光基团与淬灭基团空间分离，产生与酶活性成正比的荧光信号。各筛选板的荧光值以WT对照归一化以减少板间差异。超过预设统计阈值的变体进入二次验证。经重复确认和可溶性表达评估后，一个表现最优的变体M2A4被选作进一步表征。WT PfAgo和M2A4均在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并经镍亲和层析纯化。SDS-PAGE确认蛋白分子量约为90.4 kDa（图2A及在线补充信息图S1）。测序结果显示，M2A4相对于WT PfAgo含有4个氨基酸替换：V142A、Y413C、K417R和I623F（图2B）。

用Bradford法测定WT PfAgo、M2A4变体及四个单点突变体（V142A、Y413C、K417R和I623F）的可溶性蛋白表达量，并以湿菌体生物量归一化。V142A、Y413C、K417R和I623F的产量分别为0.05、0.18、0.06和0.05 mg·g⁻¹，WT PfAgo为0.05 mg·g⁻¹。M2A4产量为0.18 mg·g⁻¹，较WT提高3.6倍。M2A4可溶性表达升高与Y413C单突变体高度一致，表明表达改善主要归因于Y413C替换而非突变累积效应。

【数据】筛选转化子数：约8,875个；蛋白分子量：~90.4 kDa；V142A产量：0.05 mg·g⁻¹；Y413C产量：0.18 mg·g⁻¹；K417R产量：0.06 mg·g⁻¹；I623F产量：0.05 mg·g⁻¹；WT产量：0.05 mg·g⁻¹；M2A4产量：0.18 mg·g⁻¹（较WT提高3.6倍）

利用实时PCR仪器对WT PfAgo和M2A4的切割活性进行定性和定量评价。在相同测定条件下，M2A4产生的荧光信号显著强于WT PfAgo，表明M2A4的DNA切割活性大幅增强。根据参考文献[25]的方法，将底物浓度依赖数据拟合至Michaelis–Menten动力学，计算WT PfAgo和M2A4的催化常数（k_cat）和米氏常数（K_m）。结果（图2C–F）显示，M2A4的催化效率（k_cat/K_m）显著更高，较WT PfAgo提高5.93倍。为解析各突变的功能贡献，对四个单点突变体（V142A、Y413C、K417R和I623F）进行了表征（图2G）。四个突变体中，I623F重现了M2A4中观察到的催化增强效应，而V142A、Y413C和K417R的活性与WT PfAgo相近。结果表明I623F可能是M2A4催化增强的关键因素。

【数据】M2A4催化效率（k_cat/K_m）：WT的5.93倍；关键突变：I623F

M2A4的半理性改造

基于M2A4和I623F的发现，采用半理性设计策略，利用基于不同功能状态的多层次计算策略进一步进化以获得更高性能的PfAgo蛋白。使用AlphaFold3生成三种代表性结构模型：M2A4的游离态（未结合构象，图3A0）；与gDNA的二元复合物（靶标结合前状态，图3B0）；以及与gDNA和完全配对靶DNA的三元复合物（催化活性所需靶标诱导二聚化组装，图3C0）。该三元复合物的形成由靶DNA诱导的二聚化驱动，涉及PIWI–MID、PIWI–PIWI和PAZ–N结构域之间的大面积界面，对稳定催化环和激活切割活性至关重要。使用FoldX 5.0和YASARA软件对全部三种结构状态进行虚拟饱和突变，计算ΔΔG并评估623位点突变效应。如图3A1–C1所示，三种模型按ΔΔG值从低到高排序，突变体的总体排序趋势相似。但三种模型在ΔΔG绝对值及突变体相对排序上存在显著差异。基于计算结果，选择ΔΔG值低于2.0 kcal·mol⁻¹的变体（M2A4-I、M2A4-M、M2A4-L、M2A4-V、M2A4-W和M2A4-Y）作为实验验证候选。ΔΔG值越低表示折叠蛋白的热力学稳定性越高，值越高则表示去稳定化。

计算预测通过623位点饱和突变实验验证。SDS-PAGE确认十个变体（M2A4-A、C、G、I、L、M、T、V、W和Y）的可溶性表达，分子量均约为90.4 kDa（图3D）。与计算预测一致，六个可溶性变体（M2A4-M、I、L、V、W和Y）在游离态和三元复合物结构模型中的ΔΔG值低于2.0 kcal·mol⁻¹（图3A1、C1）。相反，九个在三种模型中预测ΔΔG值均高于2.0 kcal·mol⁻¹的替换（M2A4-D、E、R、K、H、S、Q、N和P）未能产生可溶性蛋白，表达严重减少或缺失。这些结果与计算模型高度吻合，支持了其对稳定性和可溶性结果的预测可靠性。然而，四个变体（M2A4-A、C、G和T）偏离了预测——尽管ΔΔG值超过2.0 kcal·mol⁻¹，它们仍表达良好且可溶，表明ΔΔG参数主要反映折叠态的热力学稳定性，并不能完全涵盖控制体内表达成功的动力学或溶解度效应。

