来源：Single-cell ATP monitoring in Escherichia coli engineered for polyhydroxybutyrate production using the fluorescent biosensor QUEEN（Journal of Bioscience and Bioengineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
聚羟基脂肪酸酯（PHA）是微生物积累的胞内聚酯，其合成过程与细胞能量代谢密切相关。本研究将PHA生物合成基因与大肠杆菌内源性ATP比率荧光传感器QUEEN共表达，在单细胞水平上监测聚-3-羟基丁酸酯[P(3HB)]合成过程中的ATP水平变化。研究发现，通过外源补充3HB前体诱导聚合物合成时，P(3HB)的产生并未显著扰动胞内ATP水平——细胞在能量代谢层面展现出稳健的稳态调控能力。该工作为理解微生物产PHA过程中的能量代谢提供了单细胞分辨率的实时视角。
研究背景
聚羟基脂肪酸酯作为微生物胞内积累的聚酯材料，其生物合成过程涉及乙酰辅酶A的碳流分配与还原力（NADPH）的消耗，理论上应与细胞能量状态紧密耦合。然而，传统研究多依赖群体平均水平的生化测定，难以揭示单个细胞在聚合物合成过程中的能量动态变化。QUEEN是一种基因编码的比率荧光生物传感器，由绿色荧光蛋白与ATP合酶ε亚基（ATP结合结构域）融合而成，其双波长荧光强度比值可反映胞内ATP水平。本研究旨在利用QUEEN在大肠杆菌P(3HB)生产过程中原位监测单细胞ATP水平，探讨聚合物合成与能量代谢之间的潜在关联。
研究方法
菌株、质粒与培养条件
所有化学试剂均购自Junsei Chemical Co., Ltd.（东京，日本）或Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation（大阪，日本），除非另有说明。以大肠杆菌JM109(DE3)（Promega, Madison, WI, USA）作为宿主菌株。质粒pBBR1MCS2PRephaCARpct的构建方法为：用EcoRV消化pBBR1MCS2，通过PCR从pBSPRephaCARpctalkK(28)扩增PRephaCARpct片段，并使用In-Fusion Cloning Kit（Takara Bio Inc.，草津，日本）组装产物。PRe为Ralstonia eutropha（现命名为Cupriavidus necator）phb操纵子的启动子区域。构建的pBBR1MCS2PRephaCARpct质粒图谱如图S1所示。
Luria–Bertani（LB）培养基含10 g/L Bacto Tryptone、5 g/L Bacto Yeast Extract（均购自Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA）和10 g/L NaCl。M9基本培养基配制为：12.8 g/L Na2HPO4、3.0 g/L KH2PO4、1.0 g/L NH4Cl、0.5 g/L NaCl、0.1 mM CaCl2、2 mM MgSO4和0.001%盐酸硫胺素。培养基中补充20 g/L葡萄糖或4 g/L乙酸盐作为碳源。
转化pRSET-QUE2m（含T7启动子控制下的QUEEN基因，见参考文献18）和pBBR1MCS2PRephaCARpct的细胞在1.5 mL LB培养基中、30°C、180 rpm往复振荡条件下预培养12 h（试管培养）。随后以1%（v/v）接种量将主培养物接种至1.5 mL M9培养基（试管中），在30°C、180 rpm往复振荡的好氧条件下培养。除非另有说明，本研究所用菌株为携带pRSET-QUE2m和pBBR1MCS2PRephaCARpct的大肠杆菌JM109(DE3)。需要时，从培养开始即向培养基中添加0.04 mM IPTG、2.5 g/L（R/S）-3-羟基丁酸钠盐（3HB-Na）、100 μg/mL氨苄青霉素和50 μg/mL卡那霉素。
光密度测定
使用V-730分光光度计（JASCO Co.，东京，日本）测定光密度（OD）。以600 nm处吸光度评估大肠杆菌生长情况，M9培养基作为空白对照。每组设置三次生物学重复。
