来源：Systematic optimization of TF-based carboxylic acid biosensors in cell-free system（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
代谢物快速精准检测是生物制造过程优化的关键环节。本研究以衣康酸（ITA）响应性生物传感器为模型，系统建立了适用于无细胞系统（CFS）的转录因子（TF）生物传感器理性工程框架。通过集成调控TF供给策略与启动子序列再设计，研究团队实现了最大信号19倍提升、检测限3.3倍降低（达0.003 g/L ITA），并将相同策略成功拓展至3-羟基丙酸响应系统，展示了方法的普适性。
研究背景
微生物细胞工厂正成为化学品可持续生产的重要平台，衣康酸（ITA）和3-羟基丙酸（3HP）等羧酸是其中具有工业价值的代表性产品。然而，传统色谱定量方法耗时费力，难以满足设计-构建-测试-学习（DBTL）循环中大量迭代所需的高通量筛选（HTS）要求。基于转录因子（TF）的生物传感器可将特定代谢物浓度转化为易测量的信号，为突破这一瓶颈提供了有力工具。在这类传感器中，配体结合改变TF与TF响应启动子间的互作，从而调控下游基因表达。对于激活型生物传感器，配体结合诱导TF-DNA复合物构象重排，改变DNA弯曲，并稳定与RNA聚合酶的有效互作，进而激活转录。
无细胞系统凭借其快速和适合自动化的特点，是开发生物传感器的理想平台。然而，TF生物传感器在体外环境中面临严重瓶颈——由于缺乏类核苷酸相关蛋白（NAPs）以及DNA拓扑结构与体内条件不同，传感器性能常大打折扣。本研究针对上述问题，以LysR型转录调控因子ItcR调控的ITA响应生物传感器为模型，提出了一个系统化的理性工程框架。
研究方法
2.1 质粒构建与DNA制备
所有质粒均使用New England Biolabs（美国马萨诸塞州伊普斯威奇）的NEBuilder® HiFi DNA Assembly试剂盒构建，并在Thermo Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的克隆宿主大肠杆菌Mach1-T1®中扩增。用于质粒构建和模板DNA制备的所有寡核苷酸均由Cosmo Genetech（韩国首尔）合成（表S1）。质粒DNA和PCR产物分别使用Geneall（韩国首尔）的Exprep™ Plasmid SV试剂盒和Expin™ PCR SV试剂盒提取和纯化。本研究使用的所有质粒和菌株详细清单见表S2。
2.2 无细胞系统
所有无细胞系统反应均在Corning（美国纽约）的黑色384孔板中进行，反应体积10 μL，30°C孵育12小时。反应混合物由两种溶液组分构成：SolA含1.5 mM ATP和GTP、0.9 mM CTP和UTP、0.26 mM CoA、0.33 mM NAD、0.75 mM cAMP、0.2 mg/mL tRNA、68 μg/mL亚叶酸、1 mM亚精胺、2% PEG-8000、50 mM HEPES；SolB含33 mM磷酸烯醇丙酮酸、1.2 mM亮氨酸、除亮氨酸外的19种氨基酸各1.0 mM、20–80 mM谷氨酸钾、4–14 mM谷氨酸镁、10 mM谷氨酸铵、模板DNA和细胞提取物。
细胞提取物制备自大肠杆菌BL21(DE3) ΔendA菌株，以保持线性DNA模板的稳定性。endA的缺失可降低非特异性核酸酶活性，这类酶在CFS反应中可能降解PCR来源或合成来源的DNA。细胞提取物采用Jewett课题组的改良方案制备，详见补充信息。ITA和3HP筛选系统通过向标准反应中分别补充1 g/L ITA或3HP构建。除非另有说明，所有试剂均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。试剂（SolA、DNA、ITA和3HP）使用Revvity（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的FlexDrop Plus非接触式分液器分配。由于SolB和细胞提取物粘度高且盐浓度大，无法通过该仪器均匀分配，因此不采用分液器处理。
2.3 生物传感器剂量-响应表征
为生成剂量-响应曲线，反应混合物中补充各自的目标分子。对于ITA生物传感器，ITA滴定终浓度分别为0、0.001、0.003、0.005、0.007、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 g/L。对于3HP生物传感器，3HP添加终浓度分别为0、0.01、0.03、0.07、0.1、0.3、0.7和1.0 g/L。剂量-响应曲线示意图使用BioRender.com绘制。
2.4 荧光测量
