来源：Stepwise engineering of AmpR-based whole-cell biosensors for broad-spectrum detection and high-throughput screening of β-lactam compounds（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
头孢菌素C（CPC）是丝状真菌的次级代谢产物，也是工业合成7-氨基头孢烷酸（7-ACA）的关键前体。本研究以AmpR调控因子为核心，通过多轮定向进化与位点饱和突变，获得性能优异的变体AmpRR86H/L199S，其对CPC的动态范围达23.9倍，检测限降低，且对四类主要β-内酰胺及7-ACA具有广谱响应。基于该变体建立的液滴微流控平台实现了顶头孢霉的高通量筛选，CPC产量最高提升5.6倍。
研究背景
β-内酰胺类抗生素是临床使用最广泛的抗菌药物，通过抑制细菌细胞壁肽聚糖组装发挥杀菌作用。然而，病原菌与抗生素长期共进化过程中发展出多种耐药策略，其中最普遍且最令人担忧的是β-内酰胺酶的产生。在肠杆菌科及多种革兰氏阴性菌中，内源AmpR–AmpC系统与细胞壁回收紧密偶联，控制编码β-内酰胺酶的ampC基因的可诱导表达。LysR型转录调控因子AmpR介导这一响应：基础条件下，AmpR与UDP-MurNAc五肽形成阻遏复合物沉默ampC转录；暴露于β-内酰胺后，肽聚糖降解产物被转运至细胞质并转化为1,6-脱水MurNAc肽，作为AmpR的共激活因子将其切换至激活状态，驱动ampC表达，使细菌抵御抗生素攻击。
微生物中广泛分布的代谢物响应调控回路是构建基因编码生物传感器的丰富资源。已有多种抗生素响应生物传感器基于微生物感知和防御抗生素的传感元件开发，如TetR和MphR等。对β-内酰胺而言，源自不同微生物的AmpR-AmpC、BlaR1/BlaI和PghK/PghR三种调控系统已被成功用于开发β-内酰胺响应生物传感器。本研究旨在通过系统改造AmpR，获得与液滴微流控兼容的高性能全细胞生物传感器，用于β-内酰胺产生菌的高通量选育。
研究方法
2.1 菌株、培养基及培养条件
本研究所用菌株列于表S1。大肠杆菌Top10作为质粒构建的受体菌。大肠杆菌常规培养于LB培养基，37°C、220 rpm。需要时添加抗生素至终浓度：氨苄青霉素50 μg/mL、氯霉素50 μg/mL或卡那霉素50 μg/mL。顶头孢霉菌株在CM琼脂平板上30°C培养产孢。液滴培养时，顶头孢霉节孢子接种于YPSM液体培养基（每升含：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、K2HPO4·3H2O 1.3 g、MgSO4·7H2O 1 g、蛋氨酸0.5 g；pH 7.0），28°C培养。24孔板或250 mL摇瓶CPC发酵时，顶头孢霉菌落先在发酵培养基（每升含：玉米浆30 g、蔗糖35 g、葡萄糖5 g、蛋氨酸0.5 g、(NH4)2SO4 8 g、CaCO3 5 g、大豆油5 g）中28°C、220 rpm培养3天。种子培养物以10%（v/v）接种量转接至新鲜发酵培养基，同条件下继续培养10天。
【数据】培养基：LB/YPSM/CM/发酵培养基；温度：37°C（大肠杆菌）/28°C（顶头孢霉）；转速：220 rpm；抗生素浓度：50 μg/mL；接种量：10%（v/v）；培养时间：3天+10天；pH 7.0
2.2 常规质粒构建
本研究所用质粒列于表S1。常规质粒构建中，DNA片段用Q5高保真DNA聚合酶（NEB，美国）PCR扩增，并通过ClonExpress MultiS一步克隆试剂盒（Vazyme，中国）按制造商方案连接至相应载体骨架。所用引物汇总于表S2。所用遗传元件（包括启动子和基因）序列列于表S3。
【数据】聚合酶：Q5高保真DNA聚合酶；克隆试剂盒：ClonExpress MultiS One-Step Cloning Kit；引物见表S2；元件序列见表S3
2.3 CRISPR/Cas9介导的大肠杆菌基因缺失
基因缺失采用双质粒CRISPR/Cas9系统。构建sgRNA表达质粒时，从大肠杆菌Top10基因组DNA扩增靶基因上下游各150-bp侧翼区，连接至含sgRNA转录单元的载体骨架，生成质粒pRed-sgRNA(Target_del)-SacB。随后将该质粒与Cas9辅助质粒pCas9-SacBTs共转化至大肠杆菌Top10。用4 g/L L-阿拉伯糖诱导CRISPR/Cas9介导的基因缺失，30°C、220 rpm过夜进行。菌落PCR确认缺失成功后，通过在含10%（w/v）蔗糖的无抗生素培养基中37°C、220 rpm连续传代消除质粒pRed-sgRNA(Target_del)-SacB和pCas9-SacBTs。