气相色谱分析
PHA产量使用Nexis GC-2030系统（Shimadzu Corp.，京都，日本）测定，该系统配备InertCap 1色谱柱（0.25 mm内径×30 m；df=0.25 μm；GL Sciences，东京，日本）和火焰离子化检测器。每个条件下收集12个1.5 mL试管的样品细胞。细胞通过离心收集（12,000×g，10 min，4°C），去除上清液。细胞沉淀用超纯水洗涤，在相同条件下再次离心收集，重悬于超纯水中并冷冻干燥。取约2 mg冻干细胞，加入0.5 mL氯仿和0.5 mL乙醇/硫酸混合物（体积比85:15），在100°C处理2 h。孵育期间每30 min涡旋振荡一次反应混合物。冷却至室温（约25°C）后，加入3 mL超纯水并剧烈振荡。收集下层氯仿层，通过硫酸钠除去残余水分。溶液进一步用分子筛干燥30 min。
高效液相色谱分析
培养上清液中的葡萄糖浓度使用高效液相色谱系统（HPLC；JASCO）分析，配备Aminex HPX-87H色谱柱（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）和示差折光检测器。脱气的7 mM H2SO4水溶液作为流动相，流速0.6 mL/min，柱温60°C。培养样品（1.5 mL）在13,000×g离心5 min。取100 μL上清液，用900 μL蒸馏水稀释（10倍稀释）。稀释样品经0.22 μm PES膜过滤器过滤后进样（5 μL）。葡萄糖浓度使用标准葡萄糖溶液制备的校准曲线定量。每组设置三次生物学重复。
Nile Blue染色
PHA积累细胞按先前描述的方法（参考文献1）用1% Nile Blue硫酸盐（Waldeck GmbH and Co. KG, Division Chroma, Münster, Germany）溶液染色。将一滴培养物置于载玻片上，用短暂火焰暴露热固定。固定细胞浸入1% Nile Blue硫酸盐溶液中，60°C孵育10 min，用水冲洗。随后用8%醋酸水溶液脱色1 min，用水复水，盖上盖玻片。盖玻片用指甲油密封以防干燥，固定后进行显微观察。
显微镜观察与图像分析
使用一体化荧光显微镜（BZ-X810, Keyence, 大阪, 日本）采集图像，配备Plan Apo VC 60×物镜（NA 1.40, Nikon, 东京, 日本）。荧光检测使用以下光学滤光片组（Keyence）：滤光片组1（激发：580/25，分色镜：600，发射：625/30）用于红色；组2（激发：405/20，分色镜：505LP，发射：535/50）用于短波长绿色；组3（激发：480/40，分色镜：505LP，发射：535/30）用于长波长绿色。所有观察的曝光时间为200 ms。
对于Nile Blue染色细胞的观察，取3 μL培养后的M9培养基中大肠杆菌细胞置于载玻片上，用Nile Blue染色（详见Nile Blue染色部分），使用滤光片组1可视化。对于单细胞QUEEN测量，将M9培养基中培养的大肠杆菌细胞用薄琼脂糖膜（12 g/L琼脂糖溶于M9培养基）固定在盖玻片上。取3 μL培养后的M9培养基中大肠杆菌细胞涂布于盖玻片上，然后覆盖琼脂糖膜。使用滤光片组2和组3对细胞进行可视化。
采集的图像使用Fiji-ImageJ软件（参考文献29）分析。使用滤光片组1（Nile Blue染色）可视化的图像用于计数PHA积累和非积累细胞。大肠杆菌中重组蛋白的异源表达经常导致蛋白质聚集和包涵体形成（参考文献30）。本研究中也观察到包涵体，且包涵体被Nile Blue染色，其荧光强度相对于细胞质区域升高。因此，区分PHA包涵体与蛋白质包涵体至关重要。
为建立区分标准，研究者检查了在不含3HB-Na补充的M9-葡萄糖培养基中培养24 h的细胞（非PHA产生条件）。这些细胞显示胞内区域荧光强度为细胞质的1.2–1.5倍，归因于蛋白质包涵体。相比之下，在含3HB-Na培养基（PHA产生条件）中培养24 h的大多数细胞显示出胞内结构荧光强度远高于非PHA产生菌株中的包涵体（为细胞质水平的2–5倍）。基于这一观察，细胞若含有一个或多个荧光强度至少为细胞质区域2倍的区域，则被归类为PHA积累细胞。