BFP、sfGFP和mCherry的荧光使用Hidex Sense微板阅读器（HIDEX，芬兰图尔库）测量。BFP、sfGFP和mCherry的激发/发射波长分别为390/460、485/535和560/610 nm。所有实验均进行三次重复。数据以三次独立重复的平均值±标准差表示（n = 3）。统计学显著性采用双尾非配对t检验确定，显著性标记如下：ns，不显著；∗，p < 0.05；∗∗，p < 0.01；∗∗∗，p < 0.005。
【数据】反应体积：10 μL；孵育温度：30°C；孵育时间：12h；SolA组分：ATP/GTP 1.5 mM，CTP/UTP 0.9 mM，CoA 0.26 mM，NAD 0.33 mM，cAMP 0.75 mM，tRNA 0.2 mg/mL，亚叶酸 68 μg/mL，亚精胺 1 mM，PEG-8000 2%，HEPES 50 mM；SolB组分：磷酸烯醇丙酮酸 33 mM，亮氨酸 1.2 mM，其余19种氨基酸各1.0 mM，K-谷氨酸 20–80 mM，Mg-谷氨酸 4–14 mM，NH4-谷氨酸 10 mM；ITA/3HP添加量：1 g/L；ITA滴定范围：0–1.0 g/L；3HP滴定范围：0–1.0 g/L；荧光波长：BFP 390/460 nm，sfGFP 485/535 nm，mCherry 560/610 nm；重复数：n = 3
研究结果
3.1 转录因子表达优化以增强动态范围
本研究基于系统化方法优化CFS中的TF生物传感器，将TF可用性的理性控制与启动子工程相结合。TF表达被首先选为增强生物传感器灵敏度、动态范围和信噪比的关键因素。许多研究主要聚焦于通过调整CFS中TF DNA浓度来调节TF活性。除该途径外，本研究还采用了多种策略来调节CFS中ItcR的体外可用性。ItcR通过以下三种方式供给：（i）从模板DNA表达itcR（图1a），（ii）添加纯化的ItcR蛋白（图1b），（iii）利用预表达ItcR的细胞提取物（图1c）。
在这些实验中，mCherry作为报告基因，受ItcR响应启动子（P_ccl）控制，而无报告基因DNA的反应作为阴性对照（NC）。报告基因DNA浓度固定为100 nM，以确保观察到的荧光变化仅由TF活性变化引起。同时，所有实验均使用系统优化的CFS进行，有效条件基于反应时间、报告基因和组成等关键参数确定（图S1和S2）。其中，12小时反应时间、mCherry报告基因以及8 mM Mg-谷氨酸和20 mM K-谷氨酸的离子浓度被确定为最优条件。
首先，为评估从模板DNA表达itcR的策略，其浓度从10 nM变化至100 nM。在最高浓度下，与NC相比，荧光强度仅增加了3.90倍（图1a）。响应不足可能源于CFS中同时表达的TF与报告基因对有限表达资源（如RNAP、核糖体、核苷酸、氨基酸和ATP）的竞争。
其次，采用纯化ItcR蛋白的方法来控制其浓度（图1b）。该策略的额外动机是预期直接高浓度供给ItcR可减少CFS中的资源竞争。纯化的ItcR在CFS中连续稀释至终浓度0.05–1.0 mg/mL，稀释倍数最高达1/20。尽管输入浓度相差20倍，中间浓度之间仅观察到极小的荧光递增。虽然较高ItcR水平下荧光有所增加，但即使1.0 mg/mL也仅较NC增加3.61倍。此前研究表明，纯化过程中残留的咪唑可降低CFPS活性，残留咪唑的负面影响加上折叠相关的活性损失，似乎超过了减少资源竞争带来的益处，导致响应性降低。
第三，使用预表达ItcR的细胞提取物（图1c）。为优化粗提物中的ItcR含量，使用不同拷贝数和启动子强度的质粒生成了五个变体。实验设计中纳入两个关键变量：启动子强度和质粒拷贝数。启动子强度使用四个组成型启动子（合成PHCE、PJ23119、PJ23100和PJ23105）调节。质粒拷贝数通过两种复制起点变化：中拷贝CloDF13起点（BCI菌株）和高拷贝pMB1起点（BMI菌株）。
BCI菌株间的荧光随启动子强度增加而升高。特别是BCI3较NC增加了8.84倍。重要的是，将质粒拷贝数从中拷贝（20–40拷贝）提升至高拷贝（500–700拷贝）并未增加荧光输出，尽管预期ItcR表达会大幅上升。这种缺乏进一步改善的现象表明，在优化的BCI提取物中ItcR已达到饱和供给水平。另一方面，BMI菌株的荧光值比BCI菌株低约5.00倍。这可能是因为细胞提取物中残留的大量质粒拷贝在CFS中继续表达itcR及质粒携带的抗生素抗性基因，消耗了转录和翻译资源。因此，在细胞提取物中预表达TF可高效供给调节蛋白，从而最大程度减少资源竞争和质粒相关负担。