【数据】诱导剂：4 g/L L-阿拉伯糖；温度：30°C；转速：220 rpm；侧翼区长度：150 bp；蔗糖浓度：10%（w/v）；消除温度：37°C
2.4 AmpR突变文库构建（定向进化与位点饱和突变）
定向进化采用易错PCR（epPCR）生成ampR基因随机突变文库。PCR反应使用2 × Hiffe PCR Master Mix（Transgene，中国），添加0.5 mM Mn2+，按制造商说明进行。第一轮epPCR以质粒p15A-ampR-PampC-gfp为模板；第二轮以p15A-ampR(R86H)-PampC-gfp为模板。PCR产物经胶回收后用ClonExpress MultiS一步克隆试剂盒（Vazyme，中国）体外同源重组克隆至载体骨架。连接产物转化至大肠杆菌Top10/ΔampC感受态细胞，获得菌株文库AmpR_lib_1st和AmpR_lib_2nd。每个文库收集约30,000个菌落用于后续筛选。
位点饱和突变采用类似策略，区别在于突变ampR基因片段使用含“NNK”密码子的简并引物扩增，在特定位点引入随机突变。构建AmpRR86/L199和AmpRT103/S221/Y264文库时，分别获得约5,000和100,000个菌落，均进行FACS筛选。
【数据】Mn2+浓度：0.5 mM；文库规模：约30,000个菌落（epPCR）；约5,000和100,000个菌落（位点饱和突变）；模板：p15A-ampR-PampC-gfp（第一轮）/p15A-ampR(R86H)-PampC-gfp（第二轮）
2.5 改良生物传感器变体的筛选、表征与重建
菌株文库过夜培养后以2%（v/v）接种量转接至添加10 μg/mL CPC的新鲜LB培养基。37°C、220 rpm孵育4小时后，培养物用PBS稀释至适当密度进行FACS分析，以未加CPC诱导的菌株文库作为阴性对照。分选荧光增强的变体并涂布于含50 μg/mL氯霉素的LB琼脂平板过夜培养。
改良变体表征时，用自动菌落挑取仪（Qpix，Beckman Coulter，美国）随机挑取单菌落至96深孔板，37°C、800 rpm培养16小时。培养物以1:50稀释至新鲜培养基，培养至OD600达0.5–0.6。每份培养物分至两个平行96深孔板，在含或不含10 μg/mL CPC条件下继续孵育4小时。用酶标仪（BioTek NeO2，美国）记录OD600和绿色荧光强度（λex/λem = 488/520 nm），激发和发射带宽均为20 nm。与阴性对照相比，诱导后归一化GFP荧光（GFP/OD600）显著提升的变体被选送测序。随后以p15A-ampR-PampC-gfp为模板通过体外同源重组重建生物传感器质粒变体。
【数据】接种量：2%（v/v）；CPC浓度：10 μg/mL；孵育时间：4 h；温度：37°C；转速：220 rpm/800 rpm；OD600范围：0.5–0.6；氯霉素浓度：50 μg/mL；荧光检测：λex/λem = 488/520 nm，带宽20 nm
2.6 生物传感器剂量-响应曲线与底物特异性测定
剂量-响应实验在96孔板中进行。大肠杆菌生物传感器菌株过夜培养物以1:50稀释至新鲜LB培养基，37°C、800 rpm培养至OD600达0.5–0.6。随后加入各β-内酰胺抗生素的浓度梯度，继续孵育4小时。取100 μL等分试样转移至96孔ELISA板，用酶标仪（BioTek NeO2，美国）分析OD600和荧光（λex/λem = 488/520 nm，带宽20 nm）。
【数据】稀释比例：1:50；OD600范围：0.5–0.6；孵育时间：4 h；温度：37°C；转速：800 rpm；检测体积：100 μL
2.7 检测限（LOD）与动态范围的定义
本研究中，生物传感器对特定β-内酰胺抗生素的LOD定义为归一化GFP荧光与未诱导对照差异显著（p < 0.05）的最低浓度。动态范围定义为指定抗生素浓度下荧光/OD600比值相对未处理对照的倍数变化。
【数据】LOD定义：p < 0.05显著差异的最低浓度；动态范围：荧光/OD600相对对照的倍数变化
2.8 分子动力学（MD）模拟