为计算荧光强度比，首先将采集的图像分离为三个颜色通道（蓝、绿、红），仅选择绿色通道进行后续分析。图像处理参照先前研究（参考文献18,19）的方法略作修改。使用半径为50像素的滚动球算法减去背景荧光。对荧光图像进行阈值化以勾勒细胞边界，强度值低于阈值的像素设为NaN（非数值）。该程序应用于两幅图像。
【数据】菌株：E. coli JM109(DE3)；质粒：pRSET-QUE2m + pBBR1MCS2PRephaCARpct；培养基：LB（预培养）、M9（主培养）；碳源：20 g/L葡萄糖或4 g/L乙酸盐；IPTG：0.04 mM；3HB-Na：2.5 g/L；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素 + 50 μg/mL卡那霉素；预培养：30°C、180 rpm、12 h；接种量：1%（v/v）；主培养：30°C、180 rpm；OD测定波长：600 nm；GC分析：12管合并、12,000×g离心10 min、4°C、氯仿/乙醇-硫酸（85:15）100°C处理2 h；HPLC：7 mM H2SO4、0.6 mL/min、柱温60°C、进样5 μL、10倍稀释；Nile Blue染色：1%染液、60°C孵育10 min、8%醋酸脱色1 min；显微镜：60×物镜（NA 1.40）、曝光200 ms；琼脂糖膜：12 g/L；图像分析：滚动球半径50像素
研究结果
QUEEN表达大肠杆菌中的P(3HB)生产
共表达P(3HB)生物合成基因（组成型启动子控制）和QUEEN基因（IPTG诱导型启动子控制）的重组大肠杆菌在四种不同条件下培养：有无3HB补充及有无IPTG诱导。培养基中含葡萄糖以促进P(3HB)合成。生长曲线（OD600）显示，细胞在约12 h的延滞期后进入指数生长期，持续生长至48 h，随后进入稳定期（图2）。在补充3HB的培养物中，P(3HB)在24 h开始合成，并持续增加至72 h（表1）。结果证实PHA生物合成基因功能表达，3HB添加成功触发聚合物合成。
在IPTG诱导条件下，12至40 h之间观察到强烈的QUEEN荧光（图S2）。然而，IPTG诱导对P(3HB)产量产生负面影响（表1），提示QUEEN过表达和/或相关代谢负担损害了细胞性能。在无IPTG条件下，QUEEN荧光强度较低，但在12至24 h之间仍足以进行定量荧光测量，这可能是由于泄漏表达所致。40 h后，荧光强度下降并低于检测限。这些结果表明，非IPTG条件和24 h取样时间最适合同时测量胞内P(3HB)积累和QUEEN荧光。在该时间点，细胞处于指数生长中期，P(3HB)合成活跃，代谢活性可能较高。此外，稳定的荧光表明大肠杆菌在该时间点保留了质粒，这是关键要求，因为培养过程中质粒丢失仍是一个潜在问题（参考文献32）。
胞内PHA包涵体的可视化
为确定聚合物是否在细胞间均匀积累，对胞内包涵体进行了检查。在无IPTG条件下培养的细胞在12 h和24 h收获，用Nile Blue染色（图3）。Nile Blue是一种亲脂性染料，可染色胞内PHA包涵体，使其在荧光显微镜下可被目视识别。
12 h时未检测到包涵体（图3A）。相比之下，24 h时，补充3HB培养的777个细胞中有609个显示胞内包涵体，其荧光强度高（为细胞质背景的3–5倍），通过显微镜图像目视估计（图3B）。在无3HB补充培养24 h的细胞中也检测到包涵体。然而，这些包涵体的荧光强度明显较弱（为细胞质背景的1.2–1.5倍）（图3C）。结合GC结果，具有高荧光强度的包涵体为P(3HB)。
使用QUEEN测量相对ATP水平
为检验QUEEN在本研究条件下是否响应胞内ATP水平，将携带pRSET-QUE2m和pBBR1MCS2PRephaCARpct的大肠杆菌在以葡萄糖或乙酸盐为唯一碳源的培养基中培养。先前研究报道，大肠杆菌在葡萄糖培养时的ATP水平高于乙酸盐培养，尽管该分析使用了不同方法（参考文献33）。图4A显示了荧光强度比直方图，代表单细胞中相对ATP水平。纵轴表示对应各比值的细胞比例。数据揭示了单个细胞间相对ATP水平的分布，表明存在细胞间异质性。葡萄糖培养的细胞表现出高于乙酸盐培养细胞的相对ATP水平，与先前研究一致（参考文献33）。这些结果证实QUEEN可用于评估大肠杆菌单细胞水平的相对胞内ATP水平，支持了该荧光方法的可靠性。
P(3HB)产生细胞中的相对ATP水平