该配置在所有ItcR供给策略中提供了最高的动态范围，因此被用于后续所有实验。为进一步在这些优化条件下提高信号质量，变化报告基因DNA浓度以确定最大化信噪比（on/off比）的条件。50 nM浓度产生最高的on/off比14.69，较100 nM时获得的比值提升近4倍（图S3a）。翻译输出还通过5‘非翻译区（5’ UTR）变体进行调节。其中，经UTR Library Designer预测强度为2.65 × 10⁶任意单位（a.u.）的变体产生了最高的倍数变化（图S3b）。基于上述序贯优化，最终报告基因构建体——结合50 nM模板DNA与强度为2.65 × 10⁶ a.u.的5‘ UTR——被用于后续所有实验。
【数据】ItcR表达策略i：模板DNA浓度 10–100 nM，最高浓度下荧光增加 3.90倍；策略ii：纯化ItcR浓度 0.05–1.0 mg/mL，最高浓度下荧光增加 3.61倍；策略iii：BCI3较NC增加 8.84倍；BMI荧光较BCI低约 5.00倍；最优报告DNA浓度：50 nM，on/off比 14.69，较100 nM提升近4倍；最优5’ UTR预测强度：2.65 × 10⁶ a.u.；Mg-谷氨酸：8 mM；K-谷氨酸：20 mM；反应时间：12h
3.2 核心启动子区域鉴定以增强生物传感器性能
为进一步提升生物传感器性能，对P_ccl进行了工程改造。启动子特征包括核心基序组成（−35/−10区域）、操纵子排列和序列背景。这些特征被定义为激活阈值、动态范围和信噪比的决定因素。有效工程改造P_ccl需要鉴定其核心调控区域——此前尚未有精确定义。为此，以LTTRs的已充分表征机制作为参考——该类调控子中，启动子活性受调控子在调控位点（RS）和激活位点（AS1和AS2）占据情况的控制。这些位点因此被指定为靶向启动子优化的关键元件（图2a）。
由于P_ccl的精确边界尚未严格定义，启动子相对预测的−35区域向上游延伸80 bp。该设计基于LysR型启动子的结构特征——RS通常位于AS上游。先前研究进一步表明，80 bp上游片段通常足以涵盖RS。为界定ITA响应所需的元件，从该延伸构建体生成了一系列10 bp截短变体（图2b）。在存在和不存在ITA的条件下评估启动子活性，以鉴定ITA响应必需的区域（图2c）。
启动子截短分析显示，保留F4区域的构建体（P3和P4）保持了ITA响应性，而排除F4的进一步截短（P5至P7）完全消除了活性。在功能性变体中，P4表现出最强的诱导倍数（4.28倍），其次是P3（3.94倍）。这些结果表明，F4序列可能包含P_ccl在CFS中转录激活所需的ItcR主要结合位点。与此同时，P1和P2启动子表现出明显的泄漏表达——即使在无ITA条件下也显示强报告活性。这种调控控制的丧失可能反映……
【数据】P_ccl上游延伸：80 bp；截短步长：10 bp；P4诱导倍数：4.28倍；P3诱导倍数：3.94倍；P5–P7：活性完全丧失；ITA添加量：1 g/L
（注：原文节选在3.2节中途截断，后续内容在原文中继续，但提供的节选文本到此为止。3.3节及后续结果内容未包含在提供的原文节选中。）
讨论与解读
本研究证明，通过协调调控TF可用性和启动子结构，可以系统性地优化适用于CFS的TF羧酸生物传感器。分析揭示，在体内功能正常的启动子序列在体外可能因DNA拓扑结构差异和缺乏NAPs而丧失调控精度，凸显了拓扑感知启动子设计的重要性。通过移除拓扑敏感的上游区域和对核心基序（−35和−10）进行理性优化，ITA响应生物传感器实现了最大信号强度19倍提升、检测限3.3倍降低（至0.003 g/L ITA），并伴随剂量-响应曲线显著变陡。相同的启动子工程原理成功应用于另一个响应3HP的LysR型系统，证明了其在不同LTTR调控传感器间的普适性。此外，基于PCR来源线性DNA的CFS无克隆特性简化了迭代测试流程，使设计变体无需克隆步骤即可快速评估。将液体处理自动化与这些高性能CFS生物传感器结合，可实现大规模变体文库的自动化可扩展筛选，加速代谢工程的DBTL循环。未来工作中，该平台还可与AI引导的序列级设计整合，以支持更高效的文库探索。
编译者解读
该研究的核心价值在于提出了“拓扑感知”的启动子设计理念——体内功能正常的启动子序列在无细胞环境中可能因DNA拓扑差异而失效，这一认识对无细胞生物传感器开发具有普遍指导意义。方法上，三种TF供给策略的系统比较（模板表达、纯化蛋白添加、预表达提取物）为后续研究者提供了清晰的技术选择依据。值得注意的是，预表达策略中高拷贝质粒反而性能下降的现象，提示无细胞系统中“表达资源竞争”是常被低估的制约因素。检测限降至0.003 g/L且Hill斜率从2.7升至34.7，意味着传感器从“渐变响应”变为“近开关式响应”——这对高通量筛选中的阈值判定极为有利。局限在于，本研究仍以两类LTTR系统为验证对象，该方法向其他TF家族的拓展性有待进一步验证。总体而言，该框架为合成生物学中“传感器-执行器”耦合设计提供了可复制的工程范式。
DOI: 10.1016/j.bios.2026.118371