38 bp DNA·AmpR和21 bp DNA·AmpR复合物用AlphaFold 3预测。优先选择高置信度模型——效应物结合域pTM评分为0.96。将预测模型与效应物结合域晶体结构（如PDB ID 4WKM和3KOS）叠加以评估预测的局部主链和侧链构象准确性。同时仔细检查预测的蛋白质-DNA结合模式与Vadlamani等人（2015）报道的小角散射（SAXS）数据一致。AmpR·DNA·1,6-脱水-MurNAc-五肽三元复合物通过将配体置于AmpR结合口袋生成，以AmpR·UDP-MurNAc-五肽复合物（PDB ID: 4WKM）为参考。可滴定残基（His、Asp、Glu）的质子化状态用H++服务器确定。蛋白质、DNA和配体分别采用AMBER ff19SB、bsc1和GAFF2力场。配体参数来自B3LYP/6-31G优化和HF/6-31G RESP电荷计算（Gaussian 16）。缺失氢原子用LEaP程序添加。体系溶剂化为TIP3P水（10 Å填充），Na+离子中和。残留位点突变……
【数据】预测工具：AlphaFold 3；pTM评分：0.96；参考结构：PDB 4WKM/3KOS；力场：AMBER ff19SB/bsc1/GAFF2；量子化学：B3LYP/6-31G和HF/6-31G；溶剂：TIP3P水，10 Å填充
研究结果
3.1 β-内酰胺敏感大肠杆菌底盘中原型AmpR荧光生物传感器的开发
大肠杆菌基因组缺乏内源AmpR调控因子，导致同一操纵子内P frdD启动子控制下ampC基因组成型表达。为防止目标β-内酰胺被生物传感器检测前降解，敲除了大肠杆菌Top10的内源ampC基因，获得菌株Top10/ΔampC，其对CPC的最低抑菌浓度（MIC）较亲本菌株降低十倍（从500降至50 μg/mL）。
随后，将来自弗氏柠檬酸杆菌的PampC-ampR组件在大肠杆菌Top10和Top10/ΔampC中异源表达，分别获得菌株S0和S1。两种构建体中，ampR和gfp从双向PampC启动子双向转录，使生物传感器能在β-内酰胺响应下于GFPoff和GFPon状态间切换（图1A）。
评估了S0和S1在不同浓度CPC下的生长及归一化GFP荧光。生长曲线显示，S0耐受的最大CPC浓度随时间逐渐增加，10小时后高达200 μg/mL——内源β-内酰胺酶的持续表达和分泌使CPC在培养基中被灭活，S0因而能耐受不断升高的CPC浓度。相比之下，S1仅在20 μg/mL CPC下存活，且该阈值不随培养时间延长而显著变化。
值得注意的是，CPC诱导下的生物传感器性能与菌株生长状态密切相关。S0在CPC浓度低于20 μg/mL时无响应，此时菌株生长几乎不受抑制。当CPC浓度超过50 μg/mL时，归一化GFP荧光及单细胞水平GFP强度显著增加，生物传感器在不同CPC浓度诱导下动态范围为2.64至3.16倍，随后随细胞密度增加逐渐下降。这些结果表明，细胞损伤——肽聚糖降解超过合成导致回收的肽聚糖片段过量——是AmpR生物传感器正常工作的先决条件。当肽聚糖合成与降解达到新平衡、细胞损伤通过生物量积累修复后，AmpR介导的GFP表达关闭，动态范围随之降低。此外，S0耐受的最大CPC浓度随时间增加，达到最大动态范围的时间点随CPC浓度从50增至200 μg/mL而从2小时逐渐推迟至10小时。
相比之下，S1表现出显著更高的灵敏度，能检测低于20 μg/mL的CPC，该检测阈值与其生长抑制范围（10–20 μg/mL）一致。S1在CPC诱导下随时间呈现更高且更稳定的动态范围，报告动态范围维持在2倍以上。
考虑到AmpR调控与细胞壁回收的紧密关联，进一步考察了工程改造大肠杆菌细胞壁回收途径是否影响AmpR全细胞生物传感器在β-内酰胺暴露下的性能。一方面，为阻断CPC降解，选择编码头孢菌素乙酰酯酶的aes基因作为ampC之外的额外敲除靶点，构建生物传感器变体S2。此前有报道称aes缺失能显著减少大肠杆菌JM105对CPC的消耗。另一方面，为增加1,6-脱水MurNAc肽的胞内池，选择ampG、nagZ和ampD作为工程靶点——其编码产物分别参与1,6-脱水MurNAc肽的转运、生成和消耗（图1F）。具体而言，为增强从肽聚糖层释放的GlcNAc-1,6-脱水胞壁肽的转运，从组成型启动子Pj23108驱动的质粒过表达ampG（编码通透酶AmpG），获得变体S3（图1H）。为促进生成并减少消耗1,6-脱水MurNAc肽，构建了变体S4（过表达nagZ，编码β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶）、S5（ΔampD，编码N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶）和S6（联合两种策略）。