【数据】ΔΔG阈值：2.0 kcal·mol⁻¹；可溶性变体：M2A4-A、C、G、I、L、M、T、V、W、Y（10个）；分子量：~90.4 kDa；不可溶变体：M2A4-D、E、R、K、H、S、Q、N、P（9个）；预测偏差变体：M2A4-A、C、G、T（4个）

M2A4衍生变体的动力学与功能表征

对可溶性PfAgo变体催化性能的系统评价显示，所有变体均保留可检测的活性，但切割动力学差异显著。构建PfAgo变体所用引物详见在线补充信息表S1。基于这些观察，对各表达良好的突变体优化了缓冲液组成和反应温度（在线补充信息图S2–S5）。时间过程分析显示，大多数突变体相对WT PfAgo切割加速（图4A及在线补充信息表S2）。M2A4-M在500 s内达到反应平衡，而WT需要1560 s，反应速度提高约3倍。随后在相同反应条件（20 mmol·L⁻¹ Tris、200 mmol·L⁻¹ NaCl、2 mmol·L⁻¹ Mn²⁺，pH 8.0，97°C）下测定稳态动力学参数（K_m、k_cat和k_cat/K_m）。在可溶性饱和突变组中，大多数变体的表观K_m值显著降低（为WT的0.08–0.26倍），而k_cat随替换不同而变化（图4B–E及在线补充信息表S3、图S6–S7）。M2A4-M的催化效率最高（为WT PfAgo的8.85倍），主要由K_m大幅降低（0.11倍）驱动，同时k_cat接近天然水平（0.97倍）。

【数据】平衡时间：M2A4-M 500 s vs WT 1560 s；反应条件：20 mmol·L⁻¹ Tris、200 mmol·L⁻¹ NaCl、2 mmol·L⁻¹ Mn²⁺，pH 8.0，97°C；K_m范围：WT的0.08–0.26倍；M2A4-M催化效率：WT的8.85倍；M2A4-M K_m：WT的0.11倍；M2A4-M k_cat：WT的0.97倍

M2A4-M增强活性与离子稳健性的结构与动力学基础

（图5展示PfAgo结构域架构、WT与M2A4-M在PIWI–MID界面和催化中心的作用细节及催化中心附近的盐桥网络。）

【数据】原文未详述

TetR–EXPAR–PfAgo生物传感系统检测四环素的性能评价

【数据】原文未详述

讨论与解读

可编程核酸酶是新兴生物传感技术的核心，但其实际部署取决于能否获得高性能酶变体。经典结构导向蛋白工程依赖原子模型和基于物理的能量函数来调节堆积、氢键和静电作用，但往往需要可靠的高分辨率结构信息。AI赋能设计通过从大数据集学习序列-结构-功能关系扩展了序列探索空间，但许多方法仍依赖结构先验、大量计算资源和精选训练数据。PfAgo的活性依赖于激活偶联的组装步骤，包括向导/靶标结合和靶标触发的二聚化。对于这种分布式调控的酶，仅靠无限制随机突变或单一结构预测难以高效锁定关键决定因素。本研究将定向进化与半理性设计分阶段结合——定向进化实现了PfAgo序列空间的无偏探索，在不依赖预设结构假设的情况下识别功能敏感残基（如I623）；半理性设计则利用AlphaFold3预测的多功能态结构，对关键位点进行精准饱和突变。这种"先宽后精"的策略有效克服了单一方法的局限。

编译者解读：本研究的方法论价值在于将无偏筛选与结构计算有机衔接——先用定向进化"找到"关键残基，再用AI结构预测"理解"其机制，最后用饱和突变"放大"其效应。8.85倍催化效率提升和10 fmol·L⁻¹四环素检测限均来自原文数据，体现了pAgo工程化改造的实用潜力。值得注意的是，ΔΔG预测与实验表达结果存在4个偏差变体，说明热力学稳定性参数尚不能完全预测体内可溶性，计算-实验互证的必要性由此凸显。后续向POCT场景推进仍需解决操作流程简化和设备集成等问题。

参考来源

期刊：Trends in Biotechnology, 2026

DOI：10.1016/j.tibtech.2026.04.008

DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.04.008