为研究P(3HB)合成与胞内ATP水平的关系，将携带pRSET-QUE2m（QUEEN）和pBBR1MCS2PRephaCARpct（PHA生物合成基因）的大肠杆菌JM109(DE3)在有无3HB补充的条件下培养。24 h时测量荧光强度，基于荧光强度比估算相对ATP水平。图4B显示了单个细胞中相对ATP水平的直方图，纵轴表示各相对ATP水平下的细胞比例。
P(3HB)产生（含3HB）和非产生（不含3HB）条件之间观察到可比较的分布，表明P(3HB)积累未显著影响胞内ATP水平。进行等价性检验以比较P(3HB)产生（n=1029个细胞）和非产生（n=910个细胞）条件下的相对ATP水平。荧光比中位数差异的99%置信区间为−0.019至0.022，完全落在±0.05的等价范围内（图S3），证明统计等价性。鉴于777个细胞中有609个在24 h时已积累P(3HB)，这些发现暗示P(3HB)的合成与积累在群体水平上未显著扰乱大肠杆菌的整体能量状态。
此外，使用HPLC分析了0至24 h培养培养基中的葡萄糖浓度（图S4）。在P(3HB)产生和非产生条件下，葡萄糖浓度均略有下降。这种极少的葡萄糖消耗表明碳源和能量源的代谢需求较低，可能是由于外源提供了3HB作为单体前体。3HB转化为3HB-CoA可能仅需有限的细胞资源，这或许解释了为何ATP水平不受P(3HB)合成的影响。
【数据】P(3HB)合成时间：24 h起，持续至72 h；IPTG诱导：12–40 h强荧光、抑制P(3HB)产量；无IPTG：12–24 h可定量荧光；24 h时777个细胞中609个含P(3HB)包涵体（3–5倍于细胞质背景）；无3HB组包涵体荧光：1.2–1.5倍；葡萄糖组ATP水平高于乙酸盐组；P(3HB)产生组n=1029细胞、非产生组n=910细胞；99% CI：−0.019至0.022；等价界限：±0.05
讨论与解读
本研究利用比率荧光生物传感器QUEEN在单细胞水平上评估了P(3HB)产生大肠杆菌的胞内ATP水平，比较了聚合物合成与非合成条件下的能量状态。为确保可靠解读，实验设计尽量减少对代谢状态的扰动并降低变量数量。具体而言，省略IPTG诱导以避免高水平QUEEN表达带来的代谢负担——该负担已被发现会干扰P(3HB)生物合成（表1）。值得注意的是，IPTG诱导导致OD升高（图2），这可能是包涵体形成引起的光散射所致，而非细胞数量增加。这一观察进一步支持了避免IPTG诱导以防止结果解读混淆的决策。
此外，P(3HB)生物合成酶的过表达可能改变细胞的代谢或能量平衡。为防止这种情况，通过向培养基中外源补充3HB触发P(3HB)产生，而非诱导酶表达。该策略允许在不显著干扰细胞能量代谢的情况下实现聚合物合成，P(3HB)产生与非产生细胞之间可比较的相对ATP水平印证了这一点。尽管最初预期P(3HB)合成与积累会降低ATP水平——考虑到乙酰辅酶A和NADPH的消耗——但实际观察到的能量稳态表明大肠杆菌在PHA生产过程中具有稳健的能量代谢稳态功能。
编译者解读
本研究的方法学亮点在于将代谢物生物传感器与产物合成路径共表达于同一宿主，实现了"边生产边监测"的原位测量策略。选择外源3HB前体补充而非IPTG过表达诱导的策略，巧妙规避了蛋白过表达对能量代谢的混杂干扰——这是合成生物学研究中常被忽视的实验设计陷阱。单细胞水平上的等价性检验（n>900细胞）为"PHA合成不扰动能量稳态"提供了统计支撑。然而，该结论的普适性受限于摇瓶条件下的低碳需求环境；在氮限制或高密度发酵等工业化条件下，能量代谢是否仍保持稳态尚需验证。QUEEN系统作为PHA生产过程的代谢监测工具，有望在菌株筛选与发酵优化中发挥实时指导作用。
参考来源
Fujii W, et al. Single-cell ATP monitoring in Escherichia coli engineered for polyhydroxybutyrate production using the fluorescent biosensor QUEEN. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2026. DOI: 10.1016/j.jbiosc.2025.12.004
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2025.12.004