所有构建的生物传感器变体在CPC诱导下的剂量-响应性能表征显示：S1平均动态范围为2.6倍，仅S3有适度提升，同条件下达5.1倍（图1G和H）；S2、S4、S5和S6均无显著增强。ampD缺失使基础荧光增加约10倍，这与无法生成UDP-MurNAc五肽、从而消除AmpR介导的阻遏并导致GFP泄漏表达一致。总之，在β-内酰胺敏感的大肠杆菌底盘中异源表达AmpR回路，获得了一种高灵敏度、动态范围稳定的荧光β-内酰胺响应生物传感器，为后续工程改造提供了理想平台。
【数据】MIC：500→50 μg/mL（降低10倍）；S0最大耐受CPC：200 μg/mL（10 h）；S0动态范围：2.64–3.16倍；S1可检测CPC：<20 μg/mL；S1动态范围：>2倍；S1平均动态范围：2.6倍；S3动态范围：5.1倍；ampD缺失基础荧光增加：约10倍
3.2 AmpR分步工程改造提升生物传感器性能
已有多个成功案例表明，通过工程改造调控因子的序列和结构，可显著提升LTTR类生物传感器的动态范围、操作范围和LOD等性能参数。因此，本研究旨在通过AmpR的分步工程改造优化生物传感器对β-内酰胺的检测性能。
首先尝试对效应物-蛋白结合进行工程改造：对EBD内此前报道直接与配体相互作用的三个残基T103、S221和Y264进行饱和突变。然而，经FACS筛选和功能验证，没有变体优于原型生物传感器S1，表明配体口袋内的局部变化不足以增强调控因子的转录激活能力。
因此，转向对整个AmpR序列进行系统性全局突变。研究实施了基于FACS的迭代定向进化和位点饱和突变工程，借助自动菌落挑取仪和液体处理工作站对筛选变体进行高通量表征（图2A）。
第一轮中，以野生型ampR基因为模板通过易错PCR构建突变文库AmpR_lib_1st。经10 μg/mL CPC诱导后，文库进行FACS筛选，收集GFP荧光最高的前0.3%细胞（图2B）。复筛鉴定出两个优良变体：1-6B和4-1E，在10 μg/mL CPC诱导下分别显示10.1倍和3.1倍动态范围。序列分析显示，变体1-6B含有位于LH结构域的单个替换R86H，该突变使1-6B的动态范围相对AmpR生物传感器S1增加292%。变体4-1E则含五个突变，包括DNA结合域（DBD）内的F14L。该变体摒弃……
【数据】筛选阈值：前0.3%最高GFP细胞；CPC诱导浓度：10 μg/mL；1-6B动态范围：10.1倍；4-1E动态范围：3.1倍；R86H突变提升：292%；CPC产量提升：最高5.6倍；dose-response动态范围：23.9倍（CPC）
讨论与解读
微生物中广泛分布的代谢物响应调控回路——包括诱导型启动子、转录因子和双组分系统——是构建靶向特定分子的基因编码生物传感器的丰富资源库。许多抗生素响应生物传感器基于微生物感知和防御抗生素的传感元件开发。TetR和MphR等参与细菌四环素和红霉素耐药的转录阻遏物已被广泛开发为全细胞和体外生物传感器。对β-内酰胺而言，源自不同微生物的AmpR-AmpC、BlaR1/BlaI和PghK/PghR三种调控系统已被成功应用于不同底盘中的β-内酰胺响应生物传感器开发。
本研究通过系统性的分步工程改造，将AmpR从天然β-内酰胺酶表达调控因子转化为高性能合成生物传感元件。R86H/L199S双突变带来的23.9倍动态范围和广谱响应能力，使该生物传感器足以应对液滴微流控筛选的严苛要求。结构分析揭示的紧凑构象与更快的效应物响应转换，为理解LTTR家族调控因子的激活机制提供了新视角。将传感器应用于顶头孢霉和7-ACA相关酶的高通量筛选，展示了合成生物学工具从检测到选育的完整闭环。
编译者解读
本研究体现了典型的"传感器工程"策略——不是寻找新调控因子，而是对已知调控系统进行多轮迭代改造，使其性能指标从天然水平跃升至工业应用标准。R86H位于铰链区而非配体结合口袋这一发现颇具启发性：它提示调控因子的动态构象变化可能比静态结合亲和力更值得关注。液滴微流控与FACS结合的工作流程代表了菌株选育从"经验筛选"向"数据驱动"的范式转变。局限在于，AmpR变体的广谱响应可能牺牲了对特定β-内酰胺的选择性，在需要精准区分的场景中仍需搭配其他检测手段。
参考来源
Liu X. Stepwise engineering of AmpR-based whole-cell biosensors for broad-spectrum detection and high-throughput screening of β-lactam compounds. Biosensors and Bioelectronics, 2026. DOI: 10.1016/j.bios.2026.118686
DOI: 10.1016/j.bios.2026